假肢接受腔內(nèi)襯套的細(xì)胞毒性及力學(xué)性能檢測(cè)

欒會(huì)芹，畢經(jīng)芳，吳賽男，任韋燕，劉紅梅，張瑩瑩，李增勇

1.國(guó)家康復(fù)輔具研究中心，北京市 100176；2.國(guó)家康復(fù)輔具研究中心康復(fù)輔具質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京市 100176；3.民政部康復(fù)輔具分析評(píng)定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市 100176；4.山東省泰安市中心醫(yī)院，山東泰安市 271000；5.國(guó)家康復(fù)輔具研究中心附屬康復(fù)醫(yī)院，北京市 100176

0 引言

我國(guó)有肢體殘疾人2 472 萬(wàn)[1]，其中截肢者226萬(wàn)[2]，截肢者中下肢截肢占70%[3]。假肢接受腔通過(guò)對(duì)殘肢體積的包容，完成垂直力的傳遞(支撐)、水平力的傳遞(固定)、殘肢和假肢之間的界面吸附(懸吊)[4-5]。在假肢與殘肢接觸界面中，過(guò)高或過(guò)低的接受腔負(fù)荷均可導(dǎo)致皮膚及深層組織損傷[6-8]。

內(nèi)襯套可以提供一種或多種界面功能，起到調(diào)整容積、分散壓力、減少摩擦或(吸著式)懸吊的作用。內(nèi)襯套一般由發(fā)泡材料、硅膠材料、凝膠材料及聚氨酯等耐用材料制成，具有不同的柔軟度。內(nèi)襯套的材料性能對(duì)骨突出部位、敏感部位等有緩沖減震作用，它的彈性能幫助殘肢全面接觸和固定形狀，較高的抗撕裂特性也會(huì)增加其耐用性。最初內(nèi)襯套產(chǎn)品只用于小腿截肢者，目前大腿及上肢截肢者均可穿戴。內(nèi)襯套在為截肢者提供舒適感覺(jué)的同時(shí)，還可以有效地保護(hù)皮膚及皮下組織，因此截肢患者大多數(shù)都會(huì)穿戴內(nèi)襯套。目前，市面上常用的是泡沫內(nèi)襯套主要以乙烯-醋酸乙烯共聚物(ethylene-vinylacetate copolymer,EVA)類、聚氨酯(polyurethane,PU)類及聚乙烯(polyethylene,PE)類為主[9]。此外，還有以硅膠及凝膠為主的內(nèi)襯套。

日常穿戴過(guò)程中，內(nèi)襯套與皮膚長(zhǎng)期接觸，當(dāng)材料磨損、汗液腐蝕[10]、降解等情況出現(xiàn)時(shí)，其中毒性物質(zhì)會(huì)滲出，滲出物可能會(huì)對(duì)皮膚表面及皮下組織造成損傷，長(zhǎng)時(shí)間使用可能會(huì)對(duì)使用者造成二次傷害。此外，內(nèi)襯套上緣受牽拉較多，內(nèi)襯套越靠近邊緣越薄，越容易損壞。因此，內(nèi)襯套不僅需要有良好的生物安全性，也需要有良好的力學(xué)性能。通過(guò)檢測(cè)其硬度、拉伸強(qiáng)度、扯斷伸長(zhǎng)率及100%定伸強(qiáng)度，可反映內(nèi)襯套在常溫、靜載作用下的宏觀力學(xué)性能，可以為內(nèi)襯套生產(chǎn)工藝及材料力學(xué)性能改良提供依據(jù)。

隨著肢體殘疾人數(shù)量增加，市售內(nèi)襯套也會(huì)隨之增多。目前我國(guó)沒(méi)有對(duì)假肢接受腔內(nèi)襯套進(jìn)行力學(xué)及生物安全性方面評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)[11-13]。因此，研究假肢接受腔內(nèi)襯套力學(xué)性能及其細(xì)胞毒性，可以幫助發(fā)現(xiàn)內(nèi)襯套存在問(wèn)題，為內(nèi)襯套產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1主要試劑

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清：美國(guó)GIBCO 公司。噻唑藍(lán)(thiazole blue,MTT)、10%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(陽(yáng)性對(duì)照)：美國(guó)SIGMA 公司。高密度聚乙烯(陰性對(duì)照)：中國(guó)ALFA AESAR 公司。浸提介質(zhì)為含10%血清細(xì)胞培養(yǎng)液。內(nèi)襯套為國(guó)內(nèi)市售，分別購(gòu)于不同廠家：國(guó)產(chǎn)厚度6 mm 泡沫內(nèi)襯(A)、國(guó)產(chǎn)厚度5 mm EVA 泡沫內(nèi)襯(B)、德國(guó)產(chǎn)厚度5 mm EVA 泡沫內(nèi)襯(C)、德國(guó)產(chǎn)厚度12 mm PE 泡沫內(nèi)襯套(D)、冰島產(chǎn)厚度3 mm硅膠內(nèi)襯套(E)和德國(guó)產(chǎn)厚度4 mm凝膠內(nèi)襯套(F)。

