血脂康對SD大鼠心臟缺血/再灌注心肌細胞凋亡的影響*

左漢恒， 李銀平△， 黃劍鋒， 朱文雅， 肖善花， 黃紹烈

(1.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內監(jiān)護室，山東 濟寧 272013； 2.南昌大學第一附屬醫(yī)院a.超聲科；b.腎內科； c.心內科，南昌 330006)

心肌缺血/再灌注損傷引起心肌細胞死亡包括壞死和凋亡兩種方式。在缺血/再灌注損傷的早期以細胞凋亡為主，后期以壞死為主，梗死灶的周邊以細胞凋亡為主，中央部分以壞死為主[1]。在心肌缺血/再灌注早期應用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease, Caspase)抑制劑能減少細胞凋亡[2]。在缺血-再灌注16 h內危險區(qū)的心肌5%～30%發(fā)生細胞凋亡，梗死區(qū)及其周圍心肌均會發(fā)生凋亡，應用Caspase抑制劑能減少21%～52%的梗死面積[3]。甘草酸預處理能抑制大鼠心肌缺血再灌注心肌B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl2-Associated X的蛋白質(Bax)表達，進而減少心肌細胞凋亡[4]。

脂肪酸合成酶(Fas)又名CD95或APO-1,是細胞凋亡信號受體,通過與Fas配體(FasL)結合誘導細胞凋亡[5]。Fas/FasL凋亡通路在心臟缺血/再灌注心肌細胞凋亡中起到重要作用, 抑制其表達能減少心肌細胞凋亡[5]。血脂康主要成分為洛伐他汀[6]。本課題組前期研究[7]發(fā)現，血脂康減少大鼠急性缺血-再灌注心肌Fas/FasL mRNA的表達。LIU等[8]研究發(fā)現，大鼠模型心肌缺血再灌注過程中Fas/FasL誘導心肌細胞凋亡。ZHANG等[9]研究發(fā)現，辛伐他汀能抑制血管內皮細胞的凋亡。然而，有研究[10]發(fā)現，他汀類藥物通過抑制Ras信號通路，增強人造血腫瘤細胞中Bim和p27的表達來誘導細胞凋亡。因此，本實驗探討血脂康能否抑制SD大鼠心肌缺血/再灌注心肌細胞Fas/FasL表達，從而最終抑制心肌細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品與試劑 血脂康原粉北大維信生物科技有限公司惠贈，DeadEndTMColorimetric TUNEL System Kit 購自美國Promega公司，抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物與分組 健康SD成年大鼠，體質量200～250 g，在南昌大學醫(yī)學院動科部飼養(yǎng)，實驗動物生產許可證號[SCXK(京)2016-0009 ]，實驗動物質量合格證號(No.110364200100066481)，實驗經南昌大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(NO：20071876)。

SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為5組，各8只。假手術組：雙蒸水2 mL·d-1灌胃1周；模型對照組：雙蒸水2 mL·d-1灌胃1周；甲羥戊酸組：甲羥戊酸150 mg·kg-1·d-1溶于雙蒸水2 mL灌胃1周；血脂康組：血脂康2.8 g·kg-1·d-1，用雙蒸水2 mL配成懸液灌胃1周；血脂康+甲羥維酸組：血脂康2.8 g·kg-1·d-1聯(lián)合甲羥戊酸150 mg·kg-1·d-1溶于雙蒸水2 mL配成懸液灌胃1周。

1.2.2 缺血-再灌注模型復制 根據本課題組前期發(fā)表文獻方法復制在體心臟缺血-再灌注模型[5]，簡要步驟如下。

腹腔注射質量分數3%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉。氣管切開插管，連接小動物呼吸機(頻率60次·min-1，呼/吸=1∶1.5,壓力0.04 MPa)。沿胸骨旁左側0.5 cm剪開皮膚、皮下組織，于左側第四肋間鈍性分離，剪斷第4肋，打開胸腔，在距左心耳根部下方2 mm處帶4-0手術絲線無創(chuàng)手術圓針進針，肺動脈圓錐旁出針，進針深度1.0～1．5 mm，寬2～3 mm，結扎左冠狀動脈前降支 (假手術組只穿線不結扎)，結扎前放2根4號雙股手術絲線。結扎30 min后解開活結，拉動2根4號絲線，使左前降支血流再通120 min。描記肢體Ⅱ導聯(lián)心電圖。造模成功標準：心電圖R波增寬、增高；結扎遠端的左心室變蒼白、室壁運動減弱[11]。

1.2.3 原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)檢測心肌細胞凋亡 再灌注120 min后在同一部位垂直心室長軸取左心室組織，質量分數10%中性甲醛溶液固定，制作常規(guī)石蠟切片，末端脫氧核苷酸轉移酶介導的TUNEL檢測心肌細胞凋亡。實驗嚴格按照DeadEndTMColorimetric TUNEL System 試劑盒說明書步驟操作，具體步驟如下。

