舍曲林對抑郁癥大鼠認知功能和海馬突觸后致密蛋白-95 mRNA表達的影響

翁孝琴，薛 山，羅彬彬，陳佐明

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院臨床心理科，河南 新鄉(xiāng) 453000;2.鄭州市第二人民醫(yī)院眼科，河南 鄭州 451100)

抑郁癥是嚴重的精神疾病，其患病率在世界范圍居高不下[1-2]，主要表現(xiàn)為情緒障礙和認知功能障礙，尤其在重度抑郁癥患者中，認知功能異常尤為明顯[3-4]。有研究顯示，抑郁癥患者會出現(xiàn)認知功能紊亂，而認知功能在一定程度上可以調(diào)節(jié)人的情緒[5-6]，因此，研究抑郁癥患者認知功能異常的發(fā)病機制尤為重要。炎癥細胞因子的激活可降低突觸可塑性[7-8],造成認知功能障礙,認知功能障礙與海馬功能和結構異常有關[9]。突觸后致密蛋白-95(post-synaptic density protein-95，PSD-95)是位于突觸后特化區(qū)內(nèi)的主要支架蛋白，在調(diào)控神經(jīng)突觸發(fā)育和可塑性中起關鍵作用，并參與學習記憶等功能的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，長期應激可使抑郁癥大鼠海馬CA1、CA3區(qū)中的PSD-95表達水平下降[10]，提示在抑郁癥的發(fā)生、轉歸過程，PSD-95作為神經(jīng)信號傳遞中重要的整合器，通過串集、整合特異受體及下游相關蛋白，影響神經(jīng)突觸可塑性。本研究通過分析舍曲林對抑郁癥大鼠認知功能和海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量的影響及PSD-95 mRNA相對表達量與抑郁癥大鼠認知功能之間的關系，來探討抑郁癥可能的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物成年健康雄性Sprague-Dawle大鼠64只，體質(zhì)量180～230 g，由河南省鄭州大學實驗動物中心提供，實驗動物機構許可證號：SCXK(豫)2010-0002；飼養(yǎng)于河南省生物精神病學重點實驗室屏障動物房。實驗過程中，在不影響實驗要求和實驗結果的基礎上充分遵守替代、減少、優(yōu)化的原則。

1.2 試劑與儀器反轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；曠場箱購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，Y迷宮(MG-2)購自安徽淮北正華生物儀器設備有限公司，Smart Version 2.5.16軌跡圖像分析軟件由美國Smart Software股份有限公司提供。Eppendorf 5331梯度聚合酶鏈反應儀購自德國艾本德股份公司，BTS-20.M型紫外凝膠成像系統(tǒng)購自英國UVItec公司。

1.3 實驗動物分組及干預措施大鼠先適應性飼養(yǎng)1周，自由攝食、飲水，光照周期為12 h，室溫(22±2)℃，相對濕度45%～60%。隨機選擇16只大鼠作為對照組，每籠4只，正常飼養(yǎng)。其余48只大鼠參照文獻[11]采用慢性不可預見應激(chronic unpredictable stress，CUS)方法制備抑郁癥模型(模型組)，具體造模方法為：大鼠均單籠孤養(yǎng)，使用10種刺激方法，每日隨機給予2種，相同刺激不連續(xù)出現(xiàn)，使大鼠無法預知操作，連續(xù)刺激28 d。然后根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化、曠場試驗、蔗糖水消耗實驗、Y迷宮實驗和巴恩斯迷宮實驗結果(大鼠體質(zhì)量增長減緩、快感缺乏、認知功能損傷)證實大鼠均造模成功。將造模成功大鼠隨機分為抑郁組、抑郁+生理鹽水組和抑郁+舍曲林組，每組16只。抑郁+舍曲林組大鼠每日灌胃舍曲林5.8 mg·kg-1，抑郁+生理鹽水組大鼠每日灌胃生理鹽水5.8 mg·kg-1，以上2組大鼠均干預4周；抑郁組大鼠不給予任何干預措施。然后3組大鼠繼續(xù)給予CUS，以避免抑郁行為退化。

