高壓氧修復(fù)缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障的自噬機(jī)制

黃菲菲，王萬松，董曉陽，馮珍

1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，安徽蕪湖市 241000；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，江西南昌市 330006

0 引言

隨著我國人口的老齡化，腦血管疾病已成為危及人們健康和生命的重大疾病之一[1]。腦梗死又稱缺血性腦血管病，在老年人群中具有較高的發(fā)病率、致殘率和致死率，對(duì)患者的神經(jīng)功能和日常生活能力造成嚴(yán)重影響，也給國家和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。腦梗死后血腦屏障往往會(huì)遭到破壞，進(jìn)而引起炎性細(xì)胞及其介質(zhì)的內(nèi)流，加速腦水腫、出血的形成[3]。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障重要的組成部分，在腦缺血再灌注損傷(cerebral-ischemica reperfusion injury,CIRI)后存在自噬現(xiàn)象，且這種現(xiàn)象可以減輕缺血再灌注損傷后血腦屏障的破壞[4]，表明血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬對(duì)CIRI后的血腦屏障能起到保護(hù)作用。

高壓氧艙治療目前在臨床上主要適用于減壓病、急性一氧化碳中毒、糖尿病感染性潰瘍、危兆皮瓣等疾病[5]。近年來的臨床研究顯示[6-8]，高壓氧艙治療在腦卒中患者神經(jīng)功能缺損、生活質(zhì)量及抑郁癥狀等方面發(fā)揮積極作用。高壓氧能夠減輕腦梗死大鼠血腦屏障的通透性，降低缺血缺氧對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害[9]，且能夠增強(qiáng)梗死區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的自噬，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10]。然而，高壓氧是否能夠調(diào)控腦梗死區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬以及是通過何種機(jī)制發(fā)揮修復(fù)血腦屏障的作用目前仍不明確。

本實(shí)驗(yàn)研究高壓氧對(duì)腦梗死大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響，并明確細(xì)胞自噬是否介導(dǎo)高壓氧修復(fù)血腦屏障的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF 級(jí)成年雌性Sprague-Dawley 大鼠54 只，體質(zhì)量230～250 g，購自南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心，許可證號(hào)SYXK(贛)2015-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。大鼠編號(hào)，采用Excel 軟件生成隨機(jī)數(shù)，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=12)、模型組(n=18)、高壓氧組(n=12)和抑制劑組(n=12)。

假手術(shù)組僅麻醉和手術(shù)暴露頸總動(dòng)脈，不做栓塞處理；模型組建立CIRI模型；高壓氧組在建模后予以高壓氧艙治療；抑制劑組在建模后先經(jīng)腦立體定位儀，往側(cè)腦室內(nèi)注射自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)后再給予高壓氧艙治療。

所有操作均符合中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。大鼠依照動(dòng)物福利與倫理原則進(jìn)行處理，遵循2006 年《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審批〔No.(2016)醫(yī)研倫審第(003)號(hào)〕。

1.2 主要儀器和試劑

兔抗LC3 多克隆抗體(AP1802a)：百齊生物科技有限公司。小鼠抗CD31單克隆抗體(ab64543)、Alexa Flour?594標(biāo)記的驢抗小鼠IgG(ab150108)：ABCAM有限公司。FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG(HS111)：北京全式金生物技術(shù)有限公司。兔抗Beclin-1 多克隆抗體(3738)：CELL SIGNALING 生物公司。組織蛋白提取試劑盒(CWBl0)、抗β-actin 單克隆抗體(CW0096)：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。細(xì)胞自噬抑制劑3-MA(M9281)：SIGMA-ALDRICH 公司。ZS-BS 數(shù)顯腦立體定位儀：北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司。冰凍切片機(jī)、熒光倒置顯微鏡、熒光分光光度儀由南昌大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供，高壓氧艙由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科提供。

1.3 動(dòng)物模型建立

采用線栓法[11]制備CIRI模型。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。頸正中切口，長(zhǎng)約3 cm，暴露右頸總動(dòng)脈，自制拉鉤牽拉肌肉，暴露頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)/頸外動(dòng)脈的分叉處。鈍性分離血管神經(jīng)鞘膜，距頸內(nèi)/頸外動(dòng)脈分叉處2 mm 左右剪一小切口，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。持栓線沿頸外動(dòng)脈緩慢進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈直至遇阻力，再輕輕向前用力插緊，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，栓線入口后松開頸總動(dòng)脈微型血管夾。梗死2 h 后，解開切口，將栓線緩慢拔出，結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端。6 h 后，對(duì)大鼠進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified Neurological Severity Score,mNSS)[12]。mNSS 評(píng)分由運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡和反射等測(cè)試組成，總分0～18分，分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)行為損傷越嚴(yán)重，將7～12分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 高壓氧艙治療

