牙源性干細(xì)胞來源外泌體在骨修復(fù)再生中應(yīng)用的研究進(jìn)展

王思拓，時(shí) 權(quán)，劉紫微，徐 娟

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 100853

牙源性干細(xì)胞是來源于牙齒組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，起源于頭顱神經(jīng)嵴細(xì)胞，在組織工程領(lǐng)域引起了越來越多的關(guān)注。目前已分離并鑒定出了多種牙源性干細(xì)胞，如括牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、根尖乳頭干細(xì)胞(stem cells from apical papilla，SCAPs)、脫落乳牙 干 細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs)、牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)、牙囊前體細(xì)胞(denta follicle progenitor cells，DFPCs)、牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingival mesenchymal stem cells，GMSCs)、牙 胚 干 細(xì)胞(tooth germ stem cells，TGSCs)和牙槽骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(alveolar bone marrow mesenchymal stem cells，ABMSCs)。與其他組織來源的干細(xì)胞相比，牙源性干細(xì)胞具有許多生物學(xué)特性。相比于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，GMSCs具有更快的體外增殖速度，且表現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨能力[1]。此外，ABMSCs的成骨能力優(yōu)于長骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[2]。然而，干細(xì)胞療法具有突變致瘤，免疫排斥和倫理限制等局限性[3]。最近的研究表明干細(xì)胞療法的有效性很大程度上得益于其旁分泌效應(yīng)，作為旁分泌效應(yīng)的重要媒介，外泌體是細(xì)胞主動向胞外分泌的一種直徑為30～150 nm的囊泡樣小體，具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)并含有RNA (miRNA和lncRNA等)、DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等多種內(nèi)容物，最早在網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，并在1987年被命名為“Exosome”[4]。

外泌體可由多種細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞、干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等)在生理或病理狀態(tài)下分泌，廣泛存在于血液、尿液、唾液、腹腔積液和膽汁等體液中[5]。外泌體主要通過配體/受體識別、膜融合或吞噬等方式進(jìn)入靶細(xì)胞，并將其攜帶的內(nèi)容物直接釋放到靶細(xì)胞的胞質(zhì)中，通過激活相關(guān)信號通路影響靶細(xì)胞的微環(huán)境和相應(yīng)生物學(xué)功能，發(fā)揮細(xì)胞間通訊的作用[5-6]。研究表明，外泌體與其供體細(xì)胞有著相似的生物學(xué)效應(yīng)[5]。因此，來自不同細(xì)胞類型或不同細(xì)胞狀態(tài)的外泌體，可能具有不同的生物學(xué)功能。

骨修復(fù)再生是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括組織再生、血管生成和免疫調(diào)節(jié)等過程，其不僅涉及骨髓干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨前體細(xì)胞等骨相關(guān)細(xì)胞，免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等其他系統(tǒng)細(xì)胞在骨修復(fù)再生中也發(fā)揮著重要作用[7]。外泌體作為細(xì)胞間通訊的重要媒介物質(zhì)，能夠通過影響多種細(xì)胞的功能來參與骨修復(fù)再生過程。近年來人們從多種牙源性干細(xì)胞中分離提取外泌體并研究其相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。牙源性干細(xì)胞來源外泌體在組織修復(fù)再生、免疫調(diào)節(jié)和生物學(xué)發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用[8]。本文將對牙源性干細(xì)胞來源外泌體應(yīng)用于骨修復(fù)再生中的研究進(jìn)展做一闡述。

1 DPSCs來源外泌體與骨修復(fù)

DPSCs是最先被發(fā)現(xiàn)的牙源性干細(xì)胞[9]，由外胚層神經(jīng)嵴發(fā)育而來。因此，DPSCs來源外泌體(DPSCs-derived exosomes，DPSCs-Exos)與牙髓再生[10]、神經(jīng)退行性疾病[11]等神經(jīng)再生過程密切相關(guān)。同時(shí)，DPSCs-Exos在骨組織工程領(lǐng)域也展現(xiàn)出較好的骨修復(fù)效果。Swanson等[12]將PLGAPEG共聚物微球材料作為載體包裹DPSCs-Exos構(gòu)建外泌體緩釋體系，將控釋DPSCs-Exos的微球材料植入小鼠顱骨缺損模型中進(jìn)行骨修復(fù)，8周后發(fā)現(xiàn)顱骨缺損修復(fù)效果顯著。該研究還表明DPSCs-Exos可以促進(jìn)BMSCs的成骨分化，且DPSCs-Exos與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體對BMSCs的體外成骨效果相似[12]。