1.4 大鼠行為學評估

1.4.1 曠場實驗造模后，對照組和模型組大鼠進行曠場實驗。將大鼠放入黑色方形敞箱(長100 cm，寬100 cm，高40 cm)中央，記錄大鼠在中央?yún)^(qū)停留時間。從放入敞箱中央開始計時，測試時間5 min。每2次測試間期將敞箱清理干凈，不留異物和異味。全程使用Smart Version軟件記錄大鼠水平運動距離、豎立運動次數(shù)(兩前肢同時離地豎起記為1次)。

1.4.2 蔗糖水消耗試驗造模后，對照組和模型組大鼠進行蔗糖水消耗試驗。每次測試前禁食禁水24 h 并測大鼠體質(zhì)量，然后給予大鼠10 g·L-1蔗糖水，觀察大鼠1 h的飲水量，計算每100 g體質(zhì)量大鼠飲用蔗糖水的量，蔗糖水攝入量=1 h飲用量(mL)/[動物體質(zhì)量(g)×100]。

1.4.3 Y迷宮實驗檢測大鼠的認知功能造模后及舍曲林干預4周后，參照王躍春等[12]的方法對各組大鼠進行Y迷宮實驗。每輪Y迷宮實驗分為第1天學習階段和第2天測試階段。實驗前允許大鼠在迷宮內(nèi)自由活動，適應環(huán)境5 min后，開始進行隨機的變換安全區(qū)，以訓練大鼠辨別燈光刺激及安全方位的能力。實驗過程中調(diào)節(jié)刺激電壓為50～70 V，大鼠在起始區(qū)內(nèi)給予電刺激使其逃至安全區(qū)，燈光持續(xù)15 s，然后熄燈休息45 s，再開始下一輪操作，將大鼠受電刺激后10 s內(nèi)一次性從起始區(qū)逃至安全區(qū)的反應稱為“正確反應”，否則稱為“錯誤反應”。第1天學習階段中，以達到學會為目的進行學習訓練，學會的標準：在10次電刺激中連續(xù)9次做出正確反應。第2天測試，檢測大鼠的記憶能力，在連續(xù)20次的電刺激測試中記錄正確反應次數(shù)、錯誤反應次數(shù)和每次從信號燈亮到進入安全區(qū)的逃避潛伏期，以1個實驗日累計的總潛伏期反應時間來表示大鼠信息提取速度以及綜合記憶能力。

1.4.4 巴恩斯迷宮實驗檢測大鼠認知功能造模后及舍曲林干預4周后，各組大鼠進行巴恩斯迷宮實驗。巴恩斯迷宮實驗裝置位于地板上方140 cm處，20個孔均勻地位于表面周邊，直徑為5 cm。目標洞是這些孔中的1個，連接到暗室允許小鼠逃離強光的刺激。在正式實驗的前1 d，將動物放入目標洞中4 min 進行適應。在第1天，將大鼠放置在迷宮中心的黑色立方體中5 s，大鼠在移除立方體時探索迷宮以找到目標洞，一旦大鼠進入目標洞，就會在那里停留30 s，如果在3 min內(nèi)找不到目標洞的話，它將被引導至目標洞并允許停留在目標箱中1 min。每只動物在1 d內(nèi)進行2次試驗，每次間隔4 h，記錄每只大鼠到達目標盒的潛伏時間。測試共進行4 d，每只大鼠測試前使用體積分數(shù)75%乙醇清潔裝置以避免嗅覺干擾，應用Spain Panlab Smart 3.0軟件對進入目標洞中的時間和錯誤次數(shù)進行視頻記錄和分析。

