前房注射角膜內(nèi)皮細(xì)胞治療兔大泡性角膜病變的實(shí)驗(yàn)研究

方逸凡，楊昆昆，李 釗，張世鋒，侯月陽，吳 畏，王麗強(qiáng)，黃一飛

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 眼科，北京 100853

角膜內(nèi)皮細(xì)胞是位于角膜后彈力層的六邊形單層細(xì)胞，通過泵和屏障功能維持角膜正常的水合作用，是維持角膜透明度和發(fā)揮視覺功能必不可少的組織結(jié)構(gòu)[1]。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞不可再生，且會(huì)隨著年齡增長或各種疾病的發(fā)生而丟失，當(dāng)失去代償能力不能維持基質(zhì)水合作用時(shí)，會(huì)導(dǎo)致角膜水腫甚至視力下降，臨床上稱為大泡性角膜病變[2]。角膜移植是治療大泡性角膜病變的唯一方式，但移植手術(shù)對技術(shù)要求較高，加之供體來源有限，導(dǎo)致其難以大量開展[3-4]。近年有研究采用前房注射培養(yǎng)原代角膜內(nèi)皮細(xì)胞(corneal endothelial cell，CEC)治療大泡性角膜病變，在5 年的隨訪中(10例/11例)取得良好臨床效果，簡化手術(shù)步驟同時(shí)充分利用供體角膜，為治療此疾病提供了里程碑式的技術(shù)手段[5-8]。以往機(jī)械刮除法將角膜內(nèi)皮和后彈力層一起去除，造成角膜內(nèi)皮細(xì)胞前房注射治療效果差異大，難以評價(jià)種子細(xì)胞的療效[9]。本研究改良動(dòng)物模型的制備方法，僅去除內(nèi)皮組織而不損傷后彈力層，并通過前房注射細(xì)胞的方式進(jìn)行治療，以期為前房注射療法的臨床轉(zhuǎn)化提供臨床前研究數(shù)據(jù)和均一穩(wěn)定的動(dòng)物模型。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用雄性新西蘭白兔21只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號：SCXK(京)2020-0002]，飼養(yǎng)于溫度23℃，濕度40%，12 h光照/黑暗交替環(huán)境中，活體動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)操作均在8：00 - 17：00進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過程符合美國視覺與眼科學(xué)研究協(xié)會(huì)(ARVO)制定的規(guī)范，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(2021-X17-27)。

2 主要試劑和儀器 淚道引流管(山東福瑞達(dá)醫(yī)療器械有限公司)；1 mL和20 mL注射器(山東威高)；鹽酸賽拉嗪注射液(吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司)；鹽酸咪達(dá)唑侖注射液(恩華)；醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠(博士倫 愛維)；肝素鈉注射液(山東省惠諾藥業(yè)有限公司)；胎牛血清(Gibco)；高糖DMEM培養(yǎng)基(Corning)；青鏈霉素(Gibco)；膠原酶Ⅰ(Sigma)；ZO-1抗體(invitrogen#33-9100)；硫酸慶大霉素注射液(辰欣藥業(yè)有限公司)；鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天藥業(yè))；妥布霉素地塞米松滴眼液(NOVARTIS)；0.4%錐蟲藍(lán)染液(Gibco)；茜素紅(sigma)；15°角膜穿刺刀(TRIMMER)；手術(shù)顯微鏡(Leica)；前節(jié)OCT(Carl Zeiss Visante OCT,Germany)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS Ⅸ53)；光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX53)。自行制備內(nèi)皮刮除器械：在現(xiàn)有淚道沖洗器上基礎(chǔ)上，將淚道探針尾部硅膠管移動(dòng)至頂端并超出2 mm作為內(nèi)皮刮除的工作部；去除多余硅膠管，不銹鋼探針在距頂端2.5 cm處反折135°，尾部包繞在注射器針筒上，各連接部位依次固定(圖1)。

圖1 內(nèi)皮刮除器械設(shè)計(jì)和制備 A：示意圖；B：術(shù)中操作圖Fig.1 Design and preparation of endothelial scraping equipment A: equipment design; B: operation in rabbits

