三七不同部位提取物體外抗氧化功效研究*

查雨鋒，詹易，李婷，顏宏，黃加文，吳德松

1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111； 2.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111

衰老是一種復(fù)雜的自然現(xiàn)象，是由遺傳基因和環(huán)境等多種因素共同影響所導(dǎo)致的必然結(jié)果[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為，衰老是由于先天稟賦不足，后天調(diào)攝失宜，造成人體精華物質(zhì)耗散，五臟功能體系虛損，產(chǎn)生形體衰憊、生命機(jī)能減退等現(xiàn)象[2]。在現(xiàn)代眾多醫(yī)學(xué)理論中，活性氧(reactive oxygen species，ROS)學(xué)說是最具有說服力的學(xué)說之一[3]。ROS是機(jī)體在生化反應(yīng)中產(chǎn)生的性質(zhì)活潑、具有極強(qiáng)氧化功能且可導(dǎo)致機(jī)體衰老的物質(zhì)，體內(nèi)過多的ROS可導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生[4]。皮膚作為人體最大的器官，直接暴露于環(huán)境，更容易引起氧化應(yīng)激造成氧化損傷[5]。氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞氧化損傷在機(jī)體衰老中扮演重要角色，因此，抑制ROS產(chǎn)生，促進(jìn)其清除，并抑制其引起的細(xì)胞氧化損傷，對(duì)預(yù)防衰老具有重要意義。

三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]為五加科人參屬草本植物，又名田七、金不換等，主產(chǎn)于我國云南、廣西等地[6]，是我國的傳統(tǒng)名貴中藥材，歷代本草均有收載。三七性溫，味甘、微苦，歸肝、胃經(jīng)，具有散瘀止血、消腫定痛的作用[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三七在血液循環(huán)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等方面均具有重要作用[8-10]。研究證明，三七總皂苷、多糖、總黃酮、人參二醇、picrionoside B、槲皮素等均具有抗氧化作用[11-16]，提示三七具有良好的抗衰老功效。近年來，三七的抗氧化作用被不斷證實(shí)，這不僅為尋找其新的臨床適應(yīng)證研究提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為三七化妝產(chǎn)品的開發(fā)提供了新的方向。但截至目前，針對(duì)三七抗氧化作用的研究中，大多僅限于單一部位的提取物或成分，而三七不同部位的抗氧化功效是否具有差異性還未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，這給化妝品原料用藥部位的選擇帶來了困難?；诖?，本研究采用體外抗氧化評(píng)價(jià)方法，對(duì)三七根、莖、葉、花四個(gè)部位的抗氧化功效進(jìn)行較為全面的研究，以篩選出抗氧化活性較優(yōu)的部位，為三七化妝品原料的選擇提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)為三七資源的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞人皮膚成纖維細(xì)胞(human foreskin fibroblasts，HFF-1)，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，目錄號(hào)：SCSP-109。

1.2 藥物與試劑維生素E(vitamin E，VE)、MTT(德國Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)：T3251、M2128)；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、PBS緩沖液(美國Gibco公司，貨號(hào)：8115251、10099-141、25200-056、8115183)；總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A001-3、A006-2、A003-4-1)；VC、無水乙醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號(hào)：A303539、B1805051)；二甲基亞砜(methyl sulfoxide，DMSO，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150702)；Ⅲ型膠原蛋白(type Ⅲ collagen，Col Ⅲ) ELISA試劑盒(上海樊克生物科技有限公司，貨號(hào)：FK-0437)；ColⅠ ELISA試劑盒(英國Abcam公司，貨號(hào)：ab210966)。

