基于廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)與高通量測序技術(shù)探究廣陳皮陳化機制

胡 媛，吳 蓓，易 達，陳鴻平，楊放晴，王 福*，劉友平*

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 611137；2 南充市食品藥品檢驗所，南充 637000

陳皮為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣健脾，燥濕化痰的功效，為陳化中藥的典型代表。陳皮之名首見于《食療本草》，文獻記載陳化時間不一?！独坠谥苏摗分^其：“年久者最妙”[1]；《日用本草》載：“陳皮多年者更妙”等[2]。《雷公炮炙藥性解》云其：“收藏又復(fù)陳久，則多歷梅夏而烈氣全消，溫中而無燥散之患，行氣而無峻削之虞”[3]；《藥鑒》載：“陳皮須用隔年陳”；《怡堂散記》載：“(橘皮)新者氣烈，須備廣產(chǎn)，二三年者為上”。

中藥陳化是指中藥經(jīng)適當?shù)姆椒ㄙA存后由新藥變?yōu)殛愃帲湫阅芄πОl(fā)生改變，從而更好地滿足中醫(yī)臨床用藥需求，歷代本草皆有關(guān)于中藥陳化的論述。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“藥有真?zhèn)侮愋?，并各有法”[4]，說明“新”“陳”各有其作用特點和規(guī)律，本經(jīng)收載了橘皮但未提及是否陳化。《神農(nóng)本草經(jīng)集注》首次提出六大陳藥：“凡狼毒、枳實、橘皮、半夏、麻黃、吳茱萸皆須陳久者良”[5]。后世醫(yī)家不斷擴大陳藥范圍，《本草綱目》謂：“然大黃、木賊、荊芥、芫花、槐花之類，亦宜陳久，不獨六陳也”[6]；至清代《本草從新》：“皆以陳久者為佳，或取其烈性減，或取其火氣脫也”，所載陳藥近40味[7]?，F(xiàn)今中醫(yī)亦強調(diào)某些中藥陳用為佳。可見，中藥陳化是基于臨床實踐的總結(jié)。但文獻記載并未對陳化機制進行深入闡釋。

已有中藥陳化機制的研究報道較多，如：吳茱萸、蘄艾葉、麻黃、陳皮[8-10]等中藥，主要集中在對不同陳化時間化學(xué)成分和藥理作用比較方面，品質(zhì)研究并不深入結(jié)論不一。本課題組借鑒烤煙[11]、茶葉[12]、白酒[13]微生物的陳化與品質(zhì)相關(guān)的思路，前期研究發(fā)現(xiàn)，陳皮在陳化過程中附著微生物的生長代謝與黃酮等活性成分的變化密切相關(guān)，認為陳皮附著優(yōu)勢微生物黑曲霉代謝促進黃酮類成分的增加[14]。Liu[15]研究了微生物代謝轉(zhuǎn)化陳皮活性成分的機制，結(jié)果表明微生物參與了陳皮的陳化過程，且能夠轉(zhuǎn)化陳皮中化合物使其活性物質(zhì)含量增加。另不同陳化時間廣陳皮表面細菌和真菌多樣性變化，認為陳皮陳化過程中微生物會引起藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的改變。大量研究均證實陳皮陳化過程中微生物與化學(xué)成分具有相關(guān)性，但未見基于代謝組與高通量測序聯(lián)合分析整體剖析陳皮附著微生物與次生代謝產(chǎn)物相互作用的報道。本文首次基于UPLC-ESI-MS/MS廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析貯藏1年與貯藏3年廣陳皮次生代謝產(chǎn)物，全面揭示比較組樣品中次生代謝產(chǎn)物、共有代謝物以及差異代謝物；基于高通量測序技術(shù)，全面揭示了樣品比較組樣品附著微生物群落結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律，并篩選差異微生物；對代謝組檢測出的差異代謝物和高通量測序比對出的差異微生物進行相關(guān)性分析。研究結(jié)果為陳皮陳化機制深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Applied Biosystems 6500 QTRAP，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；色譜柱(Waters T3 C18;1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；FA2003電子分析天平(上海浦春)；MM400球磨儀(德國萊馳)；TGL-16臺式高速離心機(湖南湘儀實驗儀器有限公司)；移液槍(德國Eppendorf公司)；PTC200PCR儀(美國BIO-Rad公司)；GelDox XR凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-Rad公司)；DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠)；BI3730XL測序儀(美國Applied Bio-systems公司)。植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)；2×Taq PCR MasterMix(Tiangen Biotech Co.，China)。建庫試劑盒 TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(Illumina公司)；QIAquick膠回收試劑盒(QIAGEN公司)；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs公司)；高效高保真酶(New England Biolabs公司)。乙腈(美國Fisher chemical，色譜純)；甲酸(美國，MREDA Technology Inc)；甲醇、乙醇(北京化工廠，分析純)。

