MicroRNAs在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的相關研究進展

黎曉冬，武海燕，何潤西，謝學軍，徐銘超

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病眼部的主要慢性致盲并發(fā)癥，當前已成為我國重要的公共衛(wèi)生安全問題。隨著研究的深入，DR不僅是單純的進展性微血管病變，而且是一種視網(wǎng)膜神經(jīng)血管單元(神經(jīng)元、膠質細胞、血管內皮細胞及周細胞等)受損的多組織病變，以視網(wǎng)膜血管通透性增加、新生血管生成和神經(jīng)退行性改變?yōu)橹饕卣?，目前臨床應用治療DR的靶點主要是血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，對視網(wǎng)膜微血管內皮細胞和周細胞信號轉導以及炎性細胞因子等新療法也在探索中[1]。臨床常用的視網(wǎng)膜激光光凝及抗VEGF等治療方式都有一定的局限性，且復發(fā)率高，因此從基因水平深入探究發(fā)病機制有利于進一步提高DR的防治水平。MicroRNAs(miRNAs)調控著人類大部分基因，參與人體各種疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來基于miRNAs靶基因和信號通路的研究表明miRNAs在DR發(fā)病機制中發(fā)揮著關鍵的調控功能[2]，故本文將對miRNAs及其參與DR的發(fā)病機制和治療前景等相關研究予以綜述。

1 miRNAs概述

miRNAs是一類由22～25個核苷酸組成的小分子單鏈非編碼RNA，第一個miRNA是1993年在秀麗隱桿線蟲中被首次發(fā)現(xiàn)的，是由lin-4基因產(chǎn)生的一種短RNA，其在轉錄后抑制lin-14 mRNA[3]，即miRNAs通常在轉錄后調節(jié)基因表達，可下調或抑制靶向轉錄本的蛋白質水平。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNAs并非線蟲獨有，它廣泛存在于不同的動植物中[4]；在miRNAs儲存數(shù)據(jù)庫miRBase中列出了人類含有的1917個前體miRNAs(pre-miRNAs)和2654個成熟miRNAs[5]，超過60%的人類蛋白質編碼基因含有預測的miRNAs靶點[6]，一個miRNA可以調節(jié)一個甚至幾百個基因，而多個miRNAs也可以只調節(jié)一個基因。多項動物研究證實生成miRNAs的兩種關鍵酶Dicer1、Drosha以及DiGeorge綜合征關鍵區(qū)基因8(DiGeorge syndrome key region gene 8，DGCR8)的缺失導致動物模型表現(xiàn)出胚胎致死性，這表明miRNAs在哺乳動物發(fā)育、細胞分化和動態(tài)平衡中極其重要[7-8]。

1.1miRNAs的產(chǎn)生和作用機制miRNAs的產(chǎn)生是一個復雜的多步驟過程，主要通過RNA聚合酶Ⅱ、轉錄因子和RNA結合蛋白在細胞核中轉錄成發(fā)夾樣的原始miRNAs(pri-miRNAs)，隨后由DGCR8和內切酶Drosha組成的復合體特異性切割pri-miRNAs，得到約70個核苷酸組成的pre-miRNAs，同時輸出蛋白5又將pre-miRNAs從細胞核轉運到細胞質中進一步加工，由發(fā)夾酶Disher切割pre-miRNAs末端發(fā)夾結構樣環(huán)后產(chǎn)生兩條miRNA雙鏈；RNA誘導沉默復合物與miRNAs雙鏈中的一條形成miRNAs誘導的沉默復合物(miRNA-induced silencing complex，miRISC)，另外一條miRNAs鏈則被舍棄；miRISC中的關鍵蛋白阿爾古2蛋白(argonaute 2 protein，AGO2)攜帶成熟的miRNAs識別位于靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)的互補序列，并促進mRNA的翻譯抑制或降解[9-10]。

