發(fā)酵時間對青稞全粉漿香氣成分的影響

朱俊超，張成志，張增江，鄭波，陳玲

（淀粉與植物蛋白深加工教育部工程研究中心，廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點實驗室，華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

青稞是一種高原粗糧作物，包含膳食纖維、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)。有研究表明，相比于高粱、紫米和大黃米等粗糧作物，青稞具有更高含量的膳食纖維和亞麻酸，分別達12.88%和4.19%[1,2]。與燕麥相比，青稞中β-葡聚糖和礦物質(zhì)的含量更高，含量高達8.72%，其中β-葡聚糖可以有效地降低血漿膽固醇和調(diào)節(jié)血糖水平，有益身體健康[3]。高品質(zhì)營養(yǎng)健康食品已成為人們新的消費趨勢，因此基于高營養(yǎng)價值理念所創(chuàng)制的青稞食品，如青稞面條、青稞奶茶、青稞面包等逐漸受到消費者的青睞與追捧[4]。

發(fā)糕是一種中國傳統(tǒng)食品，屬于谷物發(fā)酵類食物。發(fā)酵是谷物發(fā)酵類食物加工過程中最為重要的工序，可形成令人愉悅的特征風(fēng)味。因此，掌握谷物食品發(fā)酵過程中特征風(fēng)味物質(zhì)的演變規(guī)律對高品質(zhì)營養(yǎng)健康食品的創(chuàng)制十分關(guān)鍵。近年來，低GI食品受到了大家的廣泛關(guān)注，傳統(tǒng)主食食品已向全谷物食轉(zhuǎn)變。因此，利用青稞全谷物制作而成的食品如青稞發(fā)糕、青稞饅頭、青稞面包等逐漸受到關(guān)注。經(jīng)過前期實驗探索發(fā)現(xiàn)，不同的發(fā)酵條件獲得的青稞制品的風(fēng)味差異很大，尤其是經(jīng)歷不同發(fā)酵時間獲得的青稞制品風(fēng)味差異最為顯著。由此可見，掌握青稞全粉漿發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的演變規(guī)律對青稞發(fā)酵類食品的創(chuàng)制具有重要意義，而目前該研究鮮少報道。

頂空固相微萃取是一種有效、快速的分析技術(shù)，能夠快速分析風(fēng)味物質(zhì)中的揮發(fā)性成分[5,6]。本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上[7]，基于青稞發(fā)糕的最佳實驗制備條件，采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對不同發(fā)酵時間下青稞全粉漿中揮發(fā)性成分的變化進行了分析，明晰了不同發(fā)酵時間的青稞全粉漿中揮發(fā)性成分的種類和含量，闡明了不同種類的揮發(fā)性風(fēng)味成分對系統(tǒng)整體風(fēng)味的貢獻程度和呈味表現(xiàn)，為青稞全粉漿香氣成分的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞粉（食用級），青稞藏禾源有限公司；酵母，安琪酵母有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S電子天平，德國Sartorius公司；C21-SDHC8E15D電磁灶，紹興SUPOR生活電器有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱，上海恒科儀器有限公司；ACAR/PDMS/DVB型固相微萃取頭，青島貞正分析儀器有限公司；三重串聯(lián)四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青稞全粉漿的制作

青稞全粉漿的制作參考張成志等[8]的方法并作適當修改。酵母濃度為15%（m/m），放置37 ℃培養(yǎng)箱5 min培養(yǎng)；分別取50 g青稞粉和白砂糖于500 mL燒杯中，加100 mL蒸餾水并攪拌均勻，滴加酵母溶液（添加量控制在0.3%～0.7%）。青稞全粉漿倒入模具之中，覆蓋保鮮膜，放置于37 ℃的生化培養(yǎng)箱進行發(fā)酵，時間分別是3 h、6 h、12 h。

1.3.2 青稞全粉漿揮發(fā)性成分的萃取參考梁言[9]的方法，移取8 g樣品于頂空瓶中。測試條件如下：45 ℃保溫10 min，萃取20 min，升溫至250 ℃解吸5 min。為了避免出現(xiàn)交叉污染，每次萃取之前對萃取頭進行老化處理，溫度是270 ℃，時間是10 min。