1.2 實驗材料

本實驗所用廣陳皮樣品為廣東新會陳皮村標準倉儲陳皮，分別為貯藏1年與3年樣品。實驗樣品均來自新會雙水(雙水水庫)，地質(zhì)為水田，樹種為駁枝，樹齡8年，采摘日期2017年11月，凈選、取皮、干燥后入庫，分別于2018年11月和2020年11月各取樣3次，共計6批次，并依據(jù)陳皮陳久者良原則，將貯藏1年的3批次樣品列為對照樣品(CK)，貯藏3年樣品列為實驗樣品(CP)，并組成對照組Versus實驗組比較組。所有樣品抽真空無菌包裝，編號，-80 ℃ 儲藏，用于次生代謝檢測與微生物高通量測序分析。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

取貯藏1年與3年廣陳皮干燥樣品(過四號篩)100 mg，量取1.0 mL甲醇水溶液(70%甲醇)溶解，超聲0.5 h，低溫靜置于12 h，期間3次渦旋，離心并吸取上清，過濾，于進樣瓶中備用。

1.3.2 色譜與質(zhì)譜條件

質(zhì)譜與色譜條件參考文獻報道方法[16]。液相條件主要包括：(1)色譜柱：Waters T3 C18(1.8 μm,2.1 mm×100 mm)；(2)流動相：A相為超純水(加入0.1%的甲酸)，B相為乙腈(加入0.1%的甲酸)；(3)洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%，9.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min;(4)流速0.35 ml/min；柱溫40 ℃；進樣量4 μL。質(zhì)譜條件主要包括：三重四極桿(QQQ)掃描是在AB6500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)上獲得的，該系統(tǒng)配備了ESI Turbo離子噴霧接口，可由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制運行正負兩種離子模式。ESI源操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓(IS)5 500 V(正離子模式)/-4 500 V(負離子模式)；離子源氣體I(GSI)，氣體II(GSII)和簾氣(CUR)分別設(shè)置為50、60和25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在QQQ模式下分別用10 μmol/L聚丙二醇溶液進行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準。QQQ掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體(氮氣)設(shè)置為中等。通過進一步的DP和CE優(yōu)化，完成了各個MRM離子對的DP和CE。根據(jù)每個時期內(nèi)洗脫的代謝物，在每個時期監(jiān)測一組特定的MRM離子對。

1.3.3 代謝物定性定量原理

代謝物結(jié)構(gòu)解析參考了MassBank(http://www.massbank.jp/)、KNAPSAcK(http://kanaya.naist.jp/KNApSAcK/)、HMDB(http://www.hmdb.ca/)、MoToDB(http://www.ab.wur.nl/moto/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/index.php)、MWDB(metware database)等質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。代謝物定量是利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)分析完成。MRM模式中，四級桿首先篩選目標物質(zhì)的前體離子(母離子)，排除掉其他分子量物質(zhì)對應(yīng)的離子以初步排除干擾；前體離子經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子，排除非目標離子干擾，使定量更為精確，重復(fù)性更好。為了比較所檢測到代謝物的含量差異，對檢測到的每個代謝物的質(zhì)譜峰進行校正。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進行積分校正[17]。