細(xì)胞系為體外培養(yǎng)哺乳動(dòng)物L(fēng)929 細(xì)胞，購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院。

1.1.2主要儀器

凈化工作臺(tái)、恒溫水浴箱：常州國(guó)華電器有限公司。生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)THERMO 公司。倒置顯微鏡：日本NIKON 公司。酶標(biāo)儀：瑞士TECAN 公司。96 孔板：美國(guó)CORNING 公司。Z02Q 氣動(dòng)取樣機(jī)：溫州方圓儀器有限公司。MTS 材料試驗(yàn)機(jī)：美特斯工業(yè)系統(tǒng)中國(guó)有限公司。硬度計(jì)：德國(guó)博瑞公司。

1.2 方法

1.2.1樣品制備

樣品浸提液制備[14]：內(nèi)襯套按每0.2 g 樣品加1 mL 浸提介質(zhì)浸提，陰性對(duì)照按每0.2 g 高密度聚乙烯加1 mL 浸提介質(zhì)浸提，均置于(37±1) ℃環(huán)境，浸提24 h。陽(yáng)性對(duì)照采用10%二甲基亞砜，空白對(duì)照采用10%血清細(xì)胞培養(yǎng)液，均與測(cè)試樣品同條件下制備。

1.2.2MTT比色實(shí)驗(yàn)

將1×104/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，每組6 孔。分別加入空白對(duì)照(培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照(高密度聚乙烯)、陽(yáng)性對(duì)照(二甲基亞砜)、內(nèi)襯套浸提液，分別于5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)72 h，之后棄去培養(yǎng)基，加入5 g/L MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h 后，棄去上清，加入DMSO 150 μL，室溫放置，酶標(biāo)儀震蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度(optical density,OD)值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率(relative growth rate,RGR)。

陰性對(duì)照細(xì)胞毒性為0 級(jí)，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞毒性為4 級(jí)，對(duì)照試驗(yàn)系統(tǒng)成立，細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)見(jiàn)表1[16]。

表1 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)

1.2.3高錳酸鉀消耗量

稱取樣品10 g，加水100 mL，(37±1) ℃恒溫24 h，將液體與樣品分離后冷卻至室溫，取20 mL 樣液進(jìn)行滴定。

1.2.4拉伸實(shí)驗(yàn)

內(nèi)襯套距離上緣約1～20 cm 處縱向取材。根據(jù)GB/T 6344-2008 的規(guī)定[17]制樣，在材料試驗(yàn)機(jī)上對(duì)試樣預(yù)加載0.1 kPa 應(yīng)力，然后以(500±50) mm/min 加載速率對(duì)試樣進(jìn)行一次性拉伸至其斷裂，得到應(yīng)力-應(yīng)變曲線或力-位移曲線，計(jì)算拉伸強(qiáng)度、扯斷伸長(zhǎng)率、100%定伸強(qiáng)度。

1.2.5硬度實(shí)驗(yàn)

將從內(nèi)襯套上取出的試樣放在平整堅(jiān)硬的表面上，采用邵氏oo 型硬度計(jì)在試樣表面不同位置進(jìn)行5次測(cè)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)值均以()的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色試驗(yàn)

內(nèi)襯套A、B、C和D均具有輕度細(xì)胞毒性；而內(nèi)襯套E和F無(wú)細(xì)胞毒性。見(jiàn)表2。

表2 各組MTT比色法測(cè)定結(jié)果

2.2 高錳酸鉀消耗量

A、B、C、E、F 5種內(nèi)襯套高錳酸鉀消耗量均在70 mg/kg 以上，而內(nèi)襯套D 高錳酸鉀消耗量小于70 mg/kg。見(jiàn)表3。

表3 各組高錳酸鉀消耗量 單位：mg/kg

2.3 力學(xué)性能

樣品A 和C 的拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率及100%定伸強(qiáng)度均大于樣品B和D。見(jiàn)表4。

表4 力學(xué)性能結(jié)果

3 討論

細(xì)胞毒性是由細(xì)胞或化學(xué)物質(zhì)引起的細(xì)胞殺傷，不同于細(xì)胞凋亡或壞死。通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)可以衡量藥物等對(duì)細(xì)胞的傷害性[18]。細(xì)胞毒試驗(yàn)通用性強(qiáng)，已被廣泛應(yīng)用于各種醫(yī)療器械及其材料的評(píng)價(jià)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)特點(diǎn)是試驗(yàn)周期短，費(fèi)用低，敏感性較高，基本上各種產(chǎn)品材料均適用[19]。