1.3.3 氣質(zhì)聯(lián)用的分析條件

氣相色譜：采取HP-5石英毛細管柱；首先于50 ℃穩(wěn)定2 min，然后按照2 ℃/min的升溫速度進行升溫，直至溫度為70 ℃。然后再次升溫，速率為6 ℃/min，于250 ℃穩(wěn)定2 min，并進行注射，分流比為5:1。

質(zhì)譜：采用電子轟擊離子源，測試條件如下：離子源溫度為250 ℃，電子能量為70 eV，四極桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為280 ℃。

1.3.4 青稞全粉漿揮發(fā)性成分的分析

定性分析：使用電腦軟件Mass Hunter對GC-MS圖譜進行分析處理，然后和NIST14庫中的標準圖譜進行對比分析，確定系統(tǒng)中的揮發(fā)性成分，結(jié)合Chemical Book庫中關(guān)于該揮發(fā)性成分的信息，判斷這種成分的揮發(fā)性質(zhì)（SI＜700的物質(zhì)不計算在內(nèi)）。

含量分析：采取峰面積歸一化的方法，得出各揮發(fā)性成分的峰面積（AU）和相對含量。

1.3.5 青稞全粉漿揮發(fā)性成分的香氣評價

氣味活度值（OAV）是一種可以反映系統(tǒng)中的部分揮發(fā)性成分對系統(tǒng)整體的香氣貢獻程度的指標，計算方法如下：

式中：

c——揮發(fā)性風(fēng)味的絕對濃度，μg/kg；

T——揮發(fā)性風(fēng)味的感覺閾值，μg/kg。

雖然通過OAV值可以反映部分揮發(fā)性成分對系統(tǒng)整體的香氣貢獻值，但是系統(tǒng)中揮發(fā)性成分數(shù)量多，通過對這些成分進行測定得到的結(jié)果誤差大。為了降低誤差以及便于計算，使用相對含量進行計算，即相對氣味活度值（ROAV），為了便于分析，我們定義系統(tǒng)中對揮發(fā)性風(fēng)味貢獻最大的組分：ROVA=100，對其他組分則有：

式中：

ROAVi——該成分對系統(tǒng)整體的相對氣味活度值；

rci——該成分相對含量；

Ti——該成分的感覺閾值；

rcmax——系統(tǒng)中對揮發(fā)性風(fēng)味貢獻最大的成分的相對含量；

Tmax——系統(tǒng)中對揮發(fā)性風(fēng)味貢獻最大的成分的感覺閾值。

由公式可知，所有組分的ROAV值≤100，揮發(fā)性成分的ROVA反映其對體系的貢獻程度。ROVA愈大，貢獻程度愈大。結(jié)合其他文獻關(guān)于ROAV值的研究[10]，1＜ROAV≤100定義為系統(tǒng)的關(guān)鍵風(fēng)味成分，0.1＜ROAV≤1表示該揮發(fā)性風(fēng)味對系統(tǒng)整體風(fēng)味評價具有重要的修飾作用，而ROAV≤0.1為該系統(tǒng)中的潛在成分。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析處理

使用Mass Hunter軟件對氣質(zhì)聯(lián)用圖譜進行處理，借助Origin 2018軟件繪制圖譜。采用IBM SPSS Statistics 23軟件數(shù)據(jù)分析。p＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 青稞全粉漿揮發(fā)性成分定性分析

微生物發(fā)酵是谷物發(fā)酵類食品如發(fā)糕等制作中的一道關(guān)鍵工藝，通過研究不同發(fā)酵時間下青稞全粉漿揮發(fā)性成分的演變規(guī)律可為青稞發(fā)糕感官品質(zhì)優(yōu)劣提供科學(xué)依據(jù)[12,13]。由圖1可知，未發(fā)酵青稞全粉漿中的主要揮發(fā)性成分是醛類、醇類、烷烴類以及雜環(huán)類，醇類和酯類是發(fā)酵后的青稞全粉漿的主要揮發(fā)性成分。青稞粉漿在發(fā)酵6 h后首次檢出了羧酸類，未檢測出醛類；在經(jīng)過12 h發(fā)酵后首次檢出了酮和芳香類，且醛類被再次檢測出來，而雜環(huán)類和胺類未檢測出。

