凍干豬膽粉的HPLC指紋圖譜和含量測(cè)定方法的研究

王進(jìn)吉 鄒瓊 張磊 伍曉萍 陳彤

摘要：篩選HPLC色譜條件，用于凍干豬膽粉的HPLC指紋圖譜測(cè)定及凍干豬膽粉中?；秦i去氧膽酸含量的測(cè)定，并與5批非凍干技術(shù)制備的市售豬膽粉進(jìn)行對(duì)比。應(yīng)用Shim-pack GIST-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH=4.3）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0.01～20.00 min，29%～40%A;20.01～30.00 min，29%～29%A），流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm。采用上述色譜條件測(cè)定10批凍干豬膽粉，通過(guò)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”建立凍干豬膽粉對(duì)照指紋圖譜，確定11個(gè)共有峰，供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜經(jīng)相似度計(jì)算，規(guī)定5分鐘后的色譜峰相似度不得低于0.95。10批凍干豬膽粉的指紋圖譜相似度均大于0.995;5批市售豬膽粉中只有1批的相似度大于0.95。10批凍干豬膽粉中?；秦i去氧膽酸的平均含量為5.56%±6.33%，5批市售豬膽粉中?；秦i去氧膽酸的平均含量為0.99%±132.32%，僅有一批符合規(guī)定。冷凍干燥法制備的豬膽粉質(zhì)量?jī)?yōu)于5批市售產(chǎn)品，凍干技術(shù)可用于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)豬膽粉。

關(guān)鍵詞：凍干豬膽粉;HPLC-UV法;指紋圖譜;?；秦i去氧膽酸;含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2022）04-0064-06

《中國(guó)藥典》2000年版一部開始收載豬膽粉，之后的歷版藥典也均有收載[1]。2020年版《中國(guó)藥典》記載豬膽粉味苦，性寒，歸屬肝、膽、肺、大腸經(jīng);有清熱潤(rùn)燥，止咳平喘，解毒的功效，主要用于頓咳，哮喘，熱病燥渴，目赤，喉痹，黃疸，泄瀉，痢疾，便秘，癰瘡腫毒的治療[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明豬膽汁有鎮(zhèn)咳[3]、抗炎[4]、抑菌[5]、利膽、抗過(guò)敏[6]、抗腫瘤[7]等藥理作用，臨床上用于百日咳[8]、肝炎[9]、陰道炎[10]、肝內(nèi)膽管結(jié)石[11]、腸梗阻[12]等的治療。2020年版《中國(guó)藥典》中豬膽粉的制法為取豬膽汁，濾過(guò)，干燥，粉碎，即得[2]。其“含量測(cè)定”項(xiàng)下規(guī)定，按干燥品計(jì)算，含?；秦i去氧膽酸（taurohyodeoxycholic acid，1）不得少于2.0%。指紋圖譜是當(dāng)今國(guó)際公認(rèn)控制中藥質(zhì)量的質(zhì)控方法，主要用于中藥材加工、炮制等過(guò)程中的質(zhì)控[13]。

本課題組檢測(cè)市售豬膽粉，發(fā)現(xiàn)不同廠家的各批豬膽粉質(zhì)量差異大，且豬膽粉中含有膽紅素等熱敏成分。因此，本論文擬對(duì)本課題組所制備的凍干豬膽粉建立HPLC指紋圖譜，并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀（含DGU-20A真空在線脫氣機(jī)，LC-20AT四元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-M20A檢測(cè)器）

1.2 試藥 對(duì)照品1（中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量以96.8%計(jì)，批號(hào)：111943-201802），?；蛆Z去氧膽酸（2，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110846-2010007），甘氨豬去氧膽酸（3，成都德斯特生物技術(shù)有限公司，含量：97%，批號(hào)：DST191022-136）甘氨鵝去氧膽酸（4，成都德斯特生物技術(shù)有限公司，含量：98%，批號(hào)：DSTDG017601）。豬膽購(gòu)自云南省昆明市呈貢區(qū)鴻騰生豬定點(diǎn)屠宰場(chǎng)，市售5批豬膽粉分別購(gòu)于昆明中藥材批發(fā)市場(chǎng)、上海紅花藥業(yè)、安徽亳州千草堂中藥材批發(fā)市場(chǎng)、陜西天璽尚品商貿(mào)有限公司、西安通澤生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，磷酸二氫鈉為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Shim-pack GIST-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相乙腈（A）-0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（磷酸調(diào)pH=4.3）（B），梯度洗脫（0.01～20.00 min，29%～40%A;20.01～30.00 min，29%～29%A）;流速1.0 mL·min-1;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm;進(jìn)樣量5 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取1～4號(hào)對(duì)照品約2.5 mg，精密稱定，分別置5 mL的量瓶中，加甲醇溶解，定容。精密移取各上述4種母液1 mL置同一個(gè)5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.22 um濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 凍干豬膽粉供試品溶液的制備 取凍干豬膽粉末約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲處理20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 um濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 市售豬膽粉供試品溶液的制備 取市售豬膽粉約0.5 g，精密稱定，按照“2.4.1”進(jìn)行制備，即得。

2.4 凍干豬膽粉HPLC指紋圖譜

2.4.1 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn) 取凍干豬膽粉供試品溶液按上述色譜條件下進(jìn)樣，分析測(cè)定連續(xù)進(jìn)樣6次，以3（峰7）為參照峰（S），計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.1%，相對(duì)峰面積RSD<3.5%（n=6），表明儀器精密度良好。

取同批號(hào)凍干豬膽粉6份，按2.4.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定，以3（峰7）為參照峰（S），計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.1%，相對(duì)峰面積RSD<3.6%（n=6），表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

