網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對乳增寧膠囊治療乳腺增生作用機制研究

張好科　付兆媛　賈永翠

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);乳增寧膠囊;乳腺增生;HE染色

中圖分類號：R285 文獻標(biāo)志碼：A

乳腺增生[1]（Hyperplasia of mammary glands，HMG）是乳腺正常發(fā)育和退化過程失常導(dǎo)致的一種良性乳腺疾病，病變主要發(fā)生在乳腺導(dǎo)管和小葉。研究發(fā)現(xiàn)HMG 好發(fā)于25～45歲女性，其中大城市職業(yè)婦女占據(jù)50%～70%，并且本病極容易復(fù)發(fā)，癌變率為2%～4%[2-4]。2013年貴州省[5]進行女性乳腺疾病篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在38256人中患有HMG的達6075人，占良性乳腺疾病86. 28%，可見HMG是現(xiàn)代女性較常見的多發(fā)病之一，對女性的身心健康影響較大。HMG 病因尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)下丘腦—垂體—卵巢—乳房內(nèi)分泌軸平衡失調(diào)，特別是雌激素分泌增加、孕激素分泌減少是主要病因[4，6]。目前HMG 的治療主要以激素與手術(shù)治療為主，但是由于激素受體在機體廣泛分布的原因，使現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療手段存在較多副作用，所以促使尋找新的治療方法勢在必行。

中醫(yī)認(rèn)為，HMG 歸屬于[7-8]“乳中結(jié)核”、“乳核”、“乳內(nèi)硬腫”、“乳癖”等范疇，發(fā)病與肝、脾、腎的關(guān)系最為密切。中醫(yī)以整體觀念和辨證論治為指導(dǎo)思想，通過對機體的整體調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用，從而發(fā)揮臨床療效。乳增寧膠囊由艾葉、淫羊藿、天冬、柴胡、川楝子、土貝母6 味中藥組成，主要功能疏肝理氣，活血化瘀，調(diào)理沖任。藥理研究發(fā)現(xiàn)[9]乳增寧膠囊的主要成分有淫羊藿苷、土貝母苷甲、土貝母苷乙、土貝母苷丙、棕矢車菊素、異澤蘭黃素、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 等。研究發(fā)現(xiàn)[10]淫羊藿苷具有雌激素活性;土貝母苷甲具有顯著的抗腫瘤作用;柴胡皂苷- d[11]有可能抑制乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。臨床研究發(fā)現(xiàn)乳增寧膠囊對MHG具有顯著療效，并且不良反應(yīng)少。然而乳增寧膠囊因其復(fù)雜化學(xué)系統(tǒng)和生物系統(tǒng)之間相互作用使其臨床應(yīng)用受到限制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[12]是揭示中藥復(fù)方多成分、多途徑、多靶點療效模式的重要方法，其與中醫(yī)的辨證論治思想不謀而合，為探索中藥復(fù)方的靶標(biāo)提供了可能。因此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討乳增寧膠囊對HMG 的作用機制并結(jié)合動物實驗對其療效進行驗證。

1資料與方法

1.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1乳增寧膠囊藥物活性成分及靶點的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺（Tradition?al Chinese Medicine Systems Pharmacology Database andAnalysis Plat- form，TCMSP）中逐此次輸入關(guān)鍵字艾葉、淫羊藿、天冬、柴胡、川楝子、土貝母檢索6 味中藥的活性成分，并以口服生物利用度（OB≥30%）與類藥性DL≥0.18 為篩查條件。采用篩選藥物活性成分的分子編碼，進行檢索藥物活性成分相關(guān)靶標(biāo)。

1.1.2 HMG 疾病靶點的篩選

采用GeneCard數(shù)據(jù)庫檢索框輸入關(guān)鍵詞hyper?plasia of mammary glands 檢索HMG 相關(guān)靶點。

1.1.3藥物活性成分與疾病共同靶點的篩選及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運用Perl語言篩選藥物活性成分與HMG 疾病的共同靶點，并繪制韋恩圖;在線采用STRING與Cyto?scape 3.7.2軟件制作共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），最低相互作用閾值設(shè)為“highest confidence”（>0. 7），“節(jié)點（node）”代表不同靶點，“邊（edge）”代表不同靶點之間的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.1.4藥物活性成分與疾病靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建藥物活性成分與疾病靶點互作網(wǎng)絡(luò)，“節(jié)點（node）”代表不同疾病靶點、藥物活性成分，“邊（edge）”代表疾病靶點與藥物活性成分之間的相互作用關(guān)系。