1.5 RT-PCR法檢測大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量各組大鼠認知功能測試完成后，腹腔注射100 g·L-1水合氯醛(3 mL·kg-1)對大鼠進行全身麻醉。對照組、抑郁組、抑郁+生理鹽水組和抑郁+舍曲林組隨機取8只大鼠，斷頭處死，冰上快速剝離出海馬組織，-80 ℃儲存。TRIzol法提取各組大鼠海馬組織中總RNA，并反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，配制 20 μL反應體系，于 RT-PCR儀上進行擴增。反應條件：95 ℃ 預變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30 s，70 ℃延伸10 s，共30個循 環(huán)。以PSD-95為模板設計引物，上游引物序列為5′-GACAGTGAGACCGACGACATT-3′，下游引物序列為5′- CCCATAGAGGTGGCTGTTGTA-3′，擴增產(chǎn)物396 bp。 以內(nèi)參β-actin為模板設計引物，上游引物序列為5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物序列為5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴增產(chǎn)物150 bp。 使用 12 g·L-1瓊脂糖凝膠進行電泳，并使用Gene Tools From SynGene 軟件對4組大鼠RT-PCR產(chǎn)物的電泳條帶進行灰度值分析，以目的基因與內(nèi)參基因的灰度值比值表示PSD-95 mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 舍曲林干預前對照組與模型組大鼠體質(zhì)量、蔗糖水攝入量和運動總距離比較結果見表1。模型組大鼠體質(zhì)量、蔗糖水攝入量、運動總距離均顯著少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 舍曲林干預前對照組與模型組大鼠體質(zhì)量、蔗糖水攝入量和運動總距離比較

2.2 舍曲林干預前對照組與模型組大鼠認知功能比較結果見表2和表3。在Y迷宮實驗中，模型組大鼠正確反應次數(shù)少于對照組，錯誤反應次數(shù)多于對照組，總潛伏期反應時間長于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 舍曲林干預前對照組與模型組大鼠Y迷宮實驗結果比較

表3 舍曲林干預前對照組與模型組大鼠進入目標洞時間比較

在巴恩斯迷宮實驗中，模型組大鼠第2天、第4天進入目標洞時間長于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2組大鼠第1天、第3天進入目標洞時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 舍曲林干預后4組大鼠認知功能比較結果見表4和表5。抑郁組、抑郁+生理鹽水組大鼠正確反應次數(shù)少于對照組，錯誤反應次數(shù)和總潛伏期反應時間長于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。抑郁+舍曲林組與對照組大鼠正確反應次數(shù)、錯誤反應次數(shù)和總潛伏期反應時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。抑郁+舍曲林組大鼠正確反應次數(shù)多于抑郁組和抑郁+生理鹽水組，錯誤反應次數(shù)少于抑郁組和抑郁+生理鹽水組，總潛伏反應時間短于抑郁組和抑郁+生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。抑郁組與抑郁+生理鹽水組大鼠正確反應次數(shù)、錯誤反應次數(shù)和總潛伏期反應時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表4 舍曲林干預后4組大鼠Y迷宮實驗結果比較

表5 舍曲林干預后4組大鼠進入目標洞時間比較

抑郁組、抑郁+生理鹽水組大鼠第1、2、3、4天進入目標洞時間均長于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。抑郁+舍曲林組與對照組大鼠第1、2、3、4天進入目標洞時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。抑郁+舍曲林組大鼠第1、2、3天進入目標洞時間少于抑郁組和抑郁+生理鹽水組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；抑郁+舍曲林組大鼠第4天進入目標洞時間與抑郁組和抑郁組+生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。抑郁組與抑郁+生理鹽水組大鼠第1、2、3、4天進入目標洞時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 4組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量比較結果見圖1。對照組、抑郁組、抑郁+生理鹽水組、抑郁+舍曲林組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量分別為0.739±0.024、0.459±0.022、0.454±0.027、0.625±0.019。抑郁組、抑郁+鹽水組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。抑郁+舍曲林組與對照組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。抑郁+舍曲林組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量顯著高于抑郁組和抑郁+生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。抑郁組與抑郁+生理鹽水組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

M:marker；A：對照組；B：抑郁組；C：抑郁+生理鹽水組；D：抑郁+舍曲林組。

2.5 大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量與認知功能相關性大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量與大鼠在Y迷宮實驗中正確反應次數(shù)呈顯著正相關(r=0.486,P<0.05),與錯誤反應次數(shù)呈顯著負相關(r=-0.581,P<0.05)。