3 兔原代角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 原代細(xì)胞培養(yǎng)按照“兩步法”[7,10]獲得單細(xì)胞：3只1 kg雄兔安樂死后取眼球，去除眼周結(jié)締組織，浸泡在1%青鏈霉素-PBS溶液中30 min，顯微剪剪下角膜鞏膜環(huán)，浸泡在無血清的高糖DMEM中，有齒鑷夾住鞏膜環(huán)，無齒鑷沿角膜緣撕除后彈力層。完整的后彈力層放在2 mg/mL膠原酶Ⅰ中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱消化1～2 h。觀察到角膜內(nèi)皮細(xì)胞形成團(tuán)簇后加入1 × TE酶消化3 min，進(jìn)一步分離成更小的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，10% FBS +高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種在6孔板中，此細(xì)胞為P0代，隔天換液，3 d傳代，P2代細(xì)胞用于移植及后期實(shí)驗(yàn)。4%多聚甲醛固定15 min，0.3% Triton-100破膜，山羊血清工作液封閉30 min，按說明書步驟1∶100稀釋ZO-1抗體，4℃過夜，1∶500稀釋綠色熒光二抗，DAPI染核，熒光顯微鏡拍照。

4 大泡性角膜病變模型制備 動(dòng)物禁食8 h，賽拉嗪和咪達(dá)唑侖1∶1混合，按照0.35 mL/kg比例肌內(nèi)注射全身麻醉，取左側(cè)臥位，術(shù)眼眼周碘伏消毒鋪單，鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉后，慶大霉素(400 U/mL)沖洗結(jié)膜囊。15°角膜穿刺刀在10點(diǎn)位做角鞏膜緣切口，肝素-BSS水(5 U/mL)沖洗前房，注入黏彈劑，自制硅膠針頭刮除全部角膜內(nèi)皮，手動(dòng)注吸黏彈劑，0.04%錐蟲藍(lán)染色2 min，證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞刮除干凈后10-0縫線縫合角鞏膜穿刺口。

5 實(shí)驗(yàn)分組和處理 按照隨機(jī)數(shù)表法將18只兔分為2組，每組9只。兩組均由同一術(shù)者建立大泡性角膜病變模型。操作時(shí)使用29G胰島素針頭從透明角膜斜行穿刺，實(shí)驗(yàn)組(CEC組)注射100 μL細(xì)胞懸液(含106個(gè)細(xì)胞 + Y27632)，對照組(Con組)注射等體積無血清DMEM + Y27632，術(shù)后保持全麻狀態(tài)，術(shù)眼向下臥位3 h促進(jìn)細(xì)胞黏附。術(shù)后術(shù)眼使用妥布霉素地塞米松滴眼液點(diǎn)眼，3次/d。注射時(shí)遵循盲法，即事先由另一人負(fù)責(zé)制備細(xì)胞懸液并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和標(biāo)號，術(shù)者前房注射前不清楚注射液種類。

6 前節(jié)OCT測角膜厚度 分別在注射后1 d、4 d、7 d、14 d使用前節(jié)OCT高分辨率角膜四象限模式掃描角膜0°～180°、45°～225°、90°～270°和135° ～315°的截面，取中央角膜厚度的平均值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[11]。

7 前節(jié)照相評估角膜混濁程度 分別在注射后1 d、4 d 、7 d、14 d拍攝眼前節(jié)照片，使用0～4的等級對角膜透明度進(jìn)行評分[12]：0分=完全透明；1分=輕微混濁，虹膜和瞳孔易見；2分=略微不透明，虹膜和瞳孔隱見；3分=不透明，瞳孔難見；4分=完全不透明，看不到瞳孔。評分由本專業(yè)非實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立完成。

8 角膜組織學(xué)觀察 注射14 d后，過量戊巴比妥鈉靜脈注射處死動(dòng)物，取角膜組織，撕除1/3后彈力層，內(nèi)皮面向上用1%茜素紅染色3 min，PBS洗3次后鋪片顯微鏡下觀察[13]；剩余2/3角膜組織用4%多聚甲醛固定后，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，厚度6 μm，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察角膜組織學(xué)變化。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Graphpad7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組角膜厚度為計(jì)量資料，均以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大泡性角膜病變模型評價(jià) 術(shù)中錐蟲藍(lán)染色顯示角膜內(nèi)皮刮除范圍均勻完整(圖2A)，術(shù)后HE和茜素紅結(jié)果顯示后彈力層完整，未發(fā)生脫離且內(nèi)皮細(xì)胞被成功刮除，說明模型制備成功(圖2B，圖2C)。

