miR-223-3p靶向調(diào)控Rbpj轉(zhuǎn)錄因子對葡萄膜炎大鼠Th1和Th17細胞分化的影響

周夢賢，屈如意，殷學(xué)偉，郭勵劼，邱 巖，郭大東

0引言

葡萄膜炎是一種累及到虹膜、睫狀肌和脈絡(luò)膜的臨床常見眼內(nèi)炎癥，嚴(yán)重威脅視力，高達35%患者可能會導(dǎo)致視力受損[1]。既往研究表明，自身免疫性葡萄膜炎的主要致炎細胞群有Th1和Th17細胞，兩者的細胞比例與葡萄膜炎病程發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。IFN-γ、IL-17分別是Th1、Th17標(biāo)志性細胞因子，在實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis, EAU)中發(fā)揮了重要的致炎作用[4]。Notch信號可通過調(diào)控細胞分化和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)來維持機體的免疫平衡，并通過誘導(dǎo)初始CD4+T細胞分化為Th1、Th17，從而影響Th細胞之間的比例平衡，進而在葡萄膜炎的病理進程中發(fā)揮作用[5]。MicroRNA(miRNA)是一組為18～24個核苷酸長度的非編碼RNA分子,主要通過與靶基因的3’UTR結(jié)合，以完全或不完全配對的形式降解靶基因的mRNA，或者通過抑制靶基因的翻譯，進而調(diào)控細胞凋亡、增殖及分化等生理活動[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子FOXO3的表達促進EAU小鼠中樹突狀細胞驅(qū)動的Th17細胞反應(yīng)[9]。此外，EAU大鼠虹膜、睫狀體和外周血淋巴細胞中均發(fā)現(xiàn)與NF-κB信號通路相關(guān)的miR-223-3p呈下調(diào)表達[10-12]，提示miR-223-3p與葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，miR-223-3p有可能成為治療葡萄膜炎新的作用靶點。Rbpj作為Notch信號通路中一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在Notch信號通路的活化中發(fā)揮重要作用。生物信息學(xué)預(yù)測分析表明，Notch信號通路轉(zhuǎn)錄因子Rbpj可能為miR-223-3p調(diào)控的靶基因，然而miR-223-3p調(diào)控Rbpj的表達在葡萄膜炎病理機制中的作用尚不清楚。本研究擬通過雙熒光素酶表達報告分析系統(tǒng)，檢測熒光強度表達的變化情況，明確miR-223-3p對Rbpj基因的調(diào)控作用；實時熒光定量PCR(quantitative PCR, Q-PCR)檢測EAU大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中miR-223-3p和Rbpj基因的表達情況，ELISA檢測Rbpj、IFN-γ、IL-17蛋白的表達水平變化，流式細胞儀檢測Th1、Th17細胞水平變化，以初步闡釋miR-223-3p對Notch信號通路轉(zhuǎn)錄因子Rbpj表達的調(diào)控作用以及對葡萄膜炎大鼠Th1、Th17細胞分化的影響，為尋找葡萄膜炎新的治療靶點、豐富臨床基礎(chǔ)理論提供幫助。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選用24只6～8周齡健康雌性Lewis大鼠(北京維通利華公司，北京)，體質(zhì)量160～180g。本研究符合動物倫理學(xué)，并經(jīng)倫理委員會審批通過。

1.1.2主要試劑及儀器高純度質(zhì)粒抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；報告基因檢測試劑盒、miRNA轉(zhuǎn)染試劑盒(上海吉滿生物科技有限公司)；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；FITC-CD4(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；PE-IFN-γ，PE-IL-17(美國eBioscience公司)；Ficoll淋巴細胞分離液(北京索萊寶公司)；RNA組織/細胞快速提取試劑盒(濟南思科捷公司)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR GreenⅠ試劑盒(南京諾維贊公司)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)；大鼠EILSA(Rbpj、IFN-γ和IL-4)試劑盒(上海江萊生物技術(shù)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；LightCycler?480Q-PCR儀(美國Roche公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國Perkin-Elmer公司)；流式細胞儀(美國BD FACSVerseTM)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及處理把大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、葡萄膜炎模型組(EAU組)和空白對照組(BC組)，每組各8只。預(yù)先制備含光感受器間維生素A結(jié)合蛋白(interphotoreceptor retinoid- binding protein, IRBP)、完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant, CFA)、結(jié)核分枝桿菌H37RA(tuberculin, TB)的無菌PBS乳糜液，EAU模型組大鼠在軀干上皮下、后肢兩足墊及腹壁兩側(cè)各點分別均勻注射200μL以誘導(dǎo)葡萄膜炎，BC組大鼠于相同部位分別注射等體積的不含IRBP的TB+CFA乳糜液，NC組同法注射等體積的無菌生理鹽水。各組大鼠不同處理條件干預(yù)后第12d，按照5%苯巴比妥溶液(按50mg/kg體質(zhì)量的比例)腹腔注射麻醉處死大鼠，迅速分離各大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織用于以下實驗研究。

