O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者化學(xué)治療敏感性及生存的影響

岳新鵬，李 鑫，劉增強(qiáng)，巨 濤，趙 茹，王鑫超

(延安大學(xué)咸陽醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 咸陽 712000)

腦膠質(zhì)瘤是原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，可呈浸潤性生長，具有高度惡性轉(zhuǎn)化趨勢，由于腦組織結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜，手術(shù)切除的范圍有限，患者預(yù)后較差[1]。化學(xué)治療是腦膠質(zhì)瘤的重要補(bǔ)充手段，烷化劑是目前腦膠質(zhì)瘤的常用化學(xué)治療藥物，具有可透過血腦屏障、毒副作用小等特點(diǎn)，但部分患者因腫瘤耐藥而導(dǎo)致化學(xué)治療失敗，預(yù)后不佳[2]。研究顯示，腫瘤耐藥的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性或化學(xué)治療誘導(dǎo)的耐藥基因表達(dá)有關(guān)[3]。甲基化是DNA修飾的一種形式，可以在不改變DNA序列的情況下導(dǎo)致相關(guān)基因功能的缺失，是目前研究的癌癥治療靶點(diǎn)之一。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)是機(jī)體修復(fù)烷基加合物的關(guān)鍵酶，烷化劑可導(dǎo)致DNA-O6位烷基化合物形成，使鳥嘌呤O6位甲基化，修復(fù)DNA損傷[4]。有研究顯示，MGMT基因與腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后有關(guān)[5]，但其甲基化后對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者化學(xué)治療敏感性及預(yù)后的影響仍有待探討。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)法檢測膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化水平，探討MGMT基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者化學(xué)治療敏感性及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2014年1月至2017年8月延安大學(xué)咸陽醫(yī)院收治的腦膠質(zhì)瘤患者為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)原發(fā)性腫瘤；(2)所有患者行手術(shù)切除治療，術(shù)后留取新鮮膠質(zhì)瘤組織和瘤旁組織標(biāo)本，保存于液氮中備用；(3)術(shù)后給予同步放射治療、化學(xué)治療聯(lián)合替莫唑胺輔助治療；(4)術(shù)后組織病理學(xué)檢查證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者預(yù)計(jì)生存期<6個(gè)月；(2)Karnofsky評(píng)分<60分；(3)有放射治療、化學(xué)治療禁忌證。本研究共納入腦膠質(zhì)瘤患者90例，男51例，女39例；年齡26～75(58.65±8.50)歲；世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)[6]：Ⅱ級(jí)18例，Ⅲ級(jí)46例，Ⅳ級(jí)26例；組織學(xué)類型：星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤43例，少枝細(xì)胞瘤22例，室管膜瘤17例，混合膠質(zhì)瘤8例。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者和(或)家屬簽署知情同意書。

1.2 MSP法檢測膠質(zhì)瘤組織和瘤旁組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化水平取液氮中保存的膠質(zhì)瘤組織和瘤旁組織，裂解液裂解，使用GenEluteTM哺乳動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒(美國默克公司)提取樣本DNA；10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳和Multiskan FC光吸收分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技中國有限公司)檢測DNA濃度及純度，抽提的DNA以亞硫酸氫鈉修飾處理，修飾后未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，甲基化胞嘧啶保持不變；以甲基化的DNA為模板，設(shè)計(jì)MGMT基因甲基化和非甲基化引物序列，進(jìn)行MSP檢測。甲基化引物序列：正向?yàn)?′-TAAGTGTCATGCTAATCCGTTAACAGT-3′，反向?yàn)?′-CTATCTGAGGAATCCAAGCTGCTGCTA-3′；非甲基化引物序列：正向?yàn)?′-GATTGATCTGTGGATAGTCATGCTTAAT-3′，反向?yàn)?′-AAGTCTTAGCTAGGACATAGTGCTGAT-3′；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸 5 min。以CpG甲基轉(zhuǎn)移酶(賽默飛世爾科技中國有限公司)處理的胎盤DNA和正常外周血淋巴細(xì)胞DNA作為非甲基化和甲基化對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 25 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察。分離條帶中出現(xiàn)非甲基化條帶擴(kuò)增但無甲基化條帶擴(kuò)增則為甲基化陰性，有甲基化條帶或甲基化與非甲基化條帶均出現(xiàn)則為甲基化陽性。

