延遲放瓶對(duì)2種自動(dòng)化血培養(yǎng)系統(tǒng)苛養(yǎng)菌培養(yǎng)的影響

褚敏君， 李小娟， 黃海林， 李 玨， 麻明彪， 杜廷義， 王海平

（昆明市兒童醫(yī)院 昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650228）

血流感染（bloodstream infection，BSI）是一種病死率極高的全身感染性疾病[1]，快速、準(zhǔn)確地檢出血液中的病原菌，可有效降低病死率，提高治愈率。在臨床工作中，因各種原因常常不能及時(shí)將血培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)系統(tǒng)中，延遲放瓶現(xiàn)象較為普遍。針對(duì)延遲放瓶對(duì)血培養(yǎng)陽性檢出情況的影響，本研究選取肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）和流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）這2種兒童感染常見的苛養(yǎng)菌，制備不同濃度含菌血液模擬樣本，比較其室溫放置不同時(shí)間后，在2種自動(dòng)化血培養(yǎng)系統(tǒng)中的陽性檢出情況。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎鏈球菌（ATCC 49619）和流感嗜血桿菌（ATCC 9007）購自國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器與試劑

BACTEC FX血培養(yǎng)儀及配套中和兒童抗菌藥物需氧瓶BactecPeds Plus（美國(guó)BD公司）。BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)儀及配套兒童中和抗菌藥物需氧瓶 BacT/ALERT PF（法國(guó)生物梅里埃公司）。無菌血液來自身體健康未使用過抗菌藥物的獻(xiàn)血者。

1.3 方法

用無菌0.9% NaCl溶液將標(biāo)準(zhǔn)菌株配制成1×102、1×103和1×105CFU/mL的菌懸液備用，通過菌落計(jì)數(shù)確證菌懸液濃度。在每個(gè)血培養(yǎng)瓶中均注入5 mL無菌全血，再加入1 mL配制的菌懸液混勻，每份樣本重復(fù)配制3瓶。將含不同濃度菌懸液的血培養(yǎng)瓶分別在室溫（22 ℃）中放置0、8、16和24 h后，分別放入BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)儀和BACTEC FX血培養(yǎng)儀中。培養(yǎng)儀的預(yù)設(shè)培養(yǎng)時(shí)間為5 d，若5 d后系統(tǒng)仍未報(bào)陽，則為培養(yǎng)陰性。報(bào)陽樣本報(bào)陽時(shí)間為3瓶的平均值。抽取所有培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體，轉(zhuǎn)種后進(jìn)行菌種鑒定，以確認(rèn)生長(zhǎng)菌為接種菌，且未被污染。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用重復(fù)測(cè)量方差分析評(píng)價(jià)受試者內(nèi)因素（不同的血培養(yǎng)系統(tǒng)、延遲放瓶時(shí)間和菌液濃度）對(duì)因變量（細(xì)菌報(bào)陽時(shí)間）的影響。采用Mauchly球?qū)ΨQ假設(shè)檢驗(yàn)分析受試者內(nèi)因素的交互作用；對(duì)不滿足球?qū)ΨQ假設(shè)的數(shù)據(jù)，采用Greenhouse-Geisser計(jì)算球?qū)ΨQ系數(shù)ε，校正結(jié)果。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，2組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析結(jié)合Bonferroni校正。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)結(jié)果

不同濃度肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌接種瓶經(jīng)室溫放置不同時(shí)間后，在2種血培養(yǎng)儀中均自動(dòng)檢出陽性。報(bào)陽時(shí)間見表1。

表1 不同延遲放瓶時(shí)間2種苛養(yǎng)菌不同血培養(yǎng)儀平均報(bào)陽時(shí)間 h

2.2 不同因素及其交互效應(yīng)對(duì)報(bào)陽時(shí)間的影響

BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)報(bào)陽時(shí)間短于BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)，報(bào)陽時(shí)間隨延遲放瓶時(shí)間的增加呈延長(zhǎng)趨勢(shì)，隨菌液濃度的增高呈縮短趨勢(shì)（P＜0.001）。肺炎鏈球菌延遲放瓶0 h的報(bào)陽時(shí)間與8、16、24 h比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；流感嗜血桿菌延遲放瓶0 h的報(bào)陽時(shí)間與8、24 h比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同因素及其交互效應(yīng)對(duì)苛養(yǎng)菌報(bào)陽時(shí)間的影響

3 討論

作為診斷BSI的金標(biāo)準(zhǔn)，血培養(yǎng)在臨床工作中發(fā)揮著重要作用。提高血培養(yǎng)陽性檢出率、縮短檢測(cè)時(shí)間，一直是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室努力的目標(biāo)。血培養(yǎng)陽性結(jié)果的正確與否受樣本、儀器、檢測(cè)原理等多種因素的影響[2]。BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)和BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)是目前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的血培養(yǎng)系統(tǒng)，但2個(gè)血培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)常見病原菌的陽性檢出率和報(bào)陽時(shí)間存在一定的差異[3]。