左心室心肌組織經自動脫水機脫水、二甲苯透明、組織浸蠟和石蠟包埋后，制作4 μm的石蠟切片。石蠟切片65 ℃恒溫箱內烤片60 min；二甲苯脫蠟兩次，每次5 min；室溫下依次體積分數100%乙醇、體積分數85%乙醇、體積分數70%乙醇和體積分數50%乙醇各3 min組織切片水合；在室溫下用質量分數0.85% NaCl浸洗5 min,再用PBS液在室溫下浸洗5 min；室溫下質量分數4%多聚甲醛溶液(溶于PBS液中)溶液固定15 min；室溫下切片在PBS液中浸泡5 min，重復一次，每片切片加100 μL蛋白酶K(20 μg·mL-1)室溫孵育20 min；室溫下在PBS液中浸洗5 min，再用質量分數4%多聚甲醛重復固定5 min；室溫下PBS浸洗5 min，重復一次；陽性對照切片加用100 μL/切片DnaseⅠ緩沖液5 min，去除緩沖液，再每片加100 μL溶于DNaseⅠ緩沖液的DNaseⅠ(5 U·mL-1)，室溫下孵育10 min，去離子水洗3次，再用PBS液浸洗5 min,隨后步驟相同，但應分開處理。除去切片上過多的水，每片加100 μL平衡液,室溫下平衡10 min；加100 μL rTdT反應混合液到每片組織切片上，用塑料蓋玻片覆蓋，37 ℃孵育60 min，陰性對照不含有rTdT，用去離子水代替;室溫下浸入2×SSC中15 min以終止反應；PBS浸洗5 min，再重復2次；室溫下浸在質量分數0.3%的過氧化氫溶液中5 min，阻斷內源性過氧化酶；室溫下PBS浸洗5 min，3次；每個切片加100 μL 1∶500的streptavidin HRP(用PBS稀釋)，室溫孵育30 min；在PBS液中浸洗5 min，3次；每個玻片加100 μL DAB液，避光顯影10 min，在光學顯微鏡下觀察背景呈淺黃色時用去離子水沖洗終止反應；蘇木精襯染；晾干玻片，常規(guī)樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察：TUNEL陽性的凋亡細胞的細胞核呈棕黃色，正常心肌細胞的細胞核呈藍色[12]。應用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)采集圖像并計數TUNEL陽性凋亡心肌細胞和總心肌細胞數。采用雙盲的方法，每只大鼠觀察4張切片，每張切片計數4個高倍視野(×200)下的TUNEL陽性凋亡心肌細胞和總心肌細胞數。計算心肌細胞凋亡指數，心肌細胞凋亡指數=TUNEL陽性心肌細胞/總心肌細胞×100%。

1.2.4 實時熒光定量PCR 運用Trizol法提取大鼠心肌組織的總RNA，用Nano Drop超微量分光光度計檢測RNA濃度后進行定量。

將RNA(x μL)加DEPC水(8-x μL)混合后，加入5×PrimeScript RT Master Mix(2 μL)制成10 μL逆轉錄體系，行逆轉錄PCR反應：25 ℃，5 min； 42 ℃，30 min；85 ℃，5 min；最后12 ℃。運用SYBR GREEN法行實時熒光定量PCR反應：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s，40個循環(huán)。實驗結果采用2-ΔΔCt方法進行計算，以18 s作為內參。

1.2.5 蛋白免疫印跡 運用RIPA裂解液添加質量分數1% PMSF裂解大鼠心肌組織，運用BCA Protein Assay Kit測定總蛋白濃度。

將蛋白上清液和5×Loading buffer(4∶1)混勻后，用100 ℃水浴5 min，待溫度冷卻后放置-20 ℃儲存。配制所需濃度的SDS凝膠，將等量總蛋白上樣，經凝膠電泳后轉移至PVDF膜。用質量分數5%脫脂奶粉封閉2 h。用質量分數5%脫脂奶粉按1∶1 000比例配置相關一抗，于4 ℃搖床孵育一抗過夜。次日，用TBST清洗(每次10 min，洗3次)，用質量分數5%脫脂奶粉按1∶10 000比例配置相應二抗，室溫孵育2 h。用TBST清洗，最后使用ECL發(fā)光試劑盒在顯色儀中曝光顯影，蛋白條帶使用Image J軟件進行灰度值測量，用β-actin作為內參。

2 結果

2.1 心肌細胞凋亡 TUNEL陽性凋亡心肌細胞的細胞核呈棕褐色，非凋亡心肌細胞的細胞核呈藍色。

假手術組大鼠心肌細胞偶有凋亡，TUNEL陽性心肌細胞(3.84±1.64)%。缺血-再灌注損傷引起心肌細胞凋亡增加，模型對照組TUNEL陽性心肌(30.27±6.52)%，同假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。血脂康預處理能減少缺血-再灌注損傷引起的心肌細胞凋亡[血脂康組(17.84±4.55)%vs模型對照組，P<0.001]，但仍比假手術組心肌細胞凋亡增多(血脂康組vs假手術組，P<0.001)。甲羥戊酸減弱血脂康對缺血-再灌注心肌細胞凋亡的抑制[血脂康+甲羥戊酸組(28.32±6.17)%vs血脂康組，P<0.001；血脂康+甲羥戊酸組vs模型對照組，P=0.481]，而單獨甲羥戊酸預處理對缺血-再灌注損傷心肌細胞凋亡無影響[甲羥戊酸組(31.93±6.82)%vs模型對照組，P=0.549]。見圖1。