2.2 青稞全粉漿揮發(fā)性成分定量分析

圖2為三種發(fā)酵時間下青稞全粉漿的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量。未發(fā)酵的青稞全粉漿中檢測出14種揮發(fā)性成分，種類最多的是醛類（5種），其次是烷烴類（3種）、醇類（3種）和雜環(huán)類（2種），酯類（1種）最少，這與青稞及糌粑中風(fēng)味物質(zhì)的變化分析結(jié)果相似[14,15]；其中占比最高的是醛類（76.59%），其他幾類化合物占比依次減少，分別是：醇類（8.53%）、烷烴類（7.69%）、雜環(huán)類（3.96%）和酯類（3.23%）。發(fā)酵3 h的青稞全粉漿中檢測出22種揮發(fā)性成分，酯類（9種）的種類最多，其次是醇類（5種）、烷烴類（4種）和胺類（2種），最少的是醛類（1種）和雜環(huán)類（1種）；通過與未發(fā)酵的青稞全粉漿進行比較可知，酯類和醇類的相對含量變高，分別占比45.09%和45.54%，最低的是醛類僅占有0.37%，這可能是因為發(fā)酵過程中酵母菌和細菌作用導(dǎo)致葡萄糖降解和氨基酸分解產(chǎn)生大量酯類[16]。在發(fā)酵6 h后的青稞全粉漿中，檢測出22種揮發(fā)性成分，其中酯類（9種）最多，其次是烷烴類（5種）、醇類（3種），種類較少的是雜環(huán)類（2種）、胺類（2種）和羧酸類（1種）；相比于3 h發(fā)酵，經(jīng)過6 h的發(fā)酵后的粉漿中，首次出現(xiàn)了羧酸類，卻沒有醛類，造成這種情況的原因可能是青稞全粉漿發(fā)酵過程中醛類轉(zhuǎn)化成了醇類和酯類，殘余部分氧化生成了羧酸類；而且與發(fā)酵3 h相比，酯類（50.20%）的相對含量略高，然后分別是醇類（40.59%）、烷烴類4.65%，雜環(huán)類1.20%，胺類1.67%。在發(fā)酵12 h后的青稞全粉漿中，揮發(fā)性成分共有24種，其中酯類（6種）、醇類（4種）和烷烴類（5種）種類較多，醛類（3種）和芳香類（3種）次之，相對較少的是羧酸類（2種）和酮類（1種）。經(jīng)過12 h發(fā)酵后的粉漿，首次檢測到了酮類（1.48%）和芳香類化合物（5.72%）。而且檢測出了醛類物質(zhì)，其含量為11.41%，醛類物質(zhì)是游離氨基酸在微生物作用下脫氨和去羰基反應(yīng)生成，也有學(xué)者認為醛類物質(zhì)形成與美拉德反應(yīng)有關(guān)[17,18]。雜環(huán)類和胺類均未檢出，可知青稞全粉漿香氣品質(zhì)有了較為明顯的變化。劉沖沖[18]采用HS-SPME-GC-MS方法分析不同發(fā)酵時間的酒醅中的風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)肚里黃酒醅含有更多的醇類化合物和羰基類化合物，而黑老鴉青稞酒醅含有更多的酯類化合物。酯和醇類的相對含量分別為38.87%和37.15%，與發(fā)酵6 h的青稞全粉漿相比有所下降。其他幾類揮發(fā)性化合物的相對含量占比分別是羧酸類0.62%，烷烴類4.00%。發(fā)酵之后的青稞全粉漿中相對含量較高的組分一般為酯類和醇類，隨著發(fā)酵時間的增加，酯類和醇類的變化趨勢呈現(xiàn)先增加后降低，當發(fā)酵時間為6 h時酯類含量最高。酵母降解脂質(zhì)產(chǎn)生的醇和酸發(fā)生酯化反應(yīng)，長時間的發(fā)酵及大量的酵母促進了酯化反應(yīng)的進行[19]。此外，未發(fā)酵和3種發(fā)酵時間的青稞全粉漿種均有不同程度的雜環(huán)類物質(zhì)被檢測出，主要為呋喃化合物，產(chǎn)生途徑可能是還原糖和氨基酸的反應(yīng)或美拉德反應(yīng)中Amadori重排化合物的熱降解反應(yīng)[17]。