1.3 儀器Practum224 SQP型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；AC2-6S1型二級(jí)生物安全柜、CCL-170A-8型CO2恒溫培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)；3H12RI型高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司，離心半徑：7.5 cm)；DMIL-LED型倒置相差顯微鏡(德國萊卡公司)；GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 藥物制備取三七干燥根、莖、花、葉進(jìn)行粉碎，過24目篩制得藥材粉末，分別用70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，過濾后合并提取液?；厥杖軇瑵饪s提取液，加入6倍體積的純水，充分?jǐn)嚢韬笾糜?～8 ℃冰箱過夜，過濾，濾液濃縮成浸膏，冷凍干燥得三七根、莖、花、葉粗提物。分別稱取三七不同部位提取物各20.0 mg，乙醇充分溶解后，配制成濃度為12.5 mg·L-1、25.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1、100.0 mg·L-1、200.0 mg·L-1、400.0 mg·L-1、800.0 mg·L-1的三七不同部分提取物溶液，4 ℃保存待用。

2.2 羥自由基清除活性檢測按照參考文獻(xiàn)[17]的方法，取10 mmol·L-1FeSO4、2 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液、5 mmol·L-1H2O2及不同濃度的三七不同部位提取物溶液各1 mL，混勻，于37 ℃水浴中反應(yīng)1 h。實(shí)驗(yàn)選擇VC作為陽性對(duì)照，其余操作均相同。在波長510 nm處測量吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算自由基清除率，采用OriginPro 8.5軟件計(jì)算半抑制濃度(inhibitory concentration 50，IC50)。

2.3 超氧陰離子自由基清除活性檢測按照參考文獻(xiàn)[17]的方法，取0.1 mL不同濃度的三七不同部位提取物溶液分別與5 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2，0.05 mol·L-1)混合，25 ℃水浴20 min，加入0.2 mL鄰苯三酚(3 mmol·L-1)，25 ℃水浴 4 min。實(shí)驗(yàn)選擇VC作為陽性對(duì)照，其余操作均相同。于325 nm波長處測定吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算自由基清除率，采用OriginPro 8.5軟件計(jì)算IC50。

2.4 MTT檢測三七不同部位提取物對(duì)正常細(xì)胞活力的影響取對(duì)數(shù)生長期HFF-1細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105mL-1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。用培養(yǎng)液將VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物分別配制成濃度為12.5 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1的工作液，0.22 μm無菌濾膜過濾備用。棄除細(xì)胞上清液，加入100 μL配制好的VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物工作液，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組加入100 μL DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(2.5 g·L-1)，37 ℃孵育 4 h 后棄上清液，每孔加入200 μL DMSO，避光放置 30 min 后，在570 nm波長處測定各孔吸光度(optical density，OD)值[18-19]，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力，并根據(jù)細(xì)胞活力確定以下實(shí)驗(yàn)的給藥劑量。

細(xì)胞活力(%)=樣品組OD值/空白組OD值×100%

2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察選擇對(duì)數(shù)生長期HFF-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105mL-1，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 mL，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄除培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照(VE)組、三七根提取物組、三七莖提取物組、三七葉提取物組、三七花提取物組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組每孔加入2 mL DMEM培養(yǎng)液，其他組每孔加入含900 μmol·L-1H2O2的培養(yǎng)液2 mL，培養(yǎng)6 h建立氧化損傷模型。棄除上清液，空白對(duì)照組和模型組每孔加入2 mL DMEM培養(yǎng)液，各給藥組分別加入含50 mg·L-1VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物的培養(yǎng)液2 mL，培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.6 MTT法測定三七不同部位提取物對(duì)氧化損傷模型細(xì)胞活力的影響將對(duì)數(shù)生長期HFF-1細(xì)胞，按1.0×105mL-1的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分組及模型建立同“2.5項(xiàng)”，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。模型建立完成后，棄除上清液，空白對(duì)照組和模型組加入DMEM培養(yǎng)液100 μL，各給藥組分別加入含50 mg·L-1VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物的培養(yǎng)液100 μL，按“2.4項(xiàng)”所述方法測定細(xì)胞活力。

2.7 氧化損傷模型HFF-1細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD及GSH的測定實(shí)驗(yàn)方法與“2.5項(xiàng)”相同，藥物干預(yù)HFF-1細(xì)胞24 h后，棄除上清液，用PBS清洗細(xì)胞兩次，每孔加入400 μL純水，-80 ℃反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液備用。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，采用MDA、SOD和GSH試劑盒檢測上清液中MDA、GSH含量及SOD活力。

