高效液相色譜法同時測定飲料中7種防腐劑和2種甜味劑

楊飛帆

(上海市崇明食品藥品檢驗所（崇明食品安全檢測中心），上海 202150)

食品添加劑是現(xiàn)代食品工業(yè)發(fā)展的產(chǎn)物，食品添加劑的使用對改善食品品質(zhì)、便于食品加工及延長食品貨架期具有重要作用。其中化學防腐劑由于能高效抑制食品中微生物活動、防止食品腐敗變質(zhì)且價廉、方便而應(yīng)用廣泛[1]。應(yīng)用范圍最廣的當屬酸類防腐劑中的山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸及鹽類防腐劑中的山梨酸鉀、苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉和酯類防腐劑中的羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯[2]。甜味劑也是食品添加劑中的重要分支，合理應(yīng)用甜味劑能夠協(xié)調(diào)平衡食品風味、掩蔽異味、增強口感，在飲料中應(yīng)用較為廣泛的有糖精鈉和安賽蜜。

這9種食品添加劑經(jīng)常同時應(yīng)用于各類飲料制品，而對以上7種防腐劑和2中甜味劑的檢測方法中，現(xiàn)行有效的就包括《飲料中乙酰磺胺酸鉀的測定》（GB/T 5009.140—2003）[3]、《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）[4]、《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）[5]及行業(yè)標準《出口乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸酯類防腐劑的測定 高效液相色譜法》（SN/T 4262—2015）[6]這4種方法，其中樣品凈化、目標物提取、儀器測定條件和流動相設(shè)置等各有差異，同時測定以上項目需要人員多、時間長，工作效率低。因此近年來，檢測工作者對幾種食品添加劑的同時測定進行了大量研究。目前，測定防腐劑和甜味劑的方法主要有液相色譜法[7]、液相質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、氣相色譜法[9]和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10]等，但仍然存在同時測定項目少、儀器適用性窄、成本較高等問題。為有效整合資源、提高檢測速率，本文采用高效液相色譜探索一個可同時測定飲料中9種食品添加劑的檢測方法，以期實現(xiàn)對飲料類產(chǎn)品中食品添加劑的高通量測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A：果汁類、B：碳酸飲料、C：含乳飲料共3種（均為市售）。

山梨酸、苯甲酸、糖精鈉混合標準物質(zhì)：濃度1 000 μg/mL（北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術(shù)有限責任公司）；脫氫乙酸標準品：純度99.5%（ChemService）；安賽蜜標準品：純度99.40%；對羥基苯甲酸甲酯：純度99.73%；對羥基苯甲酸乙酯：純度99.02%；對羥基苯甲酸丙酯：純度98.70%；對羥基苯甲酸丁酯：純度 99.90%（Dr.E）。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；離心機，賽默飛世爾科技有限公司；渦旋振蕩器，賽默飛世爾科技有限公司；超聲機，上海科導超聲儀器有限公司；配有二級管陣列檢測器的高效液相色譜儀，島津儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑配制

亞鐵氰化鉀（92 g/L）：稱取10.6 g亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6·3H2O]，加入適量水溶解，用水定容至100 mL。

乙 酸 鋅 溶 液（183 g/L）： 稱 取 22 g乙 酸鋅 [Zn(CH3COO)2·2H2O]，加入 3 mL 冰乙酸，用水定容至100 mL。

乙酸銨溶液（20 mmol/L）：稱取1.54 g乙酸銨（CH3COONH4），加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

1.3.2 標準曲線配制

分別稱取安賽蜜、脫氫乙酸標準品10 mg，用水定容至10 mL，配制成濃度為1 000 μg/mL的標準儲備液；分別稱取4種對羥基苯甲酸酯類10 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成濃度為1 000 μg/mL的標準儲備液。準確移取安賽蜜、脫氫乙酸、山梨酸苯甲酸糖精鈉混合標準物質(zhì)、4種對羥基苯甲酸酯類各1 mL，用水定容至10 mL，配得9種食品添加劑濃度均為100 μg/mL的混合標準中間液。分別移取5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL 和 500 μL，用水定容至1 mL，配制得標準系列工作溶液，臨用現(xiàn)配。

1.3.3 樣品提取及凈化

（1）果汁飲料。準確稱取樣品5 g（精確至0.001 g）于50 mL具塞塑料離心管中，加入30 mL甲醇水溶液（70%），渦旋振蕩10 min，4 000 r/min離心5 min后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度?；靹蚝筮^0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

（2）碳酸飲料。將樣品超聲20 min除去氣泡，消除定容誤差和氣泡對高效液相色譜的影響。準確稱取樣品5 g（精確至0.001 g）于50 mL具塞塑料離心管中，加入30 mL甲醇水溶液（70%），渦旋振蕩10 min，4 000 r/min離心5 min后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度?；靹蚝筮^0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

（3）含乳飲料。準確稱取樣品5 （g精確至0.001 g）于50 mL具塞塑料離心管中，加入30 mL甲醇水溶液（70%），渦旋振蕩10 min，加入蛋白沉淀劑亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）1 mL和乙酸鋅溶液（183 g/L）1 mL混勻，將樣品在4 000 r/min離心10 min，沉淀蛋白和可溶性糖類等雜質(zhì)。取上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶。于固體殘渣中加入水10 mL，渦旋振蕩5 min，于4 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至同一50 mL容量瓶，并用水定容至刻度，混勻后過0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