1.2.2雙熒光素酶檢測miR-223-3p調(diào)控Rbpj基因應(yīng)用生物信息軟件預(yù)測miR-223-3p與Rbpj基因的結(jié)合位點;將Rbpj基因的3’UTR序列及其突變體克隆到雙熒光素酶報告基因載體中，構(gòu)建野生型及突變型重組雙熒光素酶報告質(zhì)粒載體，采用PCR及基因測序方法鑒定載體是否構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的野生型和突變型雙熒光素酶報告載體，通過mimic+Rbpj野生型，mimics NC+Rbpj野生型, mimic+Rbpj突變型，mimics NC+Rbpj突變型進行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48h以空白細胞裂解液作為參比，測定相對光單位(relative light unit, RLU)值。

1.2.3Q-PCR檢測大鼠脾臟和淋巴結(jié)及眼組織中miR-223-3p與Rbpj基因的表達免疫后12d，各組大鼠隨機各選取3只，分離脾臟、淋巴結(jié)和眼組織，用RNA組織/細胞快速提取試劑盒提取miRNA和總RNA，K5600光分度計檢測RNA的純度和濃度(A260/A280為1.8～2.1)。將提取的miRNA和總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Q-PCR技術(shù)檢測miR-223-3p、Rbpj基因的表達水平，其中U6為miR-223-3p的內(nèi)參，GAPDH為Rbpj基因的內(nèi)參。U6的反轉(zhuǎn)錄引物為5’-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTCAT-3’，miR-223-3p反轉(zhuǎn)錄引物為5’-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACG GGG TA-3’。miR-223-3p、Rbpj、U6和GAPDH的PCR引物序列見表1。Q-PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5s，循環(huán)1次；95℃ 20s，57℃ 25s，60℃ 25s，循環(huán)45次。Q-PCR檢測結(jié)束后，按照2-ΔΔCt方法計算miR-223-3p、Rbpj基因表達情況，并進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

表1 miR-223-3p、Rbpj、U6和GAPDH引物序列

1.2.4ELISA檢測大鼠脾臟和淋巴結(jié)及眼組織中Rbpj與IFN-γ和IL-17蛋白的表達水平免疫后12d，每組大鼠隨機各選取2只，分別收取各組大鼠的脾臟、淋巴結(jié)和眼組織，放入無菌EP管中，然后加入400μL RIPA裂解液和4μL PMSF，待充分混勻后電動勻漿5min，使組織裂解完全。將樣品管插入冰中，超聲波細胞粉碎機超聲20min，高速離心機離心8000r/min，4℃10min后，收取上清液。BCA法測定各組蛋白濃度，ELISA試劑盒檢測Rbpj、IFN-γ和IL-4蛋白的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.2.5流式細胞儀檢測大鼠脾臟和淋巴結(jié)及眼組織中Th1和Th17細胞水平免疫后12d，每組大鼠隨機各選取3只，取各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織研磨后用40μm細胞篩網(wǎng)過濾，尼龍毛富集T淋巴細胞，然后用大鼠淋巴細胞分離液進一步純化得到T淋巴細胞，加入4μL細胞刺激混合劑(包含cocktail刺激液和Golgistop蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑)，振蕩器渦旋10s充分混勻。先用FITC-CD4進行細胞表面染色，然后對細胞行固定破膜，然后分別用PE-IFN-γ和PE-IL-17進行胞內(nèi)染色，振蕩器渦旋10s充分混勻。染色結(jié)束后用細胞洗滌液清洗2次細胞，離心去上清。最后每管加300μL PBS重懸細胞，濾網(wǎng)過濾，流式細胞儀檢測各組大鼠Th1、Th17細胞表達水平并分析結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1miR-233-3p調(diào)控Rbpj基因雙熒光素酶報告基因表達分析結(jié)果顯示，與正常對照組相比，miR-233-3p對Rbpj基因野生型的值有較顯著的下調(diào)表達，然而對其預(yù)測靶基因位點進行突變后，突變型載體中的RLU值表達水平未見明顯改變(圖1)。由此可見，miR-223-3p可明顯調(diào)控帶有Rbpj基因片段3’UTR基因的表達，Rbpj為miR-223-3p調(diào)控的靶基因。