3 討論

抑郁癥是導致全球疾病負擔增加的五大疾病之一。全球約3.5億人患有嚴重抑郁癥，根據(jù)抑郁癥臨床表現(xiàn)可分為不同類型，但任何類型的抑郁癥均會導致患者認知功能損傷，其病理生理學機制尚不清楚，需進一步研究[13]。盡管抗抑郁藥的快速發(fā)展改善了部分抑郁癥患者的癥狀，但由于該疾病病因不明確，仍有較多患者治療效果欠佳，給個人和家庭帶來很大痛苦。因此，研究抑郁癥患者的發(fā)病機制仍是目前研究熱點。

本研究參照ANTONIUK等[11]方法通過給予CUS制備抑郁癥模型，結果顯示，模型組大鼠體質(zhì)量下降(反映其食欲下降)、蔗糖水攝入量減少(反映其對愉悅事件的興趣喪失)、曠場試驗中運動總距離縮短(反映其類焦慮樣狀態(tài)控制能力以及探究活躍能力降低)，說明成功制備抑郁癥模型。

關于抑郁癥的發(fā)病機制，“神經(jīng)可塑性學說”得到學者們的公認。因此，選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑在臨床抑郁癥治療中得到廣泛使用，這類藥物主要通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取,從而提高5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)的含量。國外有學者發(fā)現(xiàn)，單胺類5-羥色胺再攝取抑制劑能引起神經(jīng)可塑性的改變[14],其中舍曲林是該類藥物之一。本研究結果顯示，抑郁組大鼠在Y迷宮實驗中的錯誤反應次數(shù)顯著多于對照組，在巴恩斯迷宮實驗中其正確反應次數(shù)顯著少于對照組，說明抑郁癥大鼠發(fā)生認知功能障礙，與LI等[15]研究結果一致。為進一步證實神經(jīng)可塑性變化，本研究給予舍曲林干預后發(fā)現(xiàn)，抑郁+舍曲林組大鼠的進入目標洞時間少于抑郁組和抑郁組+生理鹽水組，說明抑郁癥大鼠的學習記憶能力下降，而抗抑郁藥物干預能改善抑郁癥狀并提高學習記憶能力；提示在抑郁癥發(fā)病時神經(jīng)生物學的改變參與了學習記憶等的調(diào)節(jié)，而神經(jīng)可塑性在其中起重要作用，是情緒、學習記憶功能的基礎[16]。

有學者通過動物模型、抑郁癥患者大腦形態(tài)學和尸檢結果發(fā)現(xiàn)了抑郁癥在發(fā)生和轉歸過程中大腦結構形態(tài)學的改變特點，提出了神經(jīng)可塑性學說[17]。PSD-95基因沉默可影響缺血后大鼠海馬錐狀細胞的死亡,說明PSD-95對海馬神經(jīng)元錐體細胞及可塑性等產(chǎn)生了一定的影響[18]。BESSIERES 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PSD-95在調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性中具有重要作用。本研究采用RT-PCR技術檢測抑郁癥大鼠經(jīng)舍曲林治療后海馬組織中PSD-95 mRNA的表達情況，結果顯示，抑郁組和抑郁+生理鹽水組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量顯著低于對照組，抑郁+舍曲林組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達量顯著高于抑郁+生理鹽水組。說明長期CUS可通過影響PSD-95的轉錄水平來影響神經(jīng)可塑性，從而導致抑郁癥的形成，與MAYA VETENCOURT等[20]的研究結論一致。本研究進一步對大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA表達水平與大鼠在Y迷宮實驗中正確反應次數(shù)及錯誤反應次數(shù)的相關性進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)，PSD-95 mRNA相對表達量與錯誤反應次數(shù)呈顯著負相關，與正確反應次數(shù)呈顯著正相關，說明PSD-95 mRNA水平與大鼠認知功能有關。舍曲林可能是通過增加大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA的表達，觸發(fā)一系列生物學改變，進而發(fā)揮治療作用。但以上研究結論仍需蛋白水平實驗結果進行佐證。

本研究從分子生物學水平上闡明抑郁癥大鼠海馬組織中神經(jīng)突觸可塑性導致認知功能障礙的可能神經(jīng)生理機制，為進一步深入解釋慢性應激引發(fā)身心疾病的作用機制提供了實驗證據(jù)，為抗抑郁癥藥物的研發(fā)提供新的藥物作用靶點。