金花葵花中藥用成分分析

王瑞君，田 雨，吳佳文，王延峰，賈澤漢，白朕卿*，張秀娟

1延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，延安 716000；2內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)研究院，呼和浩特 010018

金花葵(HibiseumanihotL.)為一年生草本錦葵科秋葵屬植物，以花入藥，藥食同源且具有保健功能[1]。其主要功效為清熱、涼血、解毒，清利濕熱、解熱抗炎、鎮(zhèn)痛、抗疲勞、抗衰老、降血脂、抑制腫瘤細(xì)胞、增強(qiáng)免疫力、抗氧化等，此外還能夠助消化，理氣，潤(rùn)腸，美白，滋陰壯陽(yáng)[2-5]。金花葵野生于北方山區(qū)，地域性獨(dú)特，被生物界譽(yù)為“植物大熊貓”和“生命救心草”[6,7]。由于對(duì)其資源缺乏保護(hù)，金花葵被認(rèn)為已滅絕。但是2003年8月在河北省邢臺(tái)市發(fā)現(xiàn)了被認(rèn)為已滅絕的金花葵資源，并且對(duì)其進(jìn)行了保育，目前已經(jīng)被廣泛種植[8]。

金花葵的成分包括天然黃酮類化合物、不飽和脂肪酸、維生素E、維生素C、蛋白質(zhì)、高聚糖膠、植物纖維、性激素及多種微量元素等[9]。其中黃酮類化合物是金花葵的主要生物活性物質(zhì)，且含量超出目前黃酮生產(chǎn)常用原料銀杏、大豆等數(shù)十倍[10]，是現(xiàn)在已知的植物中黃酮類含量最高的[11]。金花葵花總黃酮具有顯著抑菌效果，且可以抑制酪氨酸酶活性影響黑色素細(xì)胞的生物合成進(jìn)而起到美白功效，在醫(yī)美方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值[12]。金絲桃苷為金花葵花中黃酮的主要成分[13]。金絲桃苷可以通過(guò)阻止鈣離子進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)起到鎮(zhèn)痛作用，且人體對(duì)其沒(méi)有依賴性[14]。金花葵花中的性激素含量也比補(bǔ)腎類植物高很多，其豐富的天然植物雌激素，對(duì)于延長(zhǎng)女性青春期，減輕中老年更年期綜合征也有奇效[15]。

目前對(duì)金花葵花的主要成分已經(jīng)得到初步的分析，但有關(guān)不同花期藥用價(jià)值的評(píng)價(jià)還未見(jiàn)報(bào)道。近些年，超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)作為一種快速而有效的多成分分析技術(shù)，具有靈敏度高、分離能力強(qiáng)、檢測(cè)范圍廣等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于中藥的化學(xué)成分分析[16,17]。因此本研究通過(guò)超高效液相-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)三組金花葵樣品進(jìn)行分析，鑒定金花葵鮮花、干花和花苞的成分，為闡明金花葵花期前后化學(xué)成分的變化規(guī)律以及為金花葵藥用物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

金花葵為同一時(shí)期種植于內(nèi)蒙古呼和浩特賽罕區(qū)生物技術(shù)研究所金花葵種植基地，開(kāi)花期采集鮮花和花苞，將鮮花晾干制成干花，分別取干花、鮮花和花苞各6個(gè)樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.2 UPLC-QTOF-MS方法

1.2.1 樣品制備

金花葵干花經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)100目篩；花苞、鮮花分別加液氮研磨成粉末，將三種處理好的樣品分別精密稱定0.1 g，置5 mL離心管中，加甲醇(色譜純)3 mL，稱量，超聲(功率300 W，頻率60 kHz)提取45 min，放置至室溫，再稱量，用甲醇(色譜純)補(bǔ)足損失的量，濾過(guò)，取續(xù)濾液0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得三種待測(cè)樣。質(zhì)控樣品由金花葵鮮花、干花和花苞提取溶液等體積混合得到。