1.2miRNAs的功能miRNAs調控基因表達的功能決定細胞發(fā)育、增殖分化、死亡以及糖脂代謝等重要進程，具有廣泛性和多樣性。最初學者們認為miRNAs只在產(chǎn)生miRNAs的細胞中調節(jié)其靶mRNA的表達。然而，最新研究發(fā)現(xiàn)miRNAs也可以從細胞分泌到循環(huán)系統(tǒng)影響全身各個靶器官[11]，那么血清或體液中miRNAs則有望成為早期診斷各種代謝性疾病的生物標記物和潛在治療靶點，如肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化等[12]。另有研究表明分泌的miRNAs，尤其是細胞外囊泡中分泌的miRNAs，如外泌體，可以介導不同組織之間的旁分泌和內分泌信號傳導，從而調節(jié)基因表達和遠端細胞功能[13]。

2 miRNAs與視網(wǎng)膜疾病的相關研究

miRNAs在視網(wǎng)膜正常發(fā)育、結構及功能中起著重要作用[14]。Karali等[15]利用高通量測序技術分析人類視網(wǎng)膜中miRNAs表達，研究數(shù)據(jù)顯示幾乎1/5已知人類miRNAs在神經(jīng)視網(wǎng)膜中表達，如miR-182-5p、miR-183-5p、miR-96-5p、miR-124-3p、miR-9-5p。在視網(wǎng)膜表達的miRNAs中，90%以上存在同分異構體，已有研究證明，人類miR-204種子區(qū)修飾的異構體雜合突變是導致視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良和雙眼缺損的常染色體顯性遺傳病的原因[16]。這些在視網(wǎng)膜中特異性高表達的miRNAs不僅在維系視網(wǎng)膜功能方面具有重要的作用，且與視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展以及預后轉歸也有密切聯(lián)系。

3 miRNAs與DR的相關研究

目前研究較多的與氧化應激、炎癥及VEGF等相關且在DR發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用的miRNAs見表1。

表1 DR相關的miRNAs

3.1miRNAs與氧化應激和炎癥氧化應激和炎癥反應是參與DR的關鍵發(fā)病機制，高血糖誘導的晚期糖基化終末產(chǎn)物/受體、多元醇途徑、蛋白激酶C激活和氨基己糖途徑的增加，產(chǎn)生氧化應激、活性氧(ROS)積聚及細胞凋亡，促進促炎介質和趨化因子產(chǎn)生，誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性改變，并導致血-視網(wǎng)膜屏障破壞、血管通透性增加及新生血管生成，加重DR神經(jīng)血管功能障礙[17]。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-455-5p通過下調細胞因子信號轉導抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)的表達減少高糖誘導的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞內ROS、丙二醛以及NADPH氧化酶的含量，并抑制炎性因子白介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)釋放；此外，增強miR-455-5p的表達能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，降低Bcl-2凋亡蛋白的表達，表明miR-455-5p是通過靶向SOCS3抑制細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應，從而減輕RPE細胞的損傷，因此miR-455-5p可能成為治療DR新的靶點。近期研究顯示，miR-144-3p的過表達能通過下調核因子紅系相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)及其抗氧化靶基因的表達加劇RPE細胞的氧化應激反應，而miR-144-3p抑制劑可保護動物模型RPE的完整性和功能，增強抗氧化基因的表達，減輕氧化應激，故miR-144-3p也具有延緩DR病程進展的作用[19]。

去乙?；?(sirtuin 1，SIRT1)是miRNA-195的靶基因，具有抑制氧化應激和炎癥反應的作用，Mortuza等[20]發(fā)現(xiàn)高糖誘導的人視網(wǎng)膜微血管內皮細胞(human retinal endothelial cells，HRECs)中的miRNA-195與SIRT1表達呈負相關，抑制miRNA-195可以上調SIRT1的表達，從而促進抗氧化和抗炎作用，抑制HRECs凋亡，緩解DR微血管損傷。

3.2miRNAs與VEGF 高血糖導致缺氧引起血管內皮細胞功能異常和VEGF表達增加，VEGF誘導血管通透性增加以及新生血管生成是DR微血管病變的重要代償反應[21]。同時，VEGF的表達水平也能反映早期DR的病情進展。