圖1 miR-223-3p與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染靶細胞后Rbpj的表達水平 bP<0.01 vs miR-陰性對照組。

2.2EAU大鼠脾臟和淋巴結(jié)及眼組織中miR-233-3p與Rbpj基因的表達水平Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，BC組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中miR-233-3p、Rbpj基因的表達水平與NC組大鼠相比無明顯變化(均P>0.05)；與NC組大鼠相比，免疫后12d，miR-223-3p在EAU模型組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中的表達水平分別為0.33±0.29、0.11±0.12、0.18±0.11呈顯著下調(diào)表達(均P<0.05)；Rbpj mRNA水平均呈上調(diào)表達，分別為3.00±0.06、1.52±0.12、3.01±0.34，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 免疫后12d三組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中miR-223-3p、Rbpj基因的表達水平

2.3Rbpj和IFN-γ及IL-17蛋白的表達水平ELISA檢測結(jié)果顯示，BC組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Rbpj、IFN-γ和IL-17蛋白的表達水平與NC組大鼠相比無明顯變化(均P>0.05)；相比于NC組大鼠，免疫后12d的EAU模型組大鼠的脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Rbpj、IFN-γ和IL-17蛋白水平均呈明顯的上調(diào)表達，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

表3 免疫后12d三組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Rbpj、IFN-γ和IL-17蛋白的表達水平

2.4大鼠脾臟和淋巴結(jié)及眼組織中Th1與Th17細胞水平免疫后12d，流式細胞儀分別檢測三組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Th1、Th17細胞水平，發(fā)現(xiàn)BC組大鼠與NC組大鼠相比，各組織中Th1和Th17細胞水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。與NC組相比，EAU模型組大鼠各組織中Th1和Th17細胞水平明顯升高，見表4，圖2、3。

圖2 流式細胞儀檢測不同條件處理后第12d各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織細胞中Th1細胞水平變化。

表4 免疫后12d三組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Th1、Th17細胞水平

3討論

葡萄膜炎是一類眼科常見、以眼內(nèi)炎癥為特征的自身免疫性疾病，常伴有眼疼、畏光、前房積膿和玻璃體混濁等。目前，葡萄膜炎的發(fā)病機制尚不完全清楚，臨床治療主要依賴激素和免疫抑制劑，復(fù)發(fā)率高，長期使用易產(chǎn)生藥物依賴性，導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，其診療已屬于世界性難題。研究發(fā)現(xiàn)，Th1、Th17細胞是誘導(dǎo)葡萄膜炎發(fā)病的關(guān)鍵因素，Th1和Th17細胞因子主要介導(dǎo)促炎作用,Th1和Th17與其分泌的標(biāo)志性細胞因子IFN-γ、IL-17共同參與了葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展[13]。葡萄膜炎的免疫調(diào)節(jié)涉及多條信號通路，其中Notch信號通路是維持機體免疫平衡的重要信號通路，在細胞因子的刺激下可調(diào)控初始CD4+T細胞分化為Th1、Th17等效應(yīng)細胞進而影響Th細胞之間的比例平衡，并影響葡萄膜炎的病理過程[14-15]。轉(zhuǎn)錄因子Rbpj是Notch信號通路活化過程中所必須的，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)的4種受體Notch1～4均可通過關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子Rbpj調(diào)節(jié)下游基因的表達，敲除Rbpj即可阻斷全部Notch信號通路[16-17]。