為了明晰揮發(fā)性風(fēng)味對系統(tǒng)整體的影響程度，結(jié)合前人文獻記錄[8]從檢測得到的所有數(shù)據(jù)中遴選出了21種香氣顯著的化合物。表1是經(jīng)過Mass Hunter對GC-MS圖譜分析得出的經(jīng)歷不同發(fā)酵時間后系統(tǒng)中21種香氣特征顯著的化合物的相對含量。由表1可知，正己醛（59.53%）和正己醇（6.31%）是未發(fā)酵青稞全粉漿中的主要揮發(fā)性成分，但經(jīng)過發(fā)酵之后，其相對含量顯著降低，甚至未檢出；發(fā)酵3 h的青稞全粉漿中，相對含量最高的是辛酸乙酯（16.28%）、其次是苯乙醇（14.47%）和正己酸乙酯（13.46%），最少的是乙酸異戊酯（8.36%），它們都是主要揮發(fā)性成分。發(fā)酵6 h得到的結(jié)果與發(fā)酵3 h相似，主要是苯乙醇（17.02%）、乙酸異戊酯（10.14%）、正己酸乙酯（14.94%）和辛酸乙酯（17.87%）；發(fā)酵12 h得到的青稞全粉漿中的揮發(fā)性成分變化顯著，主要表現(xiàn)為：揮發(fā)性成分相對含量最高的是異戊醇（20.58%），其次是苯乙醇（16.42%）、正己酸乙酯（14.78%）和乙酸異戊酯（12.65%），相對含量依次減少。

在未發(fā)酵的青稞全粉漿的揮發(fā)性成分中，占比最大的是醛類，它是系統(tǒng)中的主要香氣成分，這與劉洪[20]的研究結(jié)果一致。經(jīng)歷過不同時間發(fā)酵后的青稞全粉漿中，醇類和酯類是主要的揮發(fā)性成分，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是因為醛類經(jīng)過微生物的發(fā)酵作用之后轉(zhuǎn)化成了醇類和酯類，影響了系統(tǒng)的香氣評價[21]。具體而言，發(fā)酵產(chǎn)物中存在的醇類應(yīng)該是多不飽和脂肪酸分解產(chǎn)生，或者是酵母菌發(fā)生分解和糖代謝或氨基酸發(fā)生脫氨形成[22]。而且醇類的香氣閾值會受到其羥基數(shù)目、不飽和鍵數(shù)目以及位置的影響；脂肪醇由于受到了碳原子數(shù)目的影響，其香氣主要呈現(xiàn)為酒香味、果香味以及油脂氣味[23,24]。由于體系中醇類與有機酸之間相互作用生成了風(fēng)味閾值低的酯類物質(zhì)，對風(fēng)味有較大貢獻，呈現(xiàn)香味顯著的水果香氣（具體是碳數(shù)較低的酯類）[25]。然而，發(fā)酵12 h的青稞全粉漿中檢測出醛類，造成這種情況的原因可能是酵母等微生物氧化體系發(fā)生Strecker降解而重新形成了香氣閾值低的醛類[26]。蒲立檸等[27]認為青稞中脂肪和蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生揮發(fā)性成分也可能改變體系的香氣。

2.3 青稞全粉漿揮發(fā)性成分的貢獻程度

采用歸一化法計算得到的峰面積和相對含量，并不能準確知道其對系統(tǒng)香氣評價的貢獻程度。當一種處在最低濃度狀態(tài)的揮發(fā)性風(fēng)味成分依然存在嗅覺感應(yīng)，這個濃度被稱作對應(yīng)組分的感覺閾值[28]。揮發(fā)性風(fēng)味成分的ROAV值，可以反映其對青稞全粉漿香氣評價的貢獻程度。

表2是三種發(fā)酵時間下青稞全粉漿揮發(fā)性成分的感覺閾值和ROAV值。由表2可知，在未經(jīng)發(fā)酵的青稞全粉漿中：1-辛烯-3-醇、正己醛、正庚醛、2-庚烯醛、反-2-辛烯醛和2-正戊基雜環(huán)這6種化合物是關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分，其ROAV值分別是16.41、100、7.45、4.72、11.48和59.11。經(jīng)過3 h發(fā)酵的青稞全粉漿中。壬醛（ROAV=100）是關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分；辛酸乙酯（ROAV=0.38）是重要修飾作用。發(fā)酵6 h的青稞全粉漿中，辛酸乙酯ROAV=100，其次是正己酸乙酯、棕櫚酸乙酯、乙酸異戊酯和月桂酸乙酯，ROAV值分別為19.45、12.04、7.77和6.34，它們都是關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分，這與前文關(guān)于香氣貢獻度的研究結(jié)果一致；癸酸乙酯（ROAV=0.28）是重要修飾作用；ROAV＜0.10的揮發(fā)性成分有三種，分別是苯乙醇、庚酸乙酯、乙酸苯乙酯和壬酸乙酯。經(jīng)歷了12 h發(fā)酵的青稞全粉漿中，壬醛（ROAV=1.75）和(E,E)-2,4-壬二烯醛（ROAV=100）是關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分；正己醛（ROAV=0.7）和甲基庚烯酮（ROAV=0.15）是重要修飾揮發(fā)性風(fēng)味成分。

