高效液相色譜法測(cè)定糕點(diǎn)中脫氫乙酸的不確定度評(píng)定

黃潮 劉婷

摘 要：目的：通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定市售糕點(diǎn)中脫氫乙酸，對(duì)不確定度的來(lái)源和影響因素進(jìn)行全面分析。方法：根據(jù)脫氫乙酸測(cè)定過(guò)程，構(gòu)建數(shù)學(xué)模型展開(kāi)分析，確定測(cè)定過(guò)程不確定度的主要來(lái)源。結(jié)果：合成不確定度為 2.436 75 mg·kg-1，擴(kuò)展不確定度為 4.873 5 mg·kg-1。結(jié)論：儀器穩(wěn)定性、前處理過(guò)程及稱量過(guò)程是不確定度的主要來(lái)源，測(cè)定過(guò)程中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；脫氫乙酸；不確定度

Evaluation of Uncertainty in the Determination of Dehydroacetic Acid in Cakes by High Performance Liquid Chromatography

HUANG Chao， LIU Ting

（Pingxiang Municipal Food and Drug Inspection Institute， Pingxiang 337000， China）

Abstract： Objective： Determination of dehydroacetic acid in commercial cakes by high performance liquid chromatography， and a comprehensive analysis of the sources and influencing factors of uncertainty. Method： According to the determination process of dehydroacetic acid， a mathematical model was constructed to carry out analysis to determine the main source of uncertainty in the determination process. Result： The combined uncertainty was 2.436 75 mg·kg-1， and the expanded uncertainty was 4.873 5 mg·kg-1. Conclusion： The instrument stability， pretreatment process and weighing process are the main sources of uncertainty and should be focused on in the determination process.

Keywords： high performance liquid chromatography; dehydroacetic acid; uncertainty

糕點(diǎn)的主要原料有谷類、薯類、豆類、糖、蛋和油脂等，經(jīng)過(guò)一系列調(diào)制、烹制，這些原料最終成為美味的食物。為了獲得更好的口感，人們?cè)谑熘聘恻c(diǎn)前后還經(jīng)常向糕點(diǎn)中添加果醬、牛奶、可可與奶油等材料。

脫氫乙酸是當(dāng)下較為常見(jiàn)的一種食品防霉防腐保鮮劑。目前，該材料的安全性已經(jīng)被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織認(rèn)可。這種物質(zhì)能夠在水溶液中逐步降解，且在這一過(guò)程中產(chǎn)生抑制與延緩肝癌的作用。即便是人體皮膚長(zhǎng)期接觸這一物質(zhì)，也不會(huì)產(chǎn)生損傷。在實(shí)際應(yīng)用中，這一物質(zhì)并不會(huì)影響食物的口感，因此該物質(zhì)常常被應(yīng)用到糕點(diǎn)制作中[1]。脫氫乙酸以固態(tài)形式最為常見(jiàn)，呈無(wú)色結(jié)晶或淡黃色粉末，是一種低毒、高效的防腐、防霉劑。在酸、堿條件下均有一定的抗菌作用，尤其對(duì)霉菌的抑制作用最強(qiáng)，其化學(xué)名稱為3-乙?；?6-甲基-脫（2），4-脫（3）氫二酮，分子式為C8H8O4。根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中規(guī)定糕點(diǎn)的脫氫乙酸最大使用量為0.5 g·kg-1（以脫氫乙酸計(jì)）。新國(guó)標(biāo)GB 5009.121—2016中指出應(yīng)用于食品領(lǐng)域的脫氫乙酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)于2017年3月1日代替《食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB/T 5009.121—2003）規(guī)定脫氫乙酸檢測(cè)方法第一法為氣相色譜法，第二法為液相色譜法。本文采用第二法高效液相法測(cè)定糕點(diǎn)中脫氫乙酸的含量，利用氫氧化鈉溶液將試樣內(nèi)所含的脫氫乙酸提取出來(lái)，并采用脫脂與去蛋白的處理措施，過(guò)膜后借助紫外或二極管陣列檢測(cè)器的高效液相色譜儀加以測(cè)定，根據(jù)色譜峰的留存時(shí)長(zhǎng)來(lái)定性，運(yùn)用外標(biāo)法來(lái)進(jìn)行定量。