圖2 內(nèi)皮刮除效果評估 A：刮除后0.04%臺(tái)階藍(lán)染色確定刮除范圍；B：刮除后立即取材進(jìn)行HE染色，觀察后彈力層(箭頭所示)連續(xù)且完整；C：刮除后茜素紅染色未見內(nèi)皮結(jié)構(gòu)Fig.2 Evaluation of the effect of endothelial A: 0.04% Trypan blue staining after scraping to determine the scraping area;B: HE staining after scraping; Descemet's membrane was intact and continuous (arrow); C: no endothelia remained in alizarin red

2 原代角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察到角膜后彈力層在培養(yǎng)基中呈卷曲狀態(tài)，膠原酶消化能力較為溫和，長時(shí)間的消化破壞了細(xì)胞與后彈力層間的鈣黏蛋白并很好地保持了內(nèi)皮細(xì)胞的活性，重懸貼壁后呈典型的“六邊形”形態(tài)(圖3B)。采用免疫熒光檢測細(xì)胞表面緊密連接蛋白ZO-1可以觀察到蛋白的表達(dá)(圖3C)，證實(shí)該消化方法對于角膜內(nèi)皮的膜表面蛋白損傷較小且無其他細(xì)胞沾染。

圖3 兔原代角膜內(nèi)皮體外培養(yǎng)及鑒定 A：內(nèi)皮細(xì)胞貼壁后倒置相差顯微鏡圖(4×)；B：內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光染色(10×)(藍(lán)色：DAPI；綠色：Z0-1)Fig.3 In vitro culture and identification of rabbit primary corneal endothelium A: image of endothelial cells in culture dish(4×); B: endothelial cell immunofluorescence staining (10×)(Blue: DAPI; Green: ZO-1)

3 角膜厚度透明度觀察 CEC組在細(xì)胞注射7 d時(shí)可達(dá)到臨床治愈(角膜厚度 ＜ 500 μm)，Con組角膜厚度大于CEC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，14 d時(shí)兩組角膜厚度均大致恢復(fù)正常(圖4B)，其他時(shí)間點(diǎn)兩組角膜厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞ 0.05)。在上述時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行眼前節(jié)照相，進(jìn)行混濁程度評分，結(jié)果與角膜厚度變化一致；7 d時(shí)CEC組基本恢復(fù)透明而對照組仍混濁，14 d后基本恢復(fù)透明狀態(tài)(圖5A，圖5B)。

圖4 兩組角膜厚度變化：與Con組相比，CEC組在細(xì)胞注射7 d后角膜厚度顯著降低（aP＜0.05）Fig.4 Corneal thickness changes: compared with the Con group, the corneal thickness in the CEC group decreased significantly at 7 days after the cell injection (aP＜0.05)

圖5 兩組角膜混濁程度分析 A：裂隙燈拍照，在第7天時(shí)CEC組大致恢復(fù)透明而Con組混濁；B：角膜混濁度評分隨時(shí)間變化折線圖(n=9)Fig.5 Analysis of corneal opacity in the two groups A: slit-lamp photograph: the CEC group was almost transparent on 7 d, but the Con group was still opaque; B: the corneal opacity score (n=9)

4 組織學(xué)觀察 14 d時(shí)HE染色見Con組角膜基質(zhì)部分水腫，上皮下散在大泡形成，CEC組較Con組基質(zhì)纖維排列更為致密有序(圖6A)；茜素紅染色見CEC組存在規(guī)則的“六邊形”內(nèi)皮結(jié)構(gòu)(圖6B)，Con組仍存在部分區(qū)域內(nèi)皮缺失，且內(nèi)皮形態(tài)呈現(xiàn)“多形性”(圖6C)。

圖6 兩組組織學(xué)觀察 A：HE染色；B：CEC組茜素紅染色；C：Con組茜素紅染色Fig.6 Histology observation A: HE staining; B: the Alizarin Red staining of the CEC group; C: the Alizarin Red staining of Con group