2.2 心肌組織實時熒光定量Fas、FasL mRNA表達

模型對照組凋亡基因mRNA表達水平同假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；血脂康組與模型對照組相比能減少凋亡基因mRNA表達水平(P<0.01)；血脂康+甲羥戊酸組可以逆轉血脂康組的保護效應(P<0.05)。見表1。

表1 各組心肌組織實時熒光定量Fas、FasL mRNA表達比較

2.3 蛋白免疫印跡法檢測心肌組織Fas、FasL 蛋白表達 模型對照組凋亡蛋白表達水平同假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；血脂康組與模型對照組相比可減少凋亡蛋白表達水平(P<0.01)；血脂康+甲羥戊酸組可以逆轉血脂康組的保護效應(P<0.05)。見表2、圖2。

注：a:假手術組；b:血脂康+甲羥戊酸組;c:甲羥戊酸組;d:模型對照組;e:血脂康組;f:陰性對照；g:陽性對照。TUNEL-陽性心肌細胞即凋亡細胞呈棕褐色(見箭頭所示)，正常非凋亡心肌細胞細胞核呈藍色。

表2 缺血-再灌注損傷心肌Fas/FasL蛋白表達比較

注：a:假手術組;b:模型對照組;c:血脂康組;d:血脂康+甲羥戊酸組;e:甲羥戊酸組。

3 討論

血脂康為粳米接種特殊紅曲菌，采用現代生物制藥工藝發(fā)酵、精制而成，主要成分為無晶型結構的洛伐他汀等13種同系物，含有8%的不飽和脂肪酸、甾醇和少量黃酮類物質等[6]，與化學合成的洛伐他汀相比，血脂康所含洛伐他汀結晶度較低，體內溶出度高[13]。本研究結果發(fā)現，缺血/再灌注引起SD大鼠心肌細胞凋亡增加，血脂康預處理能明顯抑制SD大鼠缺血/再灌注引起的心肌細胞凋亡。應用甲羥戊酸拮抗血脂康中的洛伐他汀發(fā)現血脂康抑制SD大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡作用減弱，提示血脂康中的主要成分洛伐他汀起抑制心肌細胞凋亡作用，與張曉捷等[14]研究發(fā)現一致。張曉捷等[14]研究發(fā)現，洛伐他汀預處理后，大鼠心肌缺血/再灌注時心肌細胞凋亡減少，心功能明顯改善。ZHANG等[9]研究發(fā)現，辛伐他汀可抑制氧化型低密度脂蛋白誘導的內質網應激和血管內皮細胞凋亡。然而，他汀類藥物在影響腫瘤細胞凋亡中得到相反的結果。FUJIWARA等[10]研究發(fā)現，他汀類藥物通過降低線粒體跨膜電位、增加 Caspase-9和Caspase-3的活化、增強Bim表達以及通過抑制Ras/細胞外信號調節(jié)激酶和 Ras/哺乳動物靶標誘導細胞周期停滯在G1期來誘導細胞凋亡。

本課題組前期研究發(fā)現，缺血/再灌注使大鼠心肌Fas/FasL mRNA表達增加, 血脂康預處理后能抑制缺血/再灌注心肌Fas/FasL mRNA的表達[7]。本實驗再次驗證，血脂康抑制缺血/再灌注大鼠心肌Fas和FasL mRNA的表達，同時可抑制Fas和FasL蛋白的生成。Fas/FasL通路在缺血/灌注心肌細胞凋亡中起到重要作用，缺血/再灌注時心肌Fas/FasL表達增加，抑制Fas/FasL表達可減少心肌細胞凋亡。LEE等[5]研究發(fā)現，淋巴組織增生病小鼠(Fas無功能)同野生型小鼠相比，缺血/再灌注時心肌細胞凋亡減少63.8%，梗死面積減少62.3%。LIU等[8]研究發(fā)現，在缺血和再灌注時間延長后的心肌缺血/再灌注中，心肌細胞凋亡增強，細胞凋亡和Fas/FasL參與心臟缺血/再灌注的發(fā)病，阻斷細胞凋亡或Fas/FasL表達是預防和治療心臟缺血/再灌注損傷的一種方法。

總之，血脂康抑制缺血/再灌注大鼠心肌細胞Fas/FasL凋亡通路，進而抑制缺血/再灌注心肌細胞凋亡，其抑制心肌細胞凋亡的主要成分為洛伐他汀。