1.3.4 陳皮附著微生物的高通量測序方法

采用口腔拭子基因組的取樣方式，使用無菌棉簽在橘皮表面擦拭，以擦拭面積計5 cm×5 cm用20根棉簽，擦拭完后用剪刀將棉簽部分從其桿上剪下，采用CTAB法對其基因組DNA進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至10-6g/L。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。引物對應(yīng)區(qū)域ITS5-1737F和ITS2-2043R。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：Phusion Master Mix(2×)15 μL，正反引物(2 μmol/L)各1.5 μL，gDNA(1 mg/L)10 μL，H2O 2 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用膠回收。使用TruSeq?DNAPCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq 2500 PE250進行上機測序[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去barcode和引物序列后使用FLASH v1.2.7對每個樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列為原始tags數(shù)據(jù)(raw tags)，Raw tags經(jīng)過濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(clean tags)。參照QIIME v1.7.0對Tags進行質(zhì)量控制，將處理后得到的Tags序列通過UCHIME algorithm與數(shù)據(jù)庫unite database進行比對檢測嵌合體序列，去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(effective tags)。利用UPARSE v7.0.1001軟件對所有樣品的全部effective tags進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成OTUs(operational taxonomic units)，同時選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選出OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。用QIIME軟件中的BLAST方法與Unit數(shù)據(jù)庫對OTUs代表序列進行物種注釋分析，并分別在各個分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成。以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標準對各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性分析是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。使QIIME軟件計算observed-species、Chao1、Shannon、Simpson、Ace和 goods-coverage指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中次生代謝產(chǎn)物的鑒定

經(jīng)過分析本文共鑒定出386種次生代謝產(chǎn)物，包括酚酸類79種，黃酮類143種，蒽醌類4種，木脂素與香豆素17種，鞣質(zhì)3種，生物堿47種，萜類6種，其他類87種。代謝物含量數(shù)據(jù)采用極差法進行歸一化處理，通過R軟件(www.r-project.org/)，對代謝物在不同樣本間的積累模式進行聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)。通過聚類分析(圖1a)圖可知，貯藏一年廣陳皮樣品與貯藏3年廣陳皮樣品存在明顯次生代謝物差異，不同貯藏年份樣品次生代謝物變化較大；貯藏1年樣品與貯藏3年樣品分別聚為一類，可以明顯區(qū)分。從熱圖可以判斷，廣陳皮在陳化的過程中次生代謝物變化較大，貯藏3年廣陳皮次生代謝物相對含量普遍高于貯藏1年樣品，且相對含量較高的次生代謝物數(shù)量占優(yōu)。

圖1 陳化1年與陳化3年廣陳皮樣品次生代謝物聚類熱圖(a)、主成分分析三維圖(b)、正交偏最小二乘判別分析(c)與差異代謝物火山圖(d)

主成分分析方法將次生代謝物的差異通過降維處理以直觀反映樣本之間的代謝物差異情況。圖1b中可以看出，主成分PC1、PC2與PC3的占比分別達到了59.62%、13.62%和12.61%，積累貢獻率達到了85.85%。貯藏1年樣品與貯藏3年樣品分別聚為一類，可明顯區(qū)分，實驗結(jié)果與聚類分析一致；正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)被廣泛用于代謝組數(shù)據(jù)的分析，由于其分析方法可以最大化組間差異常被用于差異代謝物的篩選。在OPLS-DA分析中，Q2是一個重要的參數(shù)，若數(shù)值大于0.9，則可以反映該模型的可靠性與穩(wěn)定性。圖1c中可以看出，貯藏1年樣品與貯藏3年樣品比較組OPLS-DA模型中Q2分別為0.999，其數(shù)值大于0.90，證實該模型可以用以下一步的差異代謝物分析。

2.2 樣品中差異代謝產(chǎn)物的篩選

本文結(jié)合單變量分析的差異倍數(shù)值(fold change)與多變量分析OPLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in project，VIP)數(shù)值進行樣品之間的差異代謝物篩選。篩選標準為選取fold change≥2或fold change≤0.5和VIP≥1的差異代謝物，即代謝物在組間差異為2倍以上或0.5倍以下以及VIP≥1，則認為差異顯著。結(jié)果表明，貯藏1年樣品與貯藏3年樣品比較組共計篩選出79種差異代謝物，從圖1d中可以看出，上調(diào)化合物40種，下調(diào)化合物39種。為進一步了解貯藏1年樣品與貯藏3年樣品比較組次生代謝物含量變化差異較大物質(zhì)，篩選了差異代謝物相對含量變化前二十的化合物(見表1)，其中相對含量上調(diào)化合物10種，相對含量下調(diào)化合物10種，如：3′,4′,7-三羥基黃酮、兒茶素、檸檬素、槲皮素-O-蕓香苷-己糖等黃酮類化合物具有顯著的藥理活性，可作為廣陳皮品質(zhì)相關(guān)代謝物的潛在質(zhì)量標志物。圖2可直觀反應(yīng)出各化合物相對含量的變化趨勢。