近年來已有研究證明miRNAs通過靶向3’UTR控制VEGF的表達影響DR發(fā)病，如增強miR-152的表達則直接作用于腎素受體3’UTR，下調腎素受體表達水平并調節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)，降低高糖條件下HRECs中VEGF、血管內皮生長因子受體-2(VRGFR-2)和轉化生長因子β1的表達[22]，改善DR微血管病變。Yang等[23]利用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)VEGF作為miR-15b的靶基因，miR-15b能下調VEGF的表達，RNA測序技術等發(fā)現(xiàn)增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者的血液中循環(huán)miR-15b與VEGF直接相關，體外實驗用miR-15b模擬物轉染HRECs進一步證實miR-15b通過直接靶向VEGF的3’UTR區(qū)域調控VEGF轉錄，相反，在培養(yǎng)中過表達miR-15b可抑制VEGF的轉錄和蛋白表達，且呈劑量依賴關系；隨后發(fā)現(xiàn)通過在糖尿病Goto-Kakizaki(GK)大鼠玻璃體內注射miR-15b又可以改善DR的病理指標，如微血管密度、血管迂曲、微動脈瘤、毛細血管無灌注和熒光素滲漏等。促血管生成因子VEGF-A通過促進內皮細胞的存活、遷移和增殖增強血管通透性[24]，與DR發(fā)病機制密切相關。與正常人相比，DR患者miR-200b表達降低，VEGF-A表達增加，且miR-200b可能通過下調靶基因VEGF-A mRNA的表達[25]延緩DR發(fā)生，因此miR-200b可能是治療DR的一種有前景的靶點。

缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是促進缺氧適應的轉錄因子，參與視網(wǎng)膜組織新陳代謝、應激和對低氧條件的適應，在多種缺血性和炎癥性視網(wǎng)膜疾病中發(fā)揮關鍵作用，尤其是在DR中HIF會增加VEGF和其他缺氧調節(jié)基因產(chǎn)物的表達；VEGF的高表達會導致血管通透性增加、新生血管形成，并且會促進視網(wǎng)膜血管的閉合，從而形成無灌注區(qū)加劇缺血缺氧并產(chǎn)生惡性循環(huán)[26-27]。既往研究顯示，在缺氧誘導的血管內皮細胞中miR-424表達增加并調節(jié)HIF-1α促進病理血管生成[28]。色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor，PEDF)與VEGF的動態(tài)平衡對于DR病理血管生成十分關鍵，Wu等[29]研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p直接抑制HIF mRNA轉錄從而減少VEGF表達，VEGF成為miR-199a-3p潛在靶點，PEDF是miR-363的潛在靶點，且miR-363在DR中表達增加，而miR-199a-3p表達下調，這表明miR-199a-3p和miR-363可能分別在DR發(fā)生發(fā)展過程中調節(jié)VEGF和PEDF的表達。近期研究發(fā)現(xiàn)，在DR患者的微血管內皮細胞中miR-150-5p降低和miR-21-3p、miR-30b-5p、HIF-1α升高可能共同導致異常血管生成，具體機制還需要進一步研究[30]。

3.3其它己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)是葡萄糖代謝的關鍵因子，既往研究報道肝癌中上調的HK2可以促進內皮細胞血管生成，也是miR-384-3p的靶基因[31]，血小板-內皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)可以促進內皮細胞遷移和血管生成[32]。近期研究發(fā)現(xiàn)DR小鼠中HK2、PECAM-1呈高水平表達，miR-384-3p是低表達狀態(tài)，研究數(shù)據(jù)進一步證實miR-384-3p過表達通過下調HK2的表達抑制DR小鼠視網(wǎng)膜新生血管生成，體外實驗證實miR-384-3p模擬物可降低HK2的表達，達到減少細胞增殖和視網(wǎng)膜微血管內皮細胞管狀形成的目的[33]。