在實(shí)際工作中，由于工作流程和資源投入等多種因素的制約，血培養(yǎng)樣本采集后不能及時(shí)放入培養(yǎng)儀的情況較為普遍，分析延遲放瓶對(duì)血培養(yǎng)陽性檢測(cè)結(jié)果的影響十分重要。孫景勇等[4]發(fā)現(xiàn)，延遲放瓶＜16 h，BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)和BACTEC 9120血培養(yǎng)系統(tǒng)的陽性檢出率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而延遲放瓶24 h，前者的陽性檢出率明顯高于后者（P＜0.05）。本研究中，所有樣本經(jīng)室溫放置不同時(shí)間后，在2種血培養(yǎng)系統(tǒng)中均可檢測(cè)到陽性結(jié)果。產(chǎn)生差異的原因可能與測(cè)試菌種不同有關(guān)，孫景勇等[4]測(cè)試的是大腸埃希菌，其在放置過程中可能會(huì)因?yàn)楫a(chǎn)酸量積累的原因，干擾血培養(yǎng)儀的監(jiān)測(cè)過程和結(jié)果判斷。此外，本研究使用的BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)與BACTEC 9120血培養(yǎng)系統(tǒng)在檢測(cè)原理上的差別也可能是陽性檢出率出現(xiàn)差異的原因。

肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌作為臨床常見苛養(yǎng)菌，是我國(guó)兒童臨床分離優(yōu)勢(shì)株，分離率明顯高于成人[5]，在昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院BSI病原中所占比例呈逐年上升趨勢(shì)[6]。本研究中，2種苛養(yǎng)菌在BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)中的報(bào)陽時(shí)間均短于BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)（P＜0.001），與相關(guān)報(bào)道結(jié)果[7-8]一致。肺炎鏈球菌經(jīng)室溫延遲放置8、16和24 h后，報(bào)陽時(shí)間均顯著長(zhǎng)于0 h放置樣本。有研究結(jié)果表明，肺炎鏈球菌可在血培養(yǎng)陽性報(bào)警后8～10 h內(nèi)自溶死亡[9]，延遲培養(yǎng)樣本報(bào)陽時(shí)間延長(zhǎng)可能也與此相關(guān)，因此臨床懷疑肺炎鏈球菌BSI時(shí)，應(yīng)立即送檢。而流感嗜血桿菌經(jīng)室溫延遲放置0和8 h，報(bào)陽時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），室溫放置8 h不影響其在2種血培養(yǎng)系統(tǒng)中的報(bào)陽時(shí)間，提示延遲放瓶對(duì)不同菌種的陽性檢出影響不同。

本研究還發(fā)現(xiàn)，菌液濃度、延遲放瓶、血培養(yǎng)系統(tǒng)3個(gè)因素之間有相互作用，共同影響血培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果。肺炎鏈球菌延遲放瓶時(shí)，報(bào)陽時(shí)間受另外2個(gè)因素的共同影響 ，BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)低濃度肺炎鏈球菌樣本時(shí)，報(bào)陽時(shí)間受延遲放瓶影響，而高濃度樣本的報(bào)陽時(shí)間受延遲放瓶的影響不明顯。流感嗜血桿菌血培養(yǎng)系統(tǒng)和菌液濃度會(huì)相互影響，在低濃度條件下，BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)報(bào)陽時(shí)間短于BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)，而高濃度條件下，差異不明顯。

綜上所述，隨著延遲放瓶時(shí)間的延長(zhǎng)，2種苛養(yǎng)菌報(bào)陽時(shí)間均呈延長(zhǎng)趨勢(shì)，BACTEC FX血培養(yǎng)系統(tǒng)在報(bào)陽時(shí)間上相較于BACT/ALERT 3D血培養(yǎng)系統(tǒng)具有一定優(yōu)勢(shì)。這一趨勢(shì)受多因素作用，不同菌種、菌液濃度及血培養(yǎng)系統(tǒng)均會(huì)影響延遲送檢時(shí)細(xì)菌的陽性檢出情況。本研究?jī)H對(duì)兒童瓶及2種常見苛養(yǎng)菌進(jìn)行了初步評(píng)估，具有一定的局限性。各臨床微生物室應(yīng)根據(jù)自身實(shí)際情況，有針對(duì)性地進(jìn)行血培養(yǎng)影響因素的評(píng)估和控制，建議評(píng)估并逐步完善對(duì)陰性培養(yǎng)瓶的盲轉(zhuǎn)培養(yǎng)，以最大限度避免因受延遲放瓶影響而造成的漏檢。