表2 三種發(fā)酵時間下青稞全粉漿揮發(fā)性成分的ROAV值Table 2 ROAV value of volatile components of highland barley flour slurry under three fermentation times

2.4 青稞全粉漿揮發(fā)性風(fēng)味成分的呈味表現(xiàn)

圖3a表示的是不同發(fā)酵時間下青稞全粉漿的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分ROVA值堆積柱形圖，圖3b為關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分相對含量的香氣輪廓圖。結(jié)合圖3中各化學(xué)成分的風(fēng)味特征描述，選擇ROVA值較高的風(fēng)味物質(zhì)為主體特征，可以表征不同發(fā)酵時間下青稞全粉漿的風(fēng)味特征。結(jié)果表明，正己醛是未發(fā)酵的青稞全粉漿中的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分，它貢獻了生油脂和蘋果香味，脂肪香由反-2-辛烯醛貢獻，豆香、果香等果蔬香味由2-正戊基雜環(huán)貢獻，1-辛烯-3-醇貢獻了藥草香并帶有強烈、獨特的青草香，青草香和果子香分別由2-庚烯醛和正庚醛貢獻；經(jīng)歷了3 h發(fā)酵的青稞全粉漿中，蜜蠟花香由唯一的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分壬醛貢獻，并可能伴隨著柑橘香和醋味，此外，伴隨著類似白蘭地香氣的辛酸乙酯對粉漿也具有重要的修飾功能；經(jīng)歷了6 h發(fā)酵的青稞全粉漿中，具有最重要的貢獻度的是辛酸乙酯，乙酸異戊酯、正己酸乙酯、月桂酸乙酯和棕櫚酸乙酯分別貢獻了令人愉悅的香蕉味、水果香、花生味以及微弱蠟香、奶香；經(jīng)歷了12 h發(fā)酵的青稞全粉漿中，ROAV值最大的(E,E)-2,4-壬二烯醛為粉漿貢獻了難聞的油脂味，伴隨著壬醛貢獻的蜜蠟花香和柑橘味。

3 結(jié)論

本研究基于固相微萃取技術(shù)系統(tǒng)地研究了不同發(fā)酵時間對青稞全粉漿中的揮發(fā)性成分組成和差異的影響，通過與NIST14標準譜庫對比鑒定得到了21種典型的揮發(fā)性成分，并根據(jù)各揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量，闡明了在不同發(fā)酵時間下關(guān)鍵揮發(fā)性成分對青稞全粉漿的貢獻程度及呈味表現(xiàn)。結(jié)果顯示不同發(fā)酵時間的青稞全粉漿中揮發(fā)性成分組成與含量具有顯著性差異，未發(fā)酵、發(fā)酵3 h和發(fā)酵12 h青稞全粉漿中，壬醛、正己醛和(E,E)-2,4-壬二烯醛貢獻了較大的ROVA值，所產(chǎn)生的生油脂、醋味和雞湯味等風(fēng)味令人不悅。而發(fā)酵6 h的青稞全粉漿中酯類占比最高（50.20%），乙酸異戊酯、正己酸乙酯和辛酸乙酯是關(guān)鍵揮發(fā)性成分，ROAV值分別為7.77、19.45、100，貢獻了令人愉悅的水果香氣，包括呈現(xiàn)白蘭地香氣的辛酸乙酯和水果香氣的乙酸異戊酯等，此時呈味最佳，令人愉悅的酯類風(fēng)味可以賦予青稞制品特殊的香氣。本研究結(jié)果為青稞全粉漿香氣品質(zhì)的評價提供了有效方法。