討 論

目前，角膜供體來源缺乏，細(xì)胞療法治療大泡性角膜病變被認(rèn)為是一個(gè)再生醫(yī)學(xué)與組織工程結(jié)合的新興研究領(lǐng)域，在理論上提供了角膜內(nèi)皮組織的無限來源，同時(shí)降低了免疫排斥反應(yīng)[14-15]。Pan等[16]將小鼠成纖維細(xì)胞通過小分子化合物成功誘導(dǎo)為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞，并采取前房注射的方式在兔大泡性角膜病變中取得成功，進(jìn)一步擴(kuò)大了種子細(xì)胞來源和譜系；Ali等[17]將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮樣細(xì)胞前房注射到恒河猴大泡性角膜病變中取得一定療效，證明了前房注射移植細(xì)胞在高等動(dòng)物中的應(yīng)用價(jià)值。盡管兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有增殖能力，但損傷后14 d角膜內(nèi)皮并不能完全自行愈合；而本實(shí)驗(yàn)組注射細(xì)胞后7 d即可達(dá)到臨床愈合，愈合時(shí)間短于兔角膜內(nèi)皮的自行愈合。由此說明前房注射功能性種子細(xì)胞替代病變或丟失的角膜內(nèi)皮可以治療大泡性角膜病變，本研究結(jié)果與既往報(bào)道大致相同[18]，本實(shí)驗(yàn)中使用的種子細(xì)胞來源于同種異體細(xì)胞的體外擴(kuò)增，嚴(yán)格按照隨機(jī)、對照、盲法的操作，進(jìn)一步證實(shí)前房注射細(xì)胞這一療法的有效性。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)改良了現(xiàn)有手術(shù)器械，保留了兔角膜后彈力層。后彈力層是角膜內(nèi)皮的基底膜，作為細(xì)胞黏附的支架位于內(nèi)皮的基底側(cè)[19]?；啄さ某煞峙c相應(yīng)的整合素結(jié)合，通過招募細(xì)胞接頭蛋白、磷酸化結(jié)合蛋白和結(jié)合接頭蛋白至肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架來啟動(dòng)從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞[20]。因此保留后彈力層對于注射細(xì)胞的黏附至關(guān)重要。既往構(gòu)建大泡性角膜病變動(dòng)物模型使用的20G硅膠針頭(Inami & Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)造價(jià)較為昂貴，手術(shù)時(shí)間長且不易通過角膜穿刺口[21]。本文自制了一種組裝簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、操作簡便、損傷部位準(zhǔn)確可控的手術(shù)器械，在動(dòng)物模型的制備中取得與上述器械相似的手術(shù)效果[18,22-24]。為之后可能的小分子化合物篩選、藥物載體或支架構(gòu)建，以及多種來源種子細(xì)胞的功能驗(yàn)證提供了一種工具。2013年Koenig[25]發(fā)現(xiàn)Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良的患者病程早期去除病變的角膜內(nèi)皮后角膜重新恢復(fù)透明，這一手術(shù)也保留了患者的后彈力層，進(jìn)一步擴(kuò)大了該類型手術(shù)器械的使用范圍，如DWEK(descemetorhexis without endothelial keratoplasty)臨床治療[26]。因此，該手術(shù)器械不僅可以用于動(dòng)物模型構(gòu)建，將來或許也可用于臨床治療。

小分子化合物Y27632是ROCK通路抑制劑，可以通過激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)，促進(jìn)CEC黏附和增殖進(jìn)而促進(jìn)角膜損傷修復(fù)，與種子細(xì)胞共遞送可以增加其功能，已成為內(nèi)皮細(xì)胞前房遞送和培養(yǎng)的常規(guī)添加物質(zhì)[6,14]。其衍生物已作為臨床藥物在日本常規(guī)應(yīng)用[27]。本實(shí)驗(yàn)中兩組采用該小分子化合物是為了評價(jià)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的在體內(nèi)是否有功能，不能排除該小分子化合物本身促進(jìn)角膜內(nèi)皮再生的作用。

前房注射是經(jīng)透明角膜以簡單和微創(chuàng)的方式傳遞CEC。細(xì)胞注射后，必須保持2～3 h的俯臥位，與ROCK抑制劑Y-27632地共遞送，細(xì)胞更容易黏附[23]。本研究注射106個(gè)細(xì)胞是根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道確定[14]，對于細(xì)胞的濃度梯度未進(jìn)行進(jìn)一步探討，仍存在著自身細(xì)胞遷移和注射后種子細(xì)胞的混合作用干擾問題，對于前房注射細(xì)胞的最適宜數(shù)量和最終命運(yùn)轉(zhuǎn)歸未進(jìn)行深入研究。

總之，本研究通過細(xì)胞前房注射探究其對改良兔大泡性角膜病變動(dòng)物模型的治療作用，證實(shí)了前房注射療法的有效性；改良式動(dòng)物模型可作為未來種子細(xì)胞驗(yàn)證、藥物和小分子化合物篩選的臨床前研究模型。