取供試品溶液分別在0、4、8、12、24、36h，按上述色譜條件下進(jìn)行分析檢測(cè)，以3（峰7）為參照峰（S），計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<0.41%，相對(duì)峰面積RSD<4.8%（n=6），說(shuō)明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定 分別取對(duì)照品1至4號(hào)按對(duì)照品適量，精密稱定，制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。10批自制凍干豬膽粉按供試品溶液制備，在上述色譜條件下進(jìn)樣。通過(guò)對(duì)照品保留時(shí)間分別標(biāo)定1（峰5）、3（峰7）、2（峰10）、4（峰11）。將各批供試品的色譜圖以AIA格式導(dǎo)入中國(guó)藥典推薦中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版），剪切前5 min溶劑峰，選定S1為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1，中位數(shù)法進(jìn)行多點(diǎn)校正生成對(duì)照?qǐng)D譜R，10批自制凍干豬膽粉供試品溶液確定11個(gè)色譜峰為共有峰。

2.4.3 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)（2012版）”處理，以系統(tǒng)生成的參照?qǐng)D譜為對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算10批凍干豬膽粉的相似度，結(jié)果見表1，數(shù)據(jù)表明10批凍干豬膽粉相似度均大于0.98。選峰面積最大3標(biāo)記為S峰，計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，結(jié)果分別見表2、表3。

2.4.4 市售豬膽粉的相似度評(píng)價(jià) 5批市售豬膽粉按供試品溶液制備，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。將5批供試品的色譜圖以AIA格式導(dǎo)入中國(guó)藥典推薦中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版），剪切前5 min溶劑峰，選定上述10批凍干豬膽粉生成的對(duì)照?qǐng)D譜R為參照?qǐng)D圖譜，時(shí)間窗寬度為0.1，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算相似度，結(jié)果見表4，5批市售豬膽粉的指紋圖譜僅有1批相似度大于0.95，其余4批均不符合規(guī)定。

2.5 凍干豬膽粉和市售豬膽粉含量測(cè)定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別配制濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg·mL-1的1溶液，在含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=2×106X-1550.1，r=1。

2.5.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn) 取凍干豬膽粉供試品溶液按上述色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定連續(xù)進(jìn)樣6次，1峰面積RSD<0.3%（n=6），表明儀器精密度良好。

取同批號(hào)凍干豬膽粉6份，按供試品溶液制備，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測(cè)定，1峰面積RSD<1.3%（n=6），表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

取凍干豬膽粉供試品溶液別在0、1、2、4、8、12、24、36 h，按上述色譜條件下進(jìn)行分析檢測(cè)，36 h內(nèi)1峰面積RSD<1.0%（n=8）。說(shuō)明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取凍干豬膽粉適量，按供試品溶液進(jìn)行制備，制成5 mg·mL-1凍干豬膽粉溶液。精密稱取1對(duì)照品適量，加甲醇制成0.26 mg·mL-1的1溶液，取凍干豬膽粉溶液、1溶液各1 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻取適量過(guò)0.22 um微孔濾膜，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示平均回收率為101.47%，RSD（n=6）為0.68%。

2.5.4 樣品含量測(cè)定 取上述10批凍干豬膽粉和5批市售豬膽粉按供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行含量測(cè)定，10批凍干豬膽粉中1的平均含量為（5.56±6.33）%，5批市售豬膽粉中1的平均含量為（0.99±132.32）%，僅1批符合規(guī)定。

3 討論

指紋圖譜的色譜條件的建立：分別按《中國(guó)藥典》2020年版第一部豬膽粉含量測(cè)定項(xiàng)下甲醇-0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（70∶30）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.4）和文獻(xiàn)[15]乙腈-0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉（磷酸調(diào)pH4.4）梯度洗脫（0.01～40.00 min：28%～36%乙腈;40.01～50 min：28%～28%乙腈）兩個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)[15]梯度洗脫的圖譜出峰較多，峰形好，分離度較佳，僅存在少部分峰重疊的問(wèn)題。進(jìn)一步考相緩沖鹽溶液的pH值、柱溫、進(jìn)樣量和梯度洗脫條件，篩選出最佳方案，即以乙腈-0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH4.3）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0.01～40 min：乙腈29%～40%;20.01～30 min：29%～29%），能分離出11個(gè)凍干豬膽粉色譜峰，較文獻(xiàn)[15]的色譜條件多分離出4個(gè)峰，且測(cè)定時(shí)間短。

在本色譜條件下利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)建了由11個(gè)共有峰組成的凍干豬膽粉指紋圖譜，10批凍干豬膽粉樣品的指紋圖譜相似度高于0.995，規(guī)定5分鐘后的色譜峰相似度不得低于0.95，10凍干豬膽粉樣品的指紋圖譜均符合規(guī)定;5批市售豬膽粉的指紋圖譜僅有1相似度符合規(guī)定。

在本色譜條件下測(cè)定1的含量，10批凍干豬膽粉1的平均含量為5.56%±6.33%，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn);而市售豬膽粉5批中僅有1批符合規(guī)定。

4 結(jié)論

采用冷凍干燥技術(shù)成功制得凍干豬膽粉，得到的凍干豬膽粉顏色鮮黃、潔凈。篩選的色譜條件可作為凍干豬膽粉和豬膽粉指紋圖譜和含量測(cè)定的色譜條件，用于測(cè)定的凍干豬膽粉和市售豬膽粉。5批市售豬膽粉只有1批的指紋圖譜相似度和含量測(cè)定結(jié)果符合規(guī)定，還需進(jìn)一步購(gòu)買和測(cè)定市售豬膽粉的質(zhì)量，找出市售豬膽粉質(zhì)量不符合規(guī)定的原因。

綜上，凍干技術(shù)可用于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)豬膽粉，可作為制備豬膽粉的新技術(shù)。

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（收稿日期：2022-01-26）