1.3 治療方案所有患者行手術(shù)治療，術(shù)后行同步放射治療、化學(xué)治療聯(lián)合替莫唑胺輔助治療，放射治療期間給予替莫唑胺膠囊(芬蘭Orion Corporation，進(jìn)口藥品注冊證號(hào)H20171091)75 mg·m-2，口服，每日1次，連續(xù)服用42 d；放射治療結(jié)束后給予替莫唑胺膠囊150 mg·m-2，口服，每日1次，連續(xù)5 d，停藥23 d，28 d為1個(gè)周期，連續(xù)治療6個(gè)周期。

1.4 術(shù)后隨訪所有患者術(shù)后以復(fù)查、電話等方式進(jìn)行隨訪36個(gè)月，記錄患者的復(fù)發(fā)、無進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)和總生存期(overall survival,OS)情況。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤組織與瘤旁組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性率比較90例腦膠質(zhì)瘤患者中，膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陰性51例，陽性39例，陽性率為43.33%(39/90)；瘤旁組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陰性86例，陽性4例，陽性率為4.44%(4/90)；膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性率顯著高于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.430，P<0.05)。

2.2 MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與化學(xué)治療敏感性的關(guān)系90例腦膠質(zhì)瘤患者中，未復(fù)發(fā)15例，復(fù)發(fā)75例，復(fù)發(fā)率為83.33%(75/90)；75例復(fù)發(fā)患者膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性30例，陽性率為42.86%(30/70)；15例未復(fù)發(fā)患者膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性9例，陽性率為60.00%(9/15)；復(fù)發(fā)患者膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性率顯著低于未復(fù)發(fā)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.978，P<0.05)。

2.3 MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與腦膠質(zhì)瘤患者生存的關(guān)系39例膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性患者的PFS、OS分別為(58.69±3.36)、(82.36±4.56)周， 51例膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陰性患者的PFS、OS分別為(52.74±3.08)、(78.76±4.01)周； 膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性患者的PFS、OS顯著長于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.730、3.932，P<0.05)。

2.4 腦膠質(zhì)瘤患者生存影響因素單因素分析結(jié)果見表1。截至術(shù)后36個(gè)月，90例患者中存活28例，死亡62例。單因素生存分析顯示，年齡、手術(shù)切除方式、腫瘤臨床分期、MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與腦膠質(zhì)瘤患者生存有關(guān)(P<0.05)，而性別、腫瘤直徑、Karnofsky評(píng)分、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤部位與腦膠質(zhì)瘤患者生存無關(guān)(P>0.05)。

表1 腦膠質(zhì)瘤患者生存影響因素單因素分析

2.5 腦膠質(zhì)瘤患者生存影響因素Cox回歸分析結(jié)果見表2。Cox回歸模型分析顯示，年齡>40歲、手術(shù)次全切是影響腦膠質(zhì)瘤患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性是腦膠質(zhì)瘤患者生存的保護(hù)因素(P<0.05)。

表2 腦膠質(zhì)瘤患者生存影響因素Cox回歸分析

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤具有顱內(nèi)廣泛浸潤、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。即使采用全切手術(shù)治療，術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，研究顯示，腦膠質(zhì)瘤患者采用早期手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后輔助放射治療、化學(xué)治療，總體復(fù)發(fā)率仍可高達(dá)70%，僅有約50%的患者術(shù)后生存時(shí)間超過12個(gè)月[7]。隨著腫瘤基因研究的發(fā)展，越來越多的相關(guān)分子標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)與腦膠質(zhì)瘤有關(guān)。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南推薦對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行MGMT基因啟動(dòng)子甲基化、端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因突變、編碼RAF家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因突變等檢測，為臨床治療方案的選擇提供依據(jù)[8]。MGMT作為DNA修復(fù)酶可抵消烷化劑引起的腫瘤細(xì)胞DNA毒性，影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性。因此，了解MGMT基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)腦膠質(zhì)瘤化學(xué)治療敏感性及預(yù)后的影響，對(duì)制定治療方案、改善患者預(yù)后有重要意義。