1.2.2 色譜條件

采用ACQUITY UPLCTMI-Class和XevoG2XS QTOF聯(lián)用；色譜柱為Waters BEH T3 1.8 m(2.1 mm×150 mm)；柱溫40 ℃；梯度洗脫溶劑A為水溶液(含0.1%甲酸，甲酸為色譜純)；B為乙腈(色譜純)；梯度洗脫過(guò)程如下：97%A(0～1 min)、94%A(1～2 min)、88%A(2～2.5 min)、75%A(2.5～11 min)、50%A(11～13 min)、0%A(13～15 min)、0%A(15～17 min)、97%A(17～20 min)；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)離子源；采集質(zhì)量范圍為50-1 200 Da；離子化模式為ESI(+/-)采集MSE；毛細(xì)管電壓為1.0 kV；離子源溫度為100 ℃；霧化器溫度為450 ℃；霧化器流速為800 L/h；錐孔電壓為40 V；碰撞能量是低能4 V/高能15～60 V；數(shù)據(jù)處理軟件為UNIFI 1.9.2。

1.2.4 數(shù)據(jù)定性與定量分析

采用UNIFI對(duì)差異物質(zhì)進(jìn)行定性分析；每張TOF MS一級(jí)譜圖跟隨10張二級(jí)全碎片掃描開(kāi)啟動(dòng)態(tài)背景扣除DBS。利用超高100張/s的掃描速度，每個(gè)樣品峰都采集18個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，保證了數(shù)據(jù)質(zhì)量。在保證掃描點(diǎn)數(shù)的同時(shí)，一級(jí)、二級(jí)圖譜都保證了30 000以上的高分辨率。利用m/z結(jié)合峰面積對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用AB SCIEX公司建立的天然產(chǎn)物質(zhì)譜庫(kù)掃描，直接調(diào)用在線Chemspider數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定化合物。UNIFI對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA、PLSDA、OPLSDA分析，得到的標(biāo)志物可以直接鏈接到UNIFI進(jìn)行未知物定性分析。差異化合物分析使用Markerview軟件處理后得到邊緣性即差異大的離子，可以加入到Interest List，導(dǎo)入到Peakview中的Masterview進(jìn)行峰提取，選擇載荷圖中邊緣化的離子，t檢驗(yàn)結(jié)果中P值小于0.05的離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 金花葵干花、花苞和鮮花UPLC-Q-TOF-MS基峰強(qiáng)度離子分析

金花葵干花、花苞和鮮花樣品在正離子和負(fù)離子模式下的UPLC-Q-TOF-MS基峰強(qiáng)度離子流圖(BPI)示于圖1，正負(fù)離子流數(shù)據(jù)分析，共識(shí)別了24個(gè)色譜峰，通過(guò)質(zhì)譜裂解碎片分析并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)對(duì)照，正負(fù)離子兩種模式下共鑒定出141種化合物。

圖1 金花葵干花、花苞與鮮花提取液UPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)的負(fù)離子模式和正離子模式總離子流圖

2.2 化合物鑒定

采用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索流程和全未知物鑒定兩種流程，對(duì)花中成分進(jìn)行鑒定，正負(fù)離子兩種模式下共鑒定出141種化合物。包括58個(gè)黃酮類化合物(正離子模式下推測(cè)出有牡荊素葡萄糖苷、槲皮素、紅景天苷；負(fù)離子模式下所得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、二氫櫻黃素、二氫櫻黃素-OCH2-葡萄糖苷、桑黃素-3-O-龍膽二糖苷、桑黃素、桑色素-葡萄糖鼠李糖苷、桑黃素-葡萄糖阿拉伯糖苷、楊梅素、楊梅素-葡萄糖苷、草夾竹桃苷等)，在負(fù)離子模式下共鑒定出27個(gè)有機(jī)酸類化合物(咖啡酸、檸檬酸、羥基檸檬酸、奎寧酸、香草酸等)，19個(gè)氨基酸類(在正離子模式下精氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、酪胺、負(fù)離子模式下有組氨酸、色氨酸等)內(nèi)源性化合物，此外，還含有11個(gè)脂類化合物、9個(gè)核苷類化合物、3個(gè)亞油酸等不飽和脂肪酸和一些糖類、五環(huán)三萜、環(huán)烯醚萜類等其他類別化合物，詳細(xì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)列表見(jiàn)表1。