缺血再灌注損傷后6 h 將高壓氧組和抑制劑組置于自制透明密閉塑料箱中[13]，箱子兩側(cè)分別設(shè)有單向進(jìn)氣口和出氣口，再將整個(gè)裝置連同大鼠一同放置于高壓氧艙中，壓力設(shè)定為2.5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，穩(wěn)壓前5 min 以10 L/min 的流速直排式向塑料箱內(nèi)給氧，持續(xù)1 h，艙內(nèi)的溫度控制在23～26 ℃，所有動(dòng)物治療開始的時(shí)間都選擇在一天中的同一時(shí)刻。連續(xù)治療3 d。模型組僅置于正?？諝獾呐搩?nèi)，不進(jìn)行高壓氧艙治療。

1.5 側(cè)腦室注射

抑制劑組在建模后1 h，10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔麻醉，俯臥于三維腦立體定位儀上，固定四肢和頭部，暴露顱骨，標(biāo)記基點(diǎn)(正中線旁開1.5 mm，前囟后約1.0 mm)，用顱骨鉆在基點(diǎn)處鉆一小孔，將25 μL的微量注射器固定，進(jìn)針深度為距硬腦膜下3.8 mm，以0.5 μL/min的速度向右側(cè)腦室注射3-MA(30 μg溶于10 μL 生理鹽水中)，共5 min，注射結(jié)束后留針5 min后再退針。

1.6 血腦屏障通透性檢測(cè)

采用伊文思藍(lán)染色法檢測(cè)血腦屏障通透性[14]。每組取6 只大鼠于術(shù)后72 h 檢測(cè)梗死區(qū)伊文思藍(lán)含量。2%伊文思藍(lán)2 mL/kg 經(jīng)尾靜脈注，1 h 后心臟灌注生理鹽水直至流出清澈液體，立即處死大鼠取出腦組織，分離缺血側(cè)大腦，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，稱量濕重后置于試管中，加入甲酰胺3 mL，45 ℃水浴48 h，10 000 r/min 離心20 min，取上清液，熒光分光光度計(jì)632 nm處測(cè)量吸光度值。

1.7 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)

模型組取6 只大鼠，術(shù)后72 h，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注致大鼠全身僵硬，處死大鼠并立即取出全腦，投入試管中，加入4%多聚甲醛再次固定12 h，分別置于20%、30%葡萄糖梯度脫水，-20 ℃冰凍切片，片厚10 μm，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取出切片在室溫下平?0 min，4%多聚甲醛固定30 min，磷酸緩沖液沖洗后加入0.3%Triton破膜，洗膜后加入封閉血清，37 ℃環(huán)境下孵育1 h。兔抗LC3 多克隆抗體(1∶50)與小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體(1∶100)混合后，滴加到腦組織上，4 ℃孵育過夜。第2 天將切片37 ℃復(fù)溫1 h，磷酸緩沖液沖洗后，在避光條件下滴加Alexa Flour?594 標(biāo)記的驢抗小鼠IgG(紅光)和FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG(綠光)的混合二抗稀釋液(1∶200)，37 ℃孵育2 h 后磷酸緩沖液沖洗，抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.8 Western blotting

每組取6 只大鼠，于缺血再灌注損傷后72 h，10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔麻醉，斷頭取腦，在冰盒上切取梗死區(qū)腦皮質(zhì)，迅速置于液氮中。取0.1 g腦皮質(zhì)，加入0.1% Ⅱ型膠原酶，混勻后置37 ℃溫水中消化1.5 h，12 000 r/min 離心5 min 后去除上清液，加入15%葡聚糖同法離心得到微血管段，再加10倍體積的裂解緩沖液，同法離心取上清液，加入樣品緩沖液，沸水浴5 min。蛋白樣品在15%的SDS-PAGE 凝膠中分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，加兔抗LC3 多克隆抗體(1∶1000)或兔抗Beclin-1 多克隆抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。山羊抗兔IgG (1∶3000)室溫孵育2 h 后，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描拍照，Image Lab 軟件定量分析，以LC3-Ⅱ與LC3-I的比值和Beclin-1/β-acting 的比值分別表示LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。伊文思藍(lán)含量、LC3-Ⅱ與Beclin-1 蛋白表達(dá)水平符合正態(tài)分布，以()表示，采用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 伊文思藍(lán)含量

經(jīng)尾靜脈注射伊文思藍(lán)后大鼠全身皮膚、鞏膜迅速變藍(lán)。全身循環(huán)1 h 后，右側(cè)梗死區(qū)著色明顯。各組患側(cè)腦組織伊文思藍(lán)含量比較有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。模型組較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.01)；高壓氧組較模型組明顯降低(P＜0.01)，抑制劑組較高壓氧組升高(P＜0.05)，模型組與抑制劑組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組患側(cè)腦組織EB含量的比較單位：μg/g腦組織

2.2 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)