1.1.5 GO分析與KEGG富集分析

采用R編程語言對藥物活性成分與疾病共同靶點進行GO分析與KEGG富集分析，并采用Cytoscape 3.7.2軟件對靶點集進行相關(guān)性計算，構(gòu)建富集通路與靶點互作網(wǎng)絡(luò)，確定核心靶點，對核心靶點進行實驗驗證。

1.2動物實驗

1.2.1藥物及試劑準(zhǔn)備

乳增寧膠囊（陜西健民制藥有限公司，規(guī)格：0.5mg×36粒，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20044180，）購自生產(chǎn)批號Z10950011;他莫昔芬（揚子江藥業(yè)集團有限公司，規(guī)格：10mg×60片，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H32021472）;雌性Wistar 大鼠（200±5g）（許可編號：SCXK-（A）2012-0004）購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.2.2造模與分組

動物在SPF 實驗室中飼養(yǎng)（飼養(yǎng)條件：12：12h，光照：黑暗;溫度：25±2 °C;濕度：50±10%）。適應(yīng)后7d，將24 只Wistar大鼠隨機分為4 組（正常組、模型組、他莫昔芬組、乳增寧膠囊組），每組6 只。本研究采用依次腹腔注射雌激素（0.5mg /kg /d）25d，孕激素（5mg/kg /d）5d的方法建立HMG 動物模型[13]。模型組、陽性對照組、藥物干預(yù)組動物均采用上述造模方法建立HMG動物模型。藥物干預(yù)期間正常組和模型組接受與藥物組相同體積的生理鹽水灌胃;他莫昔芬組動物接受他莫昔芬4 mg / kg /d灌胃治療;乳增寧膠囊組動物接受乳增寧膠囊0.6 g/kg/d 灌胃給藥。

1.2.3病理組織切片

本研究采集所有大鼠左側(cè)第二個乳腺通過HE染色方法評價乳腺增生的程度及乳增寧膠囊的干預(yù)效果。HE染色切片的制作主要步驟如下：用10% 的馬林固定24h，轉(zhuǎn)移至70% 的乙醇中并石蠟包埋處理，組織切片厚度為4μm，用蘇木精/伊紅進行染色。

2結(jié)果

2.1乳增寧膠囊活性成分、靶點及HMG 靶點的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)平臺共檢索到乳增寧膠囊生物活性成分81個、藥物作用相關(guān)靶點共1314個，經(jīng)去重之后得到76個生物活性成分、242個作用靶點;在Gene?Card數(shù)據(jù)平臺以“score≥10為篩查條件”共檢索到HMG相關(guān)人類基因665個，然后采用Perl語言篩選出乳增寧膠囊與HMG共同靶點99個，并以韋恩圖的形式展示，如圖1，作用于疾病靶點的藥物活性成分有30個;并采用STRING+Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建共同靶點之間互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（PPI），結(jié)果共得到99個節(jié)點、842條邊，如圖2。

2.2藥物活性成分與疾病靶點互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物活性成分與疾病靶點互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，共得到129個節(jié)點（30個藥物活性成分、99個疾病靶點）、272條邊，如圖3。

2.3 GO生物過程與KEGG信號通路富集分析

采用R編程語言對乳增寧膠囊有效成分與HMG的共同靶點進行GO與KEGG富集分析，得出GO富集分析前20 個相關(guān)靶點的生物學(xué)過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）富集，結(jié)果以氣泡圖形式呈現(xiàn)，如圖4、5、6。排名前5 的生物學(xué)過程分別是對金屬離子的反應(yīng)（response to metal ion）、對類固醇激素的反應(yīng)（response to steroid hormone）、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)（re?sponse to oxidative stress）、對細胞氧化應(yīng)激的反應(yīng)（cel?lular response to oxidative stress）、對輻射的反應(yīng)（re?sponse to radiation）。KEGG 富集分析得到前20個富集通路，主要有PI3K-Akt 信號通路（PI3K?Akt signalingpathway，PI3K/AKT）、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma- associated herpesvirus infection，KSHV）、乙型肝炎（Hepatitis B，HB）、人巨細胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection，HCMV）、癌癥中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）等，結(jié)果以氣泡圖形式呈現(xiàn)，如圖7;并將富集通路與蛋白結(jié)果導(dǎo)入Cyto?scape 3.7.2軟件繪制富集通路與蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要核心蛋白有絲裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1），PKB蛋白激酶1（AKT1）和細胞周期蛋白（CCND1）等，如圖8。