1.3.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Shimadzu VP-ODS柱（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）；二極管陣列檢測器檢測波長245 nm；進樣量 20 μL；流速 1.5 mL/min。

流動相：A相為20 mmol/L乙酸銨溶液；B相甲醇（色譜純）。通過調(diào)整兩項洗脫條件，獲取良好的峰形和基線分離。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件表

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

20 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇/乙腈流動相體系常見于多種食品添加劑的分離。經(jīng)過本試驗比較，甲醇-乙酸銨溶液體系進行分離時，各組分峰型對稱分布，且分離度高，實現(xiàn)了各目標峰之間和雜質(zhì)的有效分離。同時出于檢測成本及試驗人員人身安全性及環(huán)境保護廢棄物處理等原因，選擇20 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇體系。

2.2 目標化合物檢測波長

利用二極管陣列檢測器（Photo-Diode Array，PDA）對濃度為1 μg/mL的9種目標化合物在波長190～400 nm范圍內(nèi)掃描，各目標化合物最大吸收波長如表2所示。通過分析比對，在245 nm數(shù)據(jù)采集時間段內(nèi)基線漂移程度較低，噪音小，且9種目標化合物響應(yīng)較高，色譜圖見1。因此選取245 nm作為數(shù)據(jù)采集通道。適用于配備二級管陣列檢測器（Diode Array Detector/Photo-Diode Array，DAD/PDA）及可變波長紫外檢測器（Variable Wavelength Ultraviolet Detector，VWD）的高效液相色譜儀對9種化合物同時分析，提高方法適用度。

表2 9種目標化合物最大吸收波長表

2.3 方法精密度、線性關(guān)系、檢出限

取濃度為1.0 μg/mL的混合標準溶液，重復進樣6次。通過計算各目標峰峰面積RSD評定方法精密度，各化合物精密度在0.35～0.70%，結(jié)果表明優(yōu)化后的方法穩(wěn)定，可有效實現(xiàn)分離。用優(yōu)化后的色譜條件對濃度為 0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL 和 50.0 μg/mL 的標準系列工作溶液進行數(shù)據(jù)采集，以各目標峰響應(yīng)與濃度繪制標準曲線，得到各自標準曲線方程。9種目標化合物在0.5～50 μg/mL線性良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.999 9。根據(jù)儀器噪音3倍確定飲料中9種目標化合物的檢出限在0.3～2.0 mg/kg，詳見表3。

表3 方法線性方程及檢出限表

圖1 7種防腐劑2種甜味劑標準色譜圖

2.4 方法回收率與精密度

2.4.1 果汁飲料中7種防腐劑及2種甜味劑加標回收

取20份果汁樣品，分別添加低水平（5 mg/kg）、中水平（10 mg/kg）、高水平（100 mg/kg）混合標準溶液各6份，依照優(yōu)化后的方法處理后進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明果汁中9中目標化合物的回收率在85.3%～97.8%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）在2.5%～4.2%。回收率和相對標準偏差均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[11]。優(yōu)化后的方法能夠準確定量果汁樣品中9中添加劑的含量，詳見表4。

表4 果汁飲料加標實驗回收率和相對標準偏差表（n=6）

2.4.2 碳酸飲料中7種防腐劑及2種甜味劑加標回收

取20份碳酸飲料樣品，分別添加低水平（5 mg/kg）、中水平（10 mg/kg）、高水平（100 mg/kg）混合標準溶液各6份，依照優(yōu)化后的方法處理后進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明果汁中9中目標化合物的回收率在88.6%～98.5%，RSD為2.7%～4.2%。回收率和相對標準偏差均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008），優(yōu)化后的方法能夠準確定量碳酸飲料樣品中9中添加劑的含量，詳見表5。

表5 碳酸飲料加標實驗回收率和相對標準偏差表（n=6）

2.4.3 含乳飲料中7種防腐劑及2種甜味劑加標回收

取20份含乳飲料樣品，分別添加低水平（5 mg/kg）、中水平（10 mg/kg）、高水平（100 mg/kg）混合標準溶液各6份，依照優(yōu)化后的方法處理后進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明果汁中9種目標化合物的回收率在85.6%～98.0%，RSD為2.2%～4.5%?；厥章屎拖鄬藴势罹稀秾嶒炇屹|(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》（GB/T 27404—2008），優(yōu)化后的方法能夠準確定量含乳飲料樣品中9種食品添加劑的含量，詳見表6。

表6 含乳飲料加標實驗回收率和相對標準偏差表（n=6）

3 結(jié)論

本試驗探討了高效液相色譜法同時測定飲料中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯共9種添加劑的方法。通過對前處理方式和液相色譜分析條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了7種防腐劑和2種甜味劑同時測定，提高了檢測效率，做到資源最大化利用。通過二極管陣列檢測器多通道采集的數(shù)據(jù)進行提取分析后，選擇245 nm作為唯一檢測波長，使該方法同時適用于只配備紫外檢測器的高效液相色譜儀，提高了方法的適用性。經(jīng)過方法學驗證，說明優(yōu)化后的方法能夠準確實現(xiàn)飲料樣品中9中食品添加劑的定量分析，方法靈敏度好、準確度高。根據(jù)《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）以上9種食品添加劑在果汁類飲料、碳酸飲料、含乳飲料的最大用量為25～1 000 mg/kg的規(guī)定，且以上添加劑在飲料產(chǎn)品中的廣泛使用，因此該試驗方法在飲料產(chǎn)品檢驗檢測中推廣實用性更強。