酸性鞘磷脂酶(ASM)是一種將鞘磷脂轉化為促炎和促凋亡的神經(jīng)酰胺酶，與其他視網(wǎng)膜細胞相比，糖尿病患者視網(wǎng)膜內皮細胞中ASM的激活程度最高，內皮細胞是ASM的主要來源[34]。Wang等[35]對DR患者HRECs中差異表達的miRNAs進行陣列整理分析后確定miR-15a可能是一種同時抑制ASM和VEGF-A激活的miRNA，體外研究表明miR-15a通過直接靶向ASM mRNA的3’UTR負向調節(jié)ASM的表達，且此研究中DR小鼠miR-15a的表達降低直接導致視網(wǎng)膜內ASM活化、VEGF-A及促炎因子的產(chǎn)生，導致視網(wǎng)膜內皮細胞通透性增加、細胞凋亡及血管生成。因此，miR-15a是針對DR抗炎和抗血管生成的雙重靶點。

骨橋蛋白介導HRECs細胞外基質中Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)合成異常，從而導致基底膜增厚是早期DR最顯著的特征，近期研究報道m(xù)iR-29a是一種顯著的針對和直接下調Col Ⅳ表達的miRNA，表明骨橋蛋白可能是通過抑制miR-29a途徑上調HRECs中Col Ⅳ的表達參與DR發(fā)病機制[36]。

4 DR相關的循環(huán)miRNAs生物標記物

當細胞中miRNAs被動或通過微囊泡主動釋放到血液或體液循環(huán)中，約有2wk的時間保持活性，它們在血漿、血清及尿液中凍融時的穩(wěn)定性、高效回收和定量檢測的有效性是成為生物標志物的可靠條件，也是一種潛在的生理和病理過程介體[37]。Zampetaki等[38]對300份1型糖尿病患者血清中的29個miRNAs進行定量對照，數(shù)據(jù)顯示miR-27b和miR-320a顯著且獨立地與高DR風險相關，并通過對內皮細胞蛋白質組學分析證明miR-27b和miR-320a均以抗血管生成蛋白——血栓反應蛋白-1(TSP-1)為共同靶標調節(jié)血管生成，因此miR-320a和miR-27b可以成為診治DR的潛在生物標志物。另一項關于1型糖尿病患者血清樣本的大型前瞻性研究顯示miR-126水平與糖尿病血管并發(fā)癥尤其是PDR密切相關[39]。Ji等[40]通過驗證分析DR患者血清中miRNAs發(fā)現(xiàn)，miR-3197和miR-2116-5p均有望成為診斷DR的生物標志物，但它們在DR發(fā)病中的分子機制仍不清楚。DR患者血漿中miRNAs的表達差異也很明顯，近期臨床研究表明miR-320a[41]、miR-328-3p[42]、miR-29c-3p[43]、miR-29和miR-200b[44]等均可作為DR 的新型生物標志物。因此，研究DR相關的循環(huán)miRNAs生物標志物可有助于指導臨床表型的分類、診療隨訪方案的確立以及預后評價。

5小結與展望

DR作為一種可防性致盲性眼病，其關鍵在于早期預防，早發(fā)現(xiàn)、早診治，因此，深入系統(tǒng)地研究DR發(fā)生的病理生理機制及其生物標志物是十分有必要的。miRNAs是一類新型的基因表達調控因子，它們不僅在DR的病因和病理中的作用已逐步被證明，并且與多種眼科疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸密切相關[45]。miRNAs通過調控以VEGF為代表的各種關鍵因子進而調節(jié)DR發(fā)生發(fā)展過程中不同的病理變化，包括細胞增殖、凋亡、炎癥反應、微循環(huán)損傷、氧化應激等，但miRNAs調控DR的確切分子機制及參與的關鍵信號通路等非常復雜，仍需要深入研究。因此，miRNAs拮抗劑或類似物作為一類新的藥物可能有助于阻止或減緩DR病變的發(fā)生和發(fā)展。目前研究表明miRNAs具備易于檢測、可預測DR進展病理機制及提供高效治療干預手段等特點，是一種理想的有前景的生物標志物，但是其無法預測DR病情嚴重程度，也不能區(qū)分DR的分期階段，目前針對DR患者的特異性與敏感性高的miRNAs改變還需要大量的臨床病例研究，才能提高其臨床應用價值，成為早期干預DR的有力依據(jù)與治療方法，并且基于miRNAs配合抗炎、抗氧化等個性化聯(lián)合治療將有助于提高DR患者視覺質量和生活質量。