2.4HE染色

HE染色鏡下見，空白組大鼠乳腺導(dǎo)管走形規(guī)則，管壁光滑，管腔內(nèi)未見異常分泌物堵塞，導(dǎo)管上皮細胞排列均勻、無水腫，乳腺小葉分裂較少，腺泡數(shù)目少且體積較小;模型組大鼠乳腺導(dǎo)管明顯增多并擴張，管壁粗糙、增生，管腔內(nèi)可見異常分泌物增多，導(dǎo)管上皮細胞排列紊亂、水腫明顯、呈多層分布，腺泡體積增大、數(shù)目增多，乳腺小葉分裂明顯，呈現(xiàn)出典型的乳腺增生病理改變;陽性對照組乳腺導(dǎo)管走形基本規(guī)則，管壁較為光滑，管腔內(nèi)可見少許異常分泌物堆積，導(dǎo)管上皮細胞排列較均勻、無水腫，基本呈現(xiàn)單層分布，乳腺小葉分裂不明顯，腺泡數(shù)目及體積與正常組相當(dāng);乳增寧膠囊組腺泡上皮呈分泌狀，被覆單層立方或扁平上皮，排列略紊亂，導(dǎo)管輕度擴張，管壁較為光滑，腔內(nèi)少許分泌物，腺泡體積與模型組相比明顯縮小、數(shù)目與正常組相當(dāng)，如圖9。

3討論

近年HMG[14]發(fā)生率越開越高，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病發(fā)病與內(nèi)分泌的失調(diào)，特別是與雌孕激素比例失調(diào)相關(guān)，但是總體而言，HMG發(fā)病機制尚不清楚，故對乳腺增生的治療也是一個棘手問題。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為乳腺增生的主要病因病機在肝郁脾虛與沖任不調(diào)兩方面。肝主疏泄，性喜調(diào)達而惡抑郁，情志不遂，憂郁憤怒，則肝氣郁結(jié)，氣機阻滯，氣滯則血瘀;脾主運化，脾氣健則運化強，脾失健運則水濕失運，痰濁內(nèi)生，血瘀與痰濁凝結(jié)于乳房而發(fā);腎主生長發(fā)育、沖脈為氣血之海、任主胞胎，生育、流產(chǎn)等傷及沖任，則肝血不足，氣血凝滯，日久而發(fā)[15-18]。臨床研究[19-21]發(fā)現(xiàn)乳增寧膠囊對乳腺增生具有顯著的改善作用。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在乳增寧膠囊與HMG的“藥物有效成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系”發(fā)現(xiàn)二者具有潛在的相關(guān)性，主要活性成分有β-谷固醇、豆甾醇、槲皮素、山萘酚、乙酸亞油酯等。通過GO分析發(fā)現(xiàn)乳增寧膠囊通過調(diào)控乳腺增生對金屬離子、類固醇激素、氧化應(yīng)激、細胞氧化應(yīng)激、輻射的反應(yīng)等生物學(xué)過程，發(fā)揮抗乳腺增生的效應(yīng)，同時在氧化應(yīng)激反應(yīng)的生物學(xué)過程中參與的多大30 個，可見氧化應(yīng)激在HMG的發(fā)生發(fā)展過程中具有重大作用。

通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)乳增寧膠囊抗乳腺增生作用的通路主要包括PI3K/AKT、KSHV、HB、HCMV、癌癥中的蛋白多糖等信號通路，并且在PI3K/AKT信號通路富集的蛋白多達30個。研究發(fā)現(xiàn)[22] PI3K/AKT信號通路可被多種有絲分裂刺激信號活化，最終在癌變過程中扮演重要角色;HCMV 參與細胞周期的調(diào)節(jié)，能引起DNA 突變、抑制免疫應(yīng)答和腫瘤抑制性蛋白的功能，并且許多證據(jù)表明HCMV與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有潛在聯(lián)系;本研究通過KEGG 富集分析結(jié)果通路與蛋白互作關(guān)系發(fā)現(xiàn)主要核心蛋白包括MAPK1、AKT1、CCND1 等[23-24]。MAPK1在乳腺癌患者中呈現(xiàn)高表達，通過下調(diào)MAPK1 的表達可調(diào)控人乳腺癌MCF-7 細胞增殖和凋亡;AKT1對乳腺癌細胞遷移具有負(fù)性調(diào)控的作用[25-26];CCND1在良性乳腺疾病及乳腺癌中呈現(xiàn)高表達，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[27]。通過HE染色方法對乳腺組織增生情況進行評價，發(fā)現(xiàn)乳增寧膠囊組動物乳腺組織增生明顯抑制，提示乳增寧膠囊治療乳腺增生有明顯作用。

乳增寧膠囊可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等途徑從而明顯抑制乳腺組織增生，本研究為揭示乳增寧膠囊臨床治療HMG的分子機制提供了重要參考依據(jù)。