表1 詳細(xì)化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)列表

2.3 金花葵干花、花苞與鮮花的PCA分析

金花葵干花、花苞與鮮花樣品在正離子和負(fù)離子模式下的UPLC-Q-TOF-MS數(shù)據(jù)PCA分析(見(jiàn)圖2)。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，橫、縱坐標(biāo)分別為第一、第二主成分得分。結(jié)果顯示無(wú)論是正離子模式還是負(fù)離子模式，干花和鮮花與花苞樣品在第一主成分得分上有明顯差異，即分別聚向橫軸的相反方向；干花、花苞、鮮花在第二主成分得分上有明顯差異，即分別聚向縱軸的相反方向；表明干花、鮮花、花苞三者UPLC-Q-TOF-MS數(shù)據(jù)的差異特征明顯。

圖2 金花葵干花、花苞與鮮花提取液UPLC-Q-TOF-MS的PCA得分圖

2.4 金花葵花差異物質(zhì)分析

差異化合物評(píng)判：一是負(fù)離子載荷圖中邊緣化的離子，負(fù)離子載荷圖見(jiàn)圖3；二是t-檢驗(yàn)結(jié)果中P<0.05的離子。使用Markerview軟件處理后得到邊緣性即差異大的離子，可以加入到Interest List，導(dǎo)入到Peakview中的Masterview進(jìn)行峰提取。金花葵花差異物質(zhì)是判斷其藥用價(jià)值的關(guān)鍵。本研究分別對(duì)金花葵干花、花苞、鮮花的差異物質(zhì)進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示金花葵干花、花苞、鮮花中槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸、天師酸、蔗糖、木槿苷、槲皮萬(wàn)壽菊素、2,3-(S)-Hexahydroxydiphenoyl-D-glucose、木犀草素-7-O-葡萄醛酸糖苷、槲皮素-3-O-(6′′-O-乙?；?-β-D-吡喃葡萄糖苷、異金絲桃苷這九個(gè)成分有顯著差異(見(jiàn)圖4)。

圖3 干花、花苞與鮮花的負(fù)離子載荷圖

3 討論與結(jié)論

金花葵全株富含黃酮類物質(zhì)，可作為植物提取行業(yè)生產(chǎn)黃酮的工業(yè)原料，具有很大的開(kāi)發(fā)與利用市場(chǎng)[18]。金花葵花、根、果皮、莖、種子5個(gè)部位中花的總黃酮含量顯著高于其他部位[19]。金絲桃苷為金花葵花中黃酮的主要成分[20]，前人研究顯示金花葵不同部位金絲桃苷含量分布為：花>葉>莖>根>籽[21]。金絲桃苷成分主要分布在其花中，在金花葵花的3個(gè)階段(花蕾、鮮花、落花)中，金絲桃苷的含量高低依次為：花蕾>落花>鮮花，落花的含量為鮮花的1倍左右[22]。金花葵花中金絲桃苷，異槲皮苷在末期花中的含量約為初期花中的兩倍[23]。此外，金花葵干花總黃酮含量居于首位[24]。本研究結(jié)果顯示花苞內(nèi)源性物質(zhì)(如異亮氨酸、酪胺、N-甲基-a-氨基異丁酸)含量較鮮花和干花中高，而部分黃酮類化合物(如槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸、槲皮素-3-O-(6′′-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄醛酸糖苷、紅景天苷、山奈酚-葡萄糖阿拉伯糖苷、異金絲桃苷、木槿苷、槲皮萬(wàn)壽菊素等)較鮮花和干花中低(見(jiàn)圖4)。鮮花中部分黃酮類(如楊梅素、草夾竹桃苷，異槲皮素、牡荊素葡萄糖苷、紅景天苷)和有機(jī)酸類化合物(香素酸、檸檬酸、羥基檸檬酸)，含量較干花和花苞中高。干花中部分黃酮類化合物含量(如桑色素、槲皮素、楊梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷、桑黃素、楊梅素-葡萄糖鼠李糖苷、二氫櫻黃素、羥基-甲基-楊梅素-葡萄糖苷)較鮮花和花苞中高?，F(xiàn)有報(bào)道認(rèn)為黃酮類化合物是金花葵的主要藥效成分[25]，由化合物差異分析結(jié)果可知，鮮花和干花較花苞的藥效成分多且含量高，如槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸、木槿苷、槲皮萬(wàn)壽菊素、2,3-(S)-六羥基二苯酚-D-葡萄糖、木犀草素-7-O-葡萄醛酸糖、槲皮素-3-O-(6′′-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、異金絲桃苷等。