Xie等[13]對經(jīng)成骨誘導(dǎo)不同時(shí)間的DPSCs來源外泌體進(jìn)行circRNA轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)經(jīng)成骨誘導(dǎo)的DPSC-Exos中環(huán)狀溶血磷脂酸受體1(circLPAR1)表達(dá)量增加，增加程度與供體細(xì)胞成骨分化程度一致。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，circLPAR1可通過與hsa-miR-31結(jié)合而消除hsa-miR-31對DPSCs的成骨抑制作用，從而促進(jìn)受體同型DPSCs的成骨分化[13]。

miRNA在DPSCs-Exos促進(jìn)骨形成中發(fā)揮重要作用。DPSC-Exo攜帶的miR-1246可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞從促炎表型轉(zhuǎn)化為抗炎表型，并有效減輕了牙周炎小鼠的牙槽骨吸收和炎癥反應(yīng)[14]。與未經(jīng)表面修飾的DPSCs-Exos相比，miR-140-5p修飾的DPSCs-Exos抑制了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，并減輕了大鼠骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)[15]。

2 PDLSCs來源外泌體與骨修復(fù)

牙周膜干細(xì)胞已被證實(shí)為外泌體的可靠來源細(xì)胞[16]。體外研究表明，PDLSCs來源外泌體(PDLSCs-derived exosomes，PDLSCs-Exos)具 有促進(jìn)血管生成[17]、調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性[18]、免疫調(diào)節(jié)[19-20]和抗炎[21]等作用，TGF-β、MAPK、mTOR、FoxO信號通路[22]、PI3K/Akt[23]和NF-κB信號通路[24]在其中扮演重要角色。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，PDLSCs-Exos具有促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化的作用，且經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的PDLSCs-Exos對大鼠BMSCs的促成骨作用明顯增強(qiáng)。PDLSCs-Exos在骨修復(fù)再生中的積極作用在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也得到了同樣的結(jié)果。Pizzicannella等[26]通過構(gòu)建大鼠顱骨缺損模型，將負(fù)載聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)工程化PDLSCs-Exos的3D膠原膜材料置入缺損部位，6周后發(fā)現(xiàn)顱骨缺損區(qū)域骨修復(fù)效果明顯，且骨形成與血管生成增加密切相關(guān)。

在PDLSCs-Exos的成骨機(jī)制方面，通過RNA測序技術(shù)分析不同狀態(tài)的細(xì)胞來源外泌體中差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的PDLSCs-Exos相比，經(jīng)成骨誘導(dǎo)的PDLSCs-Exos中72個(gè)miRNA上調(diào)，35個(gè)miRNA下調(diào)，其中miR-122-5p、miR-25-3p和miR-142-5p等成骨相關(guān)miRNA在經(jīng)成骨誘導(dǎo)的PDLSCs-Exos中高表達(dá)[25]。PDLSCs-Exos攜帶的miRNA可以通過靶向調(diào)控成骨相關(guān)信號通路的靶基因影響細(xì)胞的成骨分化過程[25]。另有研究表明，與未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的PDLSCs-Exos相比，經(jīng)成骨誘導(dǎo)5 d和7 d的PDLSCs-Exos中3個(gè)circRNA和2個(gè)lncRNA上調(diào)，39個(gè)circRNAs和5個(gè)IncRNAs下調(diào)，且這種上調(diào)或下調(diào)趨勢呈時(shí)間依賴性[22]。

3 GMSCs來源外泌體與骨修復(fù)

由于GMSCs的生物學(xué)特性，GMSCs來源外泌體(GMSCs-derived exosomes，GMSCs-Exos)的生物學(xué)功能也被逐漸關(guān)注。多項(xiàng)研究表明，GMSCs-Exos在組織修復(fù)與再生中具有良好的作用[27-28]。GMSCs-Exos可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞的遷移和成骨分化[29]。Diomede等[30]將GMSCs-Exos與PLA材料結(jié)合并置入大鼠顱骨缺損中，發(fā)現(xiàn)GMSCs-Exos能夠有效促進(jìn)骨缺損區(qū)域的骨再生及血管再生。同時(shí)，PEI工程化GMSCs-Exos的骨修復(fù)和血管再生效果更好，GO分析結(jié)果顯示PEI工程化GMSCs-Exos上調(diào)了19個(gè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)[30]。骨代謝主要依靠成骨與破骨的相互平衡，以達(dá)到修復(fù)骨缺損的目的。GMSCs-Exos在促進(jìn)成骨的同時(shí)，還具有抑制破骨的特性[31]。Nakao等[31]通過結(jié)扎誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠牙周炎模型并向炎癥區(qū)域局部注射GMSCs-Exos或TNF-α預(yù)處理的GMSCs-Exos(GMSCs-Exos-TNF) 1周后，與注射PBS的對照組相比，GMSCs-Exos組和GMSCs-Exos-TNF組中破骨細(xì)胞數(shù)量和牙槽骨吸收程度均降低，其中GMSCs-Exos-TNF組抑制破骨效果更明顯。