CIRI后72 h，模型組缺血周圍腦皮質(zhì)區(qū)可見LC3(綠光)在CD31+的血管內(nèi)皮細(xì)胞(紅光)上表達(dá)(圖中白色箭頭所指)。見圖1。

圖1 模型組LC3、CD31免疫熒光染色結(jié)果(×100)

2.3 Western blotting

CIRI后72 h，與假手術(shù)組比較，模型組LC3-Ⅱ和Beclin-1 的表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.01)；與模型組比較，高壓氧組LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.05)，而抑制劑組較高壓氧組和模型組均明顯降低(P＜0.01)，假手術(shù)組與抑制劑組的比較無顯著性差異(P ＞0.05)。見圖2、表2。

表2 各組間LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)水平的比較

圖2 各組大腦皮質(zhì)微血管段LC3和Beclin-1的表達(dá)(Western blotting)

3 討論

細(xì)胞自噬是通過溶酶體降解途徑消化去除細(xì)胞分子，如蛋白質(zhì)聚集體和受損的細(xì)胞器?；钚匝跏羌?xì)胞代謝的產(chǎn)物，過度產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；自噬通過降解氧化物質(zhì)，可以減少細(xì)胞損傷[15]。LC3 是自噬形成的標(biāo)記蛋白[16]，自噬發(fā)生時(shí)，胞漿型LC3(LC3-I)會(huì)轉(zhuǎn)變成自噬體膜型LC3(LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ表達(dá)的水平與自噬程度呈正比[17]。Beclin-1 是自噬形成的主要調(diào)節(jié)因子，能誘導(dǎo)自噬蛋白定位于吞噬泡，對(duì)自噬體的形成和成熟至關(guān)重要[18]。細(xì)胞在正常內(nèi)環(huán)境下的自噬水平較低，當(dāng)其受到刺激(如氧化應(yīng)激、缺血缺氧等)自噬會(huì)被激活[19-20]。缺血再灌注損傷大鼠大腦頂葉的LC3-Ⅱ表達(dá)增加，且損傷后24 h表達(dá)最高[21]。

免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果提示，大鼠腦缺血再灌注損傷后，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞存在自噬現(xiàn)象。Western blotting定量分析結(jié)果表明，缺血再灌注損傷后大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平增強(qiáng)，且高壓氧能夠進(jìn)一步增強(qiáng)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬，自噬抑制劑則能抑制高壓氧的這一效應(yīng)。

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其緊密連接組成血腦屏障的重要結(jié)構(gòu)[22]。大腦發(fā)生缺血后，外周的免疫細(xì)胞和分子滲入并積聚到腦實(shí)質(zhì)，血管內(nèi)皮緊密連接的破壞和通透性的增加，是導(dǎo)致血腦屏障功能障礙和損傷進(jìn)展的重要原因[23-24]。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬能夠降低伊文思藍(lán)在內(nèi)皮細(xì)胞的著色和缺血半球的腦含水量[4]。Fang 等[25]稱自噬抑制劑能夠加劇丙酮醛對(duì)人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，且氯喹誘導(dǎo)的自噬被抑制后糖尿病大鼠的血腦屏障的通透性也增加。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

目前研究已證實(shí)高壓氧對(duì)腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用，包括減少梗死面積，緩解腦水腫，減輕局灶神經(jīng)功能缺損癥狀，改善急性腦梗死預(yù)后等[26-29]。以往研究表明高壓氧主要是通過以下機(jī)制發(fā)揮療效。①調(diào)節(jié)免疫炎癥。高壓氧能夠刺激內(nèi)源性抗氧化和抗炎防御系統(tǒng)，從而降低氧化損傷和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[30]。②抑制細(xì)胞凋亡。高壓氧能夠抑制缺血/缺氧誘導(dǎo)的線粒體凋亡和能量代謝紊亂，阻止腦細(xì)胞損傷的進(jìn)展[31]。③促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，起到營養(yǎng)細(xì)胞的作用[32]。④刺激細(xì)胞自噬的形成[10,33]，減少細(xì)胞的損傷或凋亡。⑤修復(fù)血腦屏障[34]，減少炎性細(xì)胞及其介質(zhì)的內(nèi)流對(duì)腦組織造成的二次損傷[35]。本實(shí)驗(yàn)顯示，高壓氧可通過增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死和損傷，起到保護(hù)血腦屏障的作用，減輕繼發(fā)性損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，缺血再灌注損傷大鼠損傷區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞存在自噬現(xiàn)象。高壓氧能夠上調(diào)腦缺血再灌注損傷大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬，促進(jìn)血腦屏障修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)只研究了缺血再灌注損傷后6 h 的高壓氧治療，其他時(shí)間窗的介入可能會(huì)引起不同的結(jié)果。未來還可采用其他檢測(cè)手段，包括電鏡下觀察自噬體的形成等，進(jìn)一步確定高壓氧對(duì)腦梗死大鼠的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。