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)主要分為三類：浸提液試驗(yàn)、直接接觸法試驗(yàn)和間接接觸法試驗(yàn)[20-21]，主要根據(jù)樣品的性質(zhì)及使用特性等決定[22-23]。浸提液試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞可以與浸提液廣泛接觸，用于分析樣品中可溶出物及其濃度對(duì)細(xì)胞的影響比較靈敏。假肢接受腔內(nèi)襯套在使用過(guò)程中直接與肢體殘端皮膚接觸，讓內(nèi)襯套的浸提液直接接觸小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，通過(guò)觀察細(xì)胞增殖或抑制情況，可評(píng)價(jià)內(nèi)襯套對(duì)細(xì)胞的體外毒性[11,24]。

細(xì)胞毒性定量評(píng)價(jià)常采用MTT 法，其原理是哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體酶可以將黃綠色的MTT 降解，形成藍(lán)紫色的物質(zhì)[25]，藍(lán)紫色的物質(zhì)可以在二甲基亞砜中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度，細(xì)胞的存活依據(jù)OD 定量測(cè)定。OD 值越大則細(xì)胞存活率越高，說(shuō)明材料的細(xì)胞毒性較小。

本研究顯示，泡沫內(nèi)襯套有較低細(xì)胞毒性，硅膠內(nèi)襯套無(wú)細(xì)胞毒性，生物安全性更好。

高錳酸鉀消耗量是指試樣浸提液中可被高錳酸鉀氧化的物質(zhì)總量，反映試樣中可遷出能被氧化的水溶性有機(jī)物的總和[26-27]。本研究顯示，泡沫內(nèi)襯套A、B和C 的高錳酸鉀消耗量高并有輕度細(xì)胞毒性，提示可溶出的有機(jī)物可能會(huì)對(duì)殘肢皮膚、肌肉和血管等造成損傷，從而對(duì)長(zhǎng)期穿戴者造成二次傷害。

接受腔內(nèi)襯套與殘肢直接接觸，形成重要的接觸界面，擔(dān)負(fù)著聯(lián)接和承載的功能。穿戴內(nèi)襯套使患者肢體殘端和接受腔受力更均勻，提高了肢體運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定性。每天穿脫過(guò)程中產(chǎn)生的拉力、壓力、剪切力，以及運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的壓力、剪切力和摩擦力等力學(xué)因素，均會(huì)引起內(nèi)襯套材料的磨損、老化和失效[28]。因此，研究?jī)?nèi)襯套材料的力學(xué)性能十分重要。本研究顯示，6 種內(nèi)襯套硬度大小依次為C＞E＞A＞B＞D＞F。一般而言，硬度越低，靜態(tài)舒適性越高，硬度越高，動(dòng)態(tài)舒適性越高。因此，設(shè)計(jì)內(nèi)襯套時(shí)應(yīng)綜合考慮穿戴者動(dòng)態(tài)和靜態(tài)舒適度。

6 種內(nèi)襯套的拉伸強(qiáng)度依次為C＞A＞F＞E＞B＞D，斷裂伸長(zhǎng)率大小依次為A＞C＞F＞D＞B＞E，100%定伸強(qiáng)度大小依次為C＞E＞A＞B(F)＞D。內(nèi)襯套越靠近邊緣越薄，因?yàn)槭芰υ蛟饺菀讐?。?nèi)襯套在承受載荷時(shí)，不會(huì)單獨(dú)產(chǎn)生徑向或軸向變形，通常是徑向和軸向變形同時(shí)產(chǎn)生。內(nèi)襯套硬度、拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率及100%定伸強(qiáng)度均是影響內(nèi)襯套材料力學(xué)特性的重要指標(biāo)，所以在對(duì)內(nèi)襯套進(jìn)行相關(guān)分析時(shí)，需將內(nèi)襯套的力學(xué)指標(biāo)一起綜合考慮，使內(nèi)襯套的研究進(jìn)一步深入。

目前我國(guó)尚無(wú)關(guān)于假肢接受腔內(nèi)襯套質(zhì)量的團(tuán)體、行業(yè)和國(guó)家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)和法律法規(guī)的要求，市售產(chǎn)品均未標(biāo)明產(chǎn)品的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，處于監(jiān)管空白。因此，建議開(kāi)展假肢接受腔內(nèi)襯套的相關(guān)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)研究，為監(jiān)管部門(mén)提供科學(xué)的監(jiān)管依據(jù)和技術(shù)支持。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。