由于脫氫乙酸的使用廣泛，檢測(cè)過(guò)程中遇到的問(wèn)題也越來(lái)越多。如果檢測(cè)結(jié)果接近國(guó)家規(guī)定限量值，會(huì)對(duì)判斷樣品的合格性帶來(lái)困擾。在這種狀況下，明確檢測(cè)結(jié)果的不確定度非常關(guān)鍵。不確定度是一種直接與測(cè)量結(jié)果相關(guān)的參數(shù)，能夠呈現(xiàn)出被測(cè)出量值的分散度。依據(jù)《檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評(píng)價(jià) 檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)通用要求》（RB/T 214—2017）內(nèi)的相關(guān)內(nèi)容可知，檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)該構(gòu)建起數(shù)學(xué)模型，并給出與其自身檢驗(yàn)檢測(cè)能力相對(duì)等的評(píng)定測(cè)量不確定度案例[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市面上銷售的包裝寫(xiě)有脫氫乙酸的糕點(diǎn)12份，樣品編號(hào)為1—12；甲醇（CH4O），色譜純；乙酸銨（C2H6O2N），優(yōu)級(jí)純；氫氧化鈉（NaOH），分析純；正己烷（C6H14），分析純；甲酸（CH2O2），分析純；硫酸鋅（ZnSO4·7H2O），分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司；分析天平（感量為0.1 mg和1 mg）；粉碎機(jī)；不銹鋼高速均質(zhì)器；超聲波清洗器（功率35 kW）；渦旋混合器；離心機(jī)（轉(zhuǎn)速＞4 000 r·min-1）；pH計(jì)；C18固相萃取柱：500 mg，6 mL（使用前用5 mL甲醇、10 mL水活化，使柱子保持濕潤(rùn)狀態(tài)）。

1.3 檢測(cè)方法[3]

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）測(cè)定糕點(diǎn)中脫氫乙酸的含量。樣品參照第二法液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[3]。

1.3.1 樣品制備

糕點(diǎn)用粉碎機(jī)制成粉末。

1.3.2 脫氫乙酸提取

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）第二法液相色譜法12.1.3面包、糕點(diǎn)、焙烤食品餡料、復(fù)合調(diào)味料測(cè)定，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）脫氫乙酸（1.0 mg·mL-1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品精密（精確至0.000 1 g）稱取0.100 0 g于100 mL容量瓶中，用10 mL氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）溶解，用水定容。4 ℃保存，3個(gè)月有效。

（2）脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別吸取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL和10.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，配制成濃度分別為1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存，1個(gè)月有效。

1.4 數(shù)學(xué)模型

脫氫乙酸含量的計(jì)算公式為

（1）

式中：x為試樣中脫氫乙酸的含量，g·kg-1；v為最終定容的體積，mL；c1為試樣溶液內(nèi)含脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；c0為空白試樣內(nèi)含脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；m為樣品質(zhì)量，g；f為過(guò)固相萃取柱換算系數(shù)（f=0.5）。

計(jì)算結(jié)果以重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值標(biāo)識(shí)，計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析不確定度的來(lái)源

通過(guò)測(cè)量及建模分析可知，對(duì)脫氫乙酸含量測(cè)定的不確定度產(chǎn)生影響的因素主要有以下幾個(gè)方面[4]。①前期對(duì)影響因子進(jìn)行處理時(shí)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（ f ），如測(cè)量過(guò)程中儀器自身的不穩(wěn)定性、前期處理時(shí)或其他方面產(chǎn)生的影響。②實(shí)驗(yàn)人員標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（c），這是標(biāo)準(zhǔn)曲線的非線性造成的結(jié)果。③體積方面產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（v）。該方面主要包括量具本身的誤差、溫濕度與人員等方面的影響。④質(zhì)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（m）。這一方面主要是由操作人員及天平在測(cè)量質(zhì)量的過(guò)程中造成的結(jié)果。⑤重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（R）。

2.2 計(jì)算不確定度分量

2.2.1 樣品稀釋移取過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（ f ）

（1）器具校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（f1）。25 mL B級(jí)容量瓶定容，該器具的允差應(yīng)控制在

0.06 mL內(nèi)；10 mL A級(jí)單線移液管，該器具的允差應(yīng)控制在0.02 mL內(nèi)，由此可知因量器校準(zhǔn)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

ur（f1）

（2）樣品稀釋移取過(guò)程中人員讀數(shù)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（ f2）。實(shí)驗(yàn)移取過(guò)程中，按照三角分布考慮，液體用量體積v的記錄，當(dāng)實(shí)驗(yàn)操作員讀數(shù)允許約1%的不準(zhǔn)確性（即0.01v），那么每次相對(duì)不確定度為，人員讀數(shù)使用玻璃量器兩次，由實(shí)驗(yàn)員讀數(shù)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur（ f2），因此樣品稀釋移取過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（c）

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（c1）。根據(jù)查閱脫氫乙酸批號(hào)為7700800證書(shū)，脫氫乙酸不確定度為0.5%，按照矩形分布，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur（c1）（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（c2）。查閱電子天平檢定證書(shū)，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）規(guī)定，稱取0.100 0 g脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品的允差應(yīng)在0.000 5 g內(nèi)，考慮均勻分布：u（m1） g，天平的重復(fù)性誤差應(yīng)控制在0.000 1 g內(nèi)，u（m2）=5.77×10-5 g，稱量而產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（c2）==0.000 3。因此，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur（c2）=。