表1 陳化1年與陳化3年廣陳皮次生代謝物差異變化前20的化合物

圖2 陳化1年與陳化3年廣陳皮樣品次生代謝物差異變化前二十的化合物條形圖

2.3 廣陳皮附著微生物的高通量測序結(jié)果

利用Illumina HiSeq測序平臺得到下機數(shù)據(jù)raw PE后進行拼接和質(zhì)控，得到clean tags，再進行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)，即effective tags。對effective tags進行聚類，以97%的一致性(identity)將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，然后對OTUs的代表序列進行物種注釋。將OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫進行比對可得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，進而在各水平統(tǒng)計各樣品群落組成。從圖3陳皮附著微生物屬水平物種分布圖可以看出，貯藏1年樣品與貯藏3年樣品微生物分布差異較大。

圖3 陳皮附著微生物屬水平物種分布圖

Alpha多樣性用于分析樣品內(nèi)(within-community)的微生物群落多樣性，通過單樣本的多樣性分析可以反映樣品內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性，對分析指數(shù)Shannon、Simpson、Chao1、Ace、Coverage進行統(tǒng)計，Coverage指各樣本測序覆蓋率，值越高，則樣本中序列被檢出的概率越大，而沒有被檢出的概率越小，直接代表樣本測序結(jié)果的真實性[19]。由表2結(jié)果可知，所有樣本Coverage均高于0.999 0，說明測序?qū)颖局姓婢母采w率高、測序深度適合，可滿足樣本中真菌多樣性分析的需要。Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度(community evenness)的影響。相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高[20]。物種豐富度以Ace指數(shù)為評價指標，貯藏1年樣品物種豐富度高于貯藏3年樣品；綜合Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)兩個指標，貯藏3年樣品物種多樣性高于貯藏1年樣品。結(jié)果表明，廣陳皮在貯藏1～3年過程中，微生物物種數(shù)量逐漸減少，優(yōu)勢微生物菌落逐漸形成。如青霉屬、曲霉屬、耐干霉菌等。

表2 Alpha多樣性指數(shù)值統(tǒng)計值

2.4 差異代謝物與差異微生物的相關(guān)性分析

對貯藏1年樣品與貯藏3年樣品比較組檢測到的差異微生物(P<0.05)和差異代謝物進行相關(guān)性分析，計算微生物和代謝物的Spearman相關(guān)系數(shù)，通過相關(guān)性熱圖展示每個差異分組里差異微生物在種水平上與差異代謝物的相關(guān)性情況(見圖4)。從圖中可以看出，青霉屬、曲霉屬、耐干霉屬等真菌對樣品中的黃酮類成分以及有香味化合物的相對含量有顯著的影響，且每種真菌與多種代謝物含量變化相關(guān)，其中雙孢旱霉(Xeromycesbisporus)可以同時影響27種化合物的相對含量變化，包括桔皮素、香草醛等陳皮中的活性成分及香氣成分相對含量上調(diào)，也有松柏苷等成分相對含量下調(diào)。差異微生物對次生代謝物相對含量的影響可能與廣陳皮陳化的科學(xué)內(nèi)涵密切相關(guān)。

圖4 陳化1年與陳化3年廣陳皮差異代謝物與差異微生物的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品的收集

本實驗所用實驗樣品為同一產(chǎn)地、同一批次、不同貯藏年份的標準倉儲陳皮。標準倉儲為產(chǎn)地原位倉儲，季節(jié)性定期管理，并記錄倉儲溫濕度變化，是一種良好的樣品可追溯收集辦法，可避免受環(huán)境以及年份不準確的影響。