圖4 金花葵干花、花苞與鮮花中主要藥用活性成分分析

本研究建立了金花葵花的UPLC-Q-TOF-MS/MS快速分析方法，并鑒定了不同形式金花葵花內(nèi)的主要有效成分。采用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索流程和全未知物鑒定兩種流程，對(duì)花中成分進(jìn)行鑒定，正負(fù)離子兩種模式下共鑒定出141種化合物，包括58個(gè)黃酮類化合物，27個(gè)有機(jī)酸類化合物，19個(gè)氨基酸類等內(nèi)源性化合物，11個(gè)脂類化合物，9個(gè)核苷類化合物，3個(gè)亞油酸等不飽和脂肪酸和一些糖類、五環(huán)三萜、環(huán)烯醚萜類等其他類別化合物。此外，鮮花中與其他樣品中有顯著性差異的化合物為部分黃酮類和有機(jī)酸類化合物，含量較干花和花苞中高。干花中與其他樣品中有顯著性差異的化合物為部分黃酮類化合物，含量較鮮花和花苞中高。花苞中與其他樣品中有顯著性差異的化合物為內(nèi)源性物質(zhì)和部分黃酮類化合物，內(nèi)源性物質(zhì)含量較鮮花和干花中高，而部分黃酮類化合物較鮮花和干花中低。參考已報(bào)道的文獻(xiàn)，認(rèn)為黃酮類化合物是金花葵的主要藥效成分，由化合物差異分析結(jié)果可知，鮮花和干花較花苞的藥效成分多且含量高，具體與藥效學(xué)結(jié)果是否一致，需進(jìn)一步研究。

金花葵近年來(lái)受到廣大學(xué)者的青睞，其藥用活性成分的測(cè)定成為研究的熱點(diǎn)[26]。金花葵具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，我國(guó)南北地區(qū)都可種植[27]，其花朵不僅具有藥用價(jià)值還可以制成花茶，也可研磨加工成粉，添加到粥或食品中[28,29]。黃酮類化合物在金花葵中的存在已有研究，但在花中卻鮮有公布，本研究初步比對(duì)了三種不同類型金花葵花中的有機(jī)化合物，其成分多樣，后期會(huì)充分對(duì)這些化學(xué)成分進(jìn)行分離，鑒定和藥理活性的研究，更進(jìn)一步闡述金花葵干花，鮮花和花苞的藥用價(jià)值。我們對(duì)金花葵花的主要活性成分含量進(jìn)行研究，分析了金花葵花不同時(shí)期化學(xué)成分含量的差異，為金花葵不同花期入藥研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)闡明金花葵中物質(zhì)基礎(chǔ)提供了有力參考依據(jù)，有助于金花葵后期功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)及臨床研究的應(yīng)用。