（3）工作曲線配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（c3）工作曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程根據(jù)表1玻璃量器的不確定度[5]均勻分布計(jì)算，移液器不確定度按照正態(tài)分布計(jì)算，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為（4）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中人員讀數(shù)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（c4）。按照三角分布考慮，液體用量體積v的記錄，當(dāng)實(shí)驗(yàn)操作員讀數(shù)允許約1%的不準(zhǔn)確性（即0.01v），那么每次相對(duì)不確定度為0.004 08，共讀數(shù)6次，因此其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（c4）

由于上述標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)引入的4個(gè)不確定度是單獨(dú)存在的，因此標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（P）。以脫氫乙酸濃度c（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線=3.182 692×104×c-

6.147 225×104，R2=0.999 7。對(duì)樣品重復(fù)測(cè)量?jī)纱危瑴y(cè)得脫氫乙酸的濃度為cx=20.33 μg·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

因此，ur（P）

其中，殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差為

離均差平方和

代入上述數(shù)值，得u（P）=1.66。因此，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（P）=0.012。

（6）樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作峰面積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（a）。依據(jù)質(zhì)管科waters高效液相色譜儀的近期檢定證書(shū)可知，其定量重復(fù)性是0.3%，依照三角分布可知，不確定度是u（a）。由于ur（c），ur（a），ur（P）分別為各自不相關(guān)的量，因此由標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.3 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（m）

稱取樣品5.017 8 g，天平最大允差為0 g，天平重復(fù)性誤差為0 g，其不確定度分別為g，

g，稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（m）=

g，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（m）=

2.2.4 定容體積引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（v）

樣品經(jīng)提取凈化后，用1 mL移液器取1 mL流動(dòng)相定容。

（1）定容量器引入的不確定度。1 mL移液器的最大允差為0.002 mL，按均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確度為u（v1）mL

（2）定容量器讀數(shù)引入的不確定度。由上可知，由實(shí)驗(yàn)操作員定容產(chǎn)生的u（v2）=0.004 08 mL，因此 mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（R）

（1）重現(xiàn)性的不確定度。對(duì)樣品進(jìn)行10次平行樣的重復(fù)上機(jī)測(cè)試，測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差及相對(duì)不確定度為

因此，由重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.24/256.5=0.004 8

（2）回收率的不確定度。樣品采取10次平行樣加標(biāo)回收測(cè)試，回收率數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

由表4可知，其平均加標(biāo)回收率為86.03%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.30%。因此，回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度是0.30/86.03=0.003 5。

因此，重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

ur（R）

2.3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成及擴(kuò)展

2.3.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見(jiàn)表5。

2.3.2 擴(kuò)展不確定度評(píng)定

脫氫乙酸含量為256.5 mg·kg-1，則測(cè)量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uc（x）=256.5×0.009 5=2.436 75 mg·kg-1。

擴(kuò)展不確定度可由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子，取置信水平95%，包含因子k=2，可知糕點(diǎn)中脫氫乙酸測(cè)定的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為U=u（x）×k=

4.873 5 mg·kg-1。

2.3.3 測(cè)量不確定度報(bào)告

樣品中脫氫乙酸含量的測(cè)定結(jié)果為（256.5±4.873 5）mg·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

本研究參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）測(cè)定糕點(diǎn)中脫氫乙酸的含量，樣品參照第二法液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，并依據(jù)由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布的《測(cè)量不確定度評(píng)價(jià)與表示》（JJF 1059.1—2012），綜合檢驗(yàn)的各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)與構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型，借助waters高效液相色譜儀對(duì)糕點(diǎn)中脫氫乙酸的結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定，對(duì)不確定影響因素展開(kāi)研究，針對(duì)測(cè)量過(guò)程中多項(xiàng)影響因素帶來(lái)的不確定度展開(kāi)分析與評(píng)價(jià)。在本次研究中涉及的影響因素包括實(shí)驗(yàn)環(huán)境、常用器皿、人員操作、儀器的穩(wěn)定性與精密度等。其中，儀器不穩(wěn)定、前處理和其他因素影響以及稱量過(guò)程中人員和天平是對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的主要方面。因此，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品配制中的準(zhǔn)確性提出更高的要求，質(zhì)管科應(yīng)定期檢定儀器與設(shè)備的精密程度與穩(wěn)定性，以季度為周期核查好相關(guān)內(nèi)容，使儀器能滿足實(shí)驗(yàn)需要。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的一致性，在日常檢驗(yàn)過(guò)程中重視實(shí)驗(yàn)人員的操作能力與操作的規(guī)范性，降低人為操作不佳帶來(lái)的不利影響，從而使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。

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