3.2 次生代謝產(chǎn)物的分析

代謝組學(xué)技術(shù)可全面科學(xué)地分析中藥整體化學(xué)成分，已經(jīng)在中藥品種品質(zhì)評價中廣泛應(yīng)用，如：人參[21]、黃芩[22]、白芷[23]、赤芍與白芍[24]等。本文通過廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)，從整體檢測了貯藏1年與貯藏3年廣陳皮中的次生代謝產(chǎn)物，PCA分析、OPLS-DA分析與熱圖分析均可明顯區(qū)分不同年份樣品，綜合化合物保留時間、特征離子(Q1與Q3)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫共檢索出386種次生代謝產(chǎn)物，包括酚酸類79種，黃酮類143種，蒽醌類4種，木脂素與香豆素17種，鞣質(zhì)3種，生物堿47種，萜類6種，其他類87種。與傳統(tǒng)高效液相色譜技術(shù)(HPLC)以及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)相比，具有鑒定化合物數(shù)量多的優(yōu)勢，可整體反映廣陳皮次生代謝物譜。為確保每個化合物的相對含量準確無誤，本實驗在獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進行積分校正。本實驗參考臨床與藥理實驗設(shè)計方法，以貯藏1年廣陳皮為對照組，貯藏3年廣陳皮樣品為實驗組，選取fold change≥2或fold change≤0.5和VIP≥1的差異代謝物，即代謝物在組間差異為2倍以上或0.5倍以下以及VIP≥1，則認為差異顯著，結(jié)果共篩選出79種差異代謝物，其中差異上調(diào)且相對含量排名靠前的化合物可認為為廣陳皮的品質(zhì)相關(guān)代謝物。從陳化1年與陳化3年廣陳皮次生代謝物差異變化前二十的化合物中，上調(diào)的化合物分別為：3,5-二羥基-3-甲基戊酸、5,7-二羥基-1(3H)-異苯并呋喃-酮、芥子醇、對羥基苯甲酰酒石酸、3′,4′,7-三羥基黃酮、兒茶素、檸檬素、雙脫氫百部新堿B、槲皮素-O-蕓香苷-己糖和C-己糖基-金圣草黃素-O-芥子酰己糖苷，其中兒茶素、檸檬素、3′,4′,7-三羥基黃酮具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗癌等功效，均可作為潛在的品質(zhì)評價標志性化合物。中藥治療疾病具有多成分、多靶點、多通路的特點[25]，如何在眾多成分中篩選出治療疾病的靶點成分是中藥品質(zhì)評價與質(zhì)量控制的關(guān)鍵，其中小分子化合物數(shù)據(jù)預(yù)測、血清藥物化學(xué)、植物代謝組學(xué)等方法應(yīng)用較為廣泛，本實驗結(jié)果表明，在合理分組的前提下，采用基于UPLC-ESI-MS/MS廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)可高效篩選廣陳皮品質(zhì)相關(guān)代謝物，但篩選化合物活性還需要進一步結(jié)合廣陳皮傳統(tǒng)功效進行驗證。

3.3 陳皮的陳化機制

傳統(tǒng)認為陳皮“陳久者良”，已報道文獻普遍認為陳皮在陳化過程中，微生物的代謝轉(zhuǎn)化作用于陳皮中的化學(xué)成分，從而促進活性成分的積累，進而達到陳久者良的目的，同時該結(jié)果與已報道陳久陳皮總黃酮含量增加相一致。本文對代謝組檢測出的差異代謝物和高通量測序比對出的差異微生物進行相關(guān)性分析，結(jié)果也證實，優(yōu)勢菌屬微生物確實可顯著影響廣陳皮中的活性成分，如曲霉屬、青霉屬、耐干霉屬等真菌，與文獻報道一致。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，廣陳皮在陳化過程中，表面附著優(yōu)勢微生物類群在不斷的演變，隨著陳化時間的增加，優(yōu)勢微生物從以平臍疣孢屬(Zasmidium)、枝孢屬(Cladosporium)、Symmetrospora、鐮刀菌屬(Fusarium)為優(yōu)勢轉(zhuǎn)變?yōu)橐灾︽邔?Cladosporium)、短梗霉屬(Aureobasidium)、曲霉菌屬(Aspergillus)、耐干霉屬(Xeromyces)為主，如貯藏1年與貯藏3年樣品間的一種差異微生物雙孢旱霉(Xeromycesbisporus)為一種在較低水分活度條件下仍可存活的微生物[26]，可以適應(yīng)極低水分活度(0.61)生活環(huán)境，這與陳化年份較久的陳皮極為干燥情況較為吻合。同時實驗結(jié)果表明，枝孢屬、短梗霉屬、曲霉菌屬以及耐干霉屬等差異微生物可同時影響桔皮素、香草酸、松柏苷以及酸類成分等多種活性成分與香氣成分的相對含量。因此，綜合判斷可以得知：廣陳皮樣品中的差異微生物一方面可以促進活性成分桔皮素等黃酮類成分相對含量的增加，同時也可以改變香氣類成分相對含量的增加或減少而調(diào)節(jié)廣陳皮的氣味。因此，陳皮“陳久者良”的科學(xué)內(nèi)涵可能與差異微生物對次生代謝物相對含量的影響密切相關(guān)。