MicroRNAs(miRNAs)是一類短片段的內(nèi)源性非編碼RNA分子，能直接結(jié)合特定的mRNA靶分子的3’端非翻譯區(qū)而使其降解并抑制蛋白質(zhì)的合成，從而以負反饋調(diào)節(jié)方式發(fā)揮免疫調(diào)控作用[18]。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs可通過調(diào)節(jié)Th細胞分化在自身免疫性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p在實驗性自身免疫性心肌炎小鼠中的表達明顯低于正常小鼠。miR-223-3p可抑制NLRP3炎癥小體的表達，促進樹突狀細胞(dendritic cell, DC)向耐受性DC表型分化。miR-223-3p通過抑制抗原遞呈樹突狀細胞的功能，有效誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的產(chǎn)生，提示miR-223-3p參與誘導(dǎo)耐受性樹突狀細胞的表型并調(diào)節(jié)自身免疫性心肌炎的耐受性；Shi等[20]發(fā)現(xiàn)，miR-219a-5p通過抑制Th1/Th17介導(dǎo)的免疫反應(yīng)抑制腸道炎癥的發(fā)展進程，提示miR-219a-5p可能是腸道炎癥治療的新靶點；Cruz等[21]證實，miR-27在小鼠T細胞中的過表達可抑制調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞的分化，導(dǎo)致Treg功能紊亂，進而造成小鼠免疫耐受功能障礙。

圖3 流式細胞儀檢測不同條件處理后第12d各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織細胞中Th17細胞水平變化。

目前，國內(nèi)外多名學(xué)者圍繞miRNAs在葡萄膜炎病理機制中的作用開展了相關(guān)的研究。Zhang等[22]研究表明，miR-182-5p對EAU小鼠TAF15的調(diào)控，可通過抑制STAT3磷酸化來負性調(diào)節(jié)Th17細胞的發(fā)育，從而發(fā)揮治療葡萄膜炎的作用。Muhammad等[23]研究證實，脾臟組織產(chǎn)生的miR-155可抑制黑皮質(zhì)素5受體依賴的抑制性巨噬細胞(suppressor macrophages)，加劇了EAU的發(fā)展在實驗性自身免疫性前葡萄膜炎(experimental autoimmune anterior uveitis，EAAU)的研究中，Hsu等[10]發(fā)現(xiàn)miRNA的動態(tài)變化會促進核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)的活化，進而激活下游Th1和Th17特異性細胞因子和效應(yīng)T細胞，最終引起光感受器細胞凋亡，進一步研究發(fā)現(xiàn)，與NF-κB信號通路相關(guān)的miR-223-3p、miR-146a-5p、miR-155-5p和miR-147b在葡萄膜炎大鼠虹膜、睫狀體中呈現(xiàn)低水平表達，而miR-182-5p、miR-183-5p和miR-9-3p呈現(xiàn)高水平表達。Wei等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子FOXO3的表達促進EAU小鼠中樹突狀細胞驅(qū)動的Th17細胞反應(yīng)，上述研究提示miR-223-3p有可能成為治療葡萄膜炎新的作用靶點。

生物信息學(xué)預(yù)測分析和本研究均表明，Notch信號通路的轉(zhuǎn)錄因子Rbpj基因為miR-223-3p調(diào)控的靶基因。Q-PCR結(jié)果顯示，與NC組相比，免疫12d后的EAU大鼠的眼、脾和淋巴結(jié)組織中miR-223-3p顯著下調(diào)，然而其調(diào)控的靶基因Rbpj的表達明顯升高。ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EAU模型組大鼠各組織Rbpj、IFN-γ和IL-17蛋白表達水平均明顯高于NC組，流式檢測表明EAU模型組Th1和Th17細胞比例明顯升高，提示Th1和Th17細胞比例失衡與機體的免疫微環(huán)境改變有關(guān)，失衡的Th1和Th17與葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR-223-3p可負調(diào)控Notch信號通路轉(zhuǎn)錄因子Rbpj的表達，EAU大鼠中miR-223-3p的下調(diào)表達可提高Rbpj基因和蛋白的表達水平，影響Th1和Th17細胞的分化及相關(guān)分子IFN-γ和IL-17的表達水平，進而影響葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展。本研究初步闡釋了miR-223-3p對Notch信號通路轉(zhuǎn)錄因子Rbpj表達的調(diào)控作用以及對葡萄膜炎大鼠Th1、Th17細胞分化及IFN-γ和IL-17的影響，對尋找葡萄膜炎新的治療靶點、豐富臨床基礎(chǔ)理論具有重要意義。