因血腦屏障的存在，腦膠質(zhì)瘤的化學(xué)治療方案多以烷化劑為基礎(chǔ)，烷化劑殺滅腫瘤細(xì)胞的機(jī)制是造成腫瘤細(xì)胞DNA的烷基化(甲基化、乙基化、氯乙基化等)損傷，阻斷DNA的復(fù)制[9]。MGMT存在2個(gè)烷基受體，能接受烷化劑損傷后細(xì)胞DNA-O6-烷基鳥嘌呤上的烷基，修復(fù)DNA的烷基化損傷，因此，對(duì)抗烷基化藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺滅作用是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的主要原因[10]。MGMT基因的轉(zhuǎn)錄受其啟動(dòng)子區(qū)CpG島嘧啶甲基化的影響，可使MGMT基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)或停止。研究顯示，MGMT mRNA、MGMT蛋白和酶活性的高低可決定腫瘤細(xì)胞對(duì)烷基化的耐藥性，其活性越高細(xì)胞對(duì)烷基化藥物耐藥越強(qiáng)[11-13]。薛智文等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MGMT基因啟動(dòng)子甲基化可影響非小細(xì)胞肺癌的化學(xué)治療敏感性。本研究結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性率顯著高于瘤旁組織，提示腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生伴有MGMT基因啟動(dòng)子甲基化；隨訪發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)患者膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性率低于未復(fù)發(fā)患者，提示MGMT基因啟動(dòng)子甲基化可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的耐藥性。本研究結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性患者的PFS、OS顯著長于陰性患者，提示MGMT基因啟動(dòng)子甲基化與腦膠質(zhì)瘤患者的生存有關(guān)；單因素生存分析顯示，年齡、手術(shù)切除方式、腫瘤臨床分期、MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與腦膠質(zhì)瘤患者生存有關(guān)，Cox回歸模型分析顯示，MGMT基因啟動(dòng)子甲基化陽性是腦膠質(zhì)瘤患者生存的保護(hù)因素。MGMT基因啟動(dòng)子甲基化可能通過抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的耐藥而提高化學(xué)治療效果，延長患者生存期，改善預(yù)后。BELL等[11]研究顯示，129例高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中，非MGMT基因啟動(dòng)子甲基化患者的PFS、OS顯著短于MGMT基因啟動(dòng)子甲基化患者。BINABAJ 等[15]薈萃分析結(jié)果表明，MGMT基因啟動(dòng)子甲基化腦膠質(zhì)瘤患者的PFS、OS更長。以上研究提示MGMT基因啟動(dòng)子甲基化可影響腦膠質(zhì)瘤患者的生存狀態(tài)。O′REGAN等[16]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者的MGMT甲基化狀態(tài)較穩(wěn)定，原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者的MGMT甲基化狀態(tài)不穩(wěn)定，但復(fù)發(fā)性與原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者的PFS、OS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能是因?yàn)閱?dòng)子區(qū)甲基化并非調(diào)節(jié)MGMT表達(dá)的唯一因素，還可受如單核苷酸多態(tài)性等其他因素影響，其具體原因仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，MGMT基因啟動(dòng)子甲基化水平與腦膠質(zhì)瘤患者化學(xué)治療敏感性有關(guān)，且MGMT基因啟動(dòng)子甲基化是腦膠質(zhì)瘤患者生存的獨(dú)立保護(hù)因素，可考慮將其作為腦膠質(zhì)瘤患者化學(xué)治療敏感性及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。