4 其他牙源性干細(xì)胞來源外泌體與骨修復(fù)

除上述 3 種牙源性干細(xì)胞來源外泌體，SHEDs來源外泌體(SHED-derived exosomes，SHED-Exos)、根間乳頭干細(xì)胞來源外泌體(SCAPs-derived exosomes，SCAPs-Exos)、DFPCs來源外泌體(DFPCs-derived exosomes，DFPCs-Exos)在骨缺損修復(fù)中也表現(xiàn)出潛在的治療效果。多項(xiàng)研究表明，SHED/SCAPs/DFPCs-Exos在血管生成[32-33]、炎性調(diào)節(jié)[34]、成骨再生[33,35-36]中發(fā)揮積極作用。體外研究表明，SHED-Exos可以促進(jìn)BMSCs的成骨分化并抑制其脂質(zhì)生成[35]，也可通過Wnt/β-catenin和BMP/Smad信號通路促進(jìn)PDLSCs的成骨分化[36]。已有多項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SHED-Exos在抗炎和骨缺損修復(fù)中的作用[33-35]。Wei等[35]在結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎小鼠模型中以每周1次的頻率局部注射SHED-Exos并持續(xù)2周后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SHED-Exos組牙槽骨吸收程度減輕，骨高度增加。此外，Wu等[33]在大鼠下頜第一磨牙至第三磨牙頰側(cè)牙槽骨處制備4 mm ×2 mm × 1.5 mm的牙槽骨缺損并將負(fù)載SHEDExos的β-TCP材料填塞到缺損部位4周后發(fā)現(xiàn)，與空白缺損組和β-TCP支架組相比，含有SHEDExos的支架組新生血管形成和新骨形成明顯增加。另有研究表明，SHED-Exos可通過miR-100–5p/mTOR信號通路增強(qiáng)顳下頜關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的抗炎能力，這為顳下頜關(guān)節(jié)炎的治療提供了新的思路[34]。Shi等[37]研究發(fā)現(xiàn)，DFPCs-Exos可減少牙周炎大鼠模型中牙槽骨的吸收和破骨細(xì)胞的數(shù)量，LPS預(yù)處理的DFPCs-Exos抑制破骨效果更顯著。

在分子機(jī)制層面，piRNA表達(dá)譜可能影響外泌體的生物學(xué)功能。Wang等[38]從SHED-Exos和BMSCs-Exos中分別鑒定出593個(gè)和920個(gè)已知的piRNA，發(fā)現(xiàn)21個(gè)piRNA在兩種外泌體中有差異表達(dá)，其中15個(gè)piRNA在SCAPs-Exos中上調(diào)、6個(gè)piRNA在SCAPs-Exos中下調(diào)。SHEDExos中高表達(dá)的piRNA主要與細(xì)胞代謝、細(xì)胞增殖和分化、牙齒發(fā)育和骨組織形成相關(guān)信號通路有關(guān)，這為進(jìn)一步研究牙源性干細(xì)胞來源外泌體的骨修復(fù)機(jī)制提供了新的方向[38]。

5 結(jié)語

干細(xì)胞來源外泌體具有廣闊的應(yīng)用前景，其相比于直接應(yīng)用干細(xì)胞治療，具有以下潛在優(yōu)勢：1)免疫原性低；2)外泌體治療可以有效避免與直接應(yīng)用干細(xì)胞治療相關(guān)的安全性問題，并且易于制備和運(yùn)輸；3)外泌體作為納米顆粒，可以穿過多種屏障(如血-腦脊液屏障、毛細(xì)血管等)，且可以直接被靶細(xì)胞攝取并作用于靶細(xì)胞，作用效率更高[39]。目前，牙源性干細(xì)胞來源外泌體的研究仍處早期階段，針對其在骨修復(fù)再生中的研究相對較少，且停留在細(xì)胞分子、動物實(shí)驗(yàn)等基礎(chǔ)研究階段。有限的動物實(shí)驗(yàn)多采用口腔頜面部骨缺損或疾病模型，如顱骨缺損[12,26,30]、牙槽骨缺損[33]、結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎[14,17,21,31,35]模型，關(guān)于其在機(jī)體其他部位骨缺損和骨疾病模型中的應(yīng)用研究鮮有報(bào)道。此外，牙源性干細(xì)胞來源外泌體的成骨方面具體機(jī)制尚不明確，許多具體應(yīng)用問題亟待解決，還有許多新的領(lǐng)域需要我們發(fā)現(xiàn)和探索。