2.8 氧化損傷模型HFF-1細(xì)胞內(nèi)Col Ⅰ、Col Ⅲ的測定細(xì)胞處理方法與“2.7項(xiàng)”相同，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，采用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞中Col Ⅰ及Col Ⅲ的水平。

3 結(jié)果

3.1 三七不同部位提取物對(duì)自由基清除活性的影響三七根、莖、葉、花提取物對(duì)超氧陰離子及羥自由基均具有清除作用，其中，三七根提取物對(duì)超氧陰離子及羥自由基清除的IC50最小。提示三七根提取物的自由基清除活性優(yōu)于其他部位提取物。見表1。

表1 三七各部位提取物對(duì)自由基清除活性的影響

3.2 三七不同部位提取物對(duì)正常細(xì)胞活力的影響與空白對(duì)照組比較，VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物分別在 200 mg·L-1、100 mg·L-1、50 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1及以下濃度時(shí)對(duì)HFF-1細(xì)胞的活力無明顯抑制作用(P>0.05)，表明VE、三七根提取物、三七莖提取物、三七葉提取物、三七花提取物在此濃度及以下濃度對(duì)HFF-1細(xì)胞均無毒性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度設(shè)定為50 mg·L-1。見圖1。

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3.3 三七不同部位提取物對(duì)氧化損傷模型HFF-1細(xì)胞形態(tài)的影響空白對(duì)照組HFF-1細(xì)胞呈梭形或多角形，細(xì)胞數(shù)量較多且飽滿圓滑；模型組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞皺縮變圓，折光率偏高，呈現(xiàn)出典型的損傷形態(tài)；與模型組比較，三七各部位提取物組細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞形態(tài)得到較好改善，其中三七根提取物對(duì)HFF-1細(xì)胞損傷的改善效果最好。見圖2。

注：A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：VE組；D：三七根提取物組；E：三七莖提取物組；F：三七葉提取物組；G：三七花提取物組

3.4 三七不同部位提取物對(duì)氧化損傷模型細(xì)胞活力的影響與空白對(duì)照組比較，模型組HFF-1細(xì)胞活力明顯降低(P<0.001)，表明氧化損傷模型建立成功；與模型組比較，三七不同部位提取物均能不同程度的升高HFF-1細(xì)胞活力(P<0.01)；與三七根提取物組比較，三七莖提取物組、三七根提取物組、三七葉提取物組HFF-1細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。見圖3。

注：與空白對(duì)照組比較，###P<0.001；與模型組比較，**P<0.01，***P<0.001；與三七根提取物組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.5 三七不同部位提取物對(duì)HFF-1細(xì)胞中MDA、SOD及GSH的影響與空白對(duì)照組比較，模型組HFF-1細(xì)胞中MDA含量明顯升高(P<0.001)，SOD活力和GSH含量明顯降低(P<0.001)，表明氧化損傷模型建立成功。與模型組比較，三七根、莖、葉提取物均能不同程度的升高細(xì)胞內(nèi)SOD活力及GSH含量(P<0.05)，降低細(xì)胞內(nèi)MDA的含量(P<0.05)；三七花提取物顯著升高細(xì)胞內(nèi)GSH含量(P<0.05)，并降低細(xì)胞內(nèi)MDA的含量(P<0.05)，但對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD活力沒有影響(P>0.05)。與三七根提取物組比較，三七莖提取物組、三七葉提取物組及三七花提取物組HFF-1細(xì)胞中SOD活力及GSH含量顯著降低(P<0.05)。見圖4。

注：與空白對(duì)照組比較，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與三七根提取物組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.6 三七不同部位提取物對(duì)HFF-1細(xì)胞內(nèi)Col Ⅰ、Col Ⅲ的影響與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中Col Ⅰ和Col Ⅲ的含量明顯降低(P<0.001)。與模型組比較，三七根、莖、葉、花提取物均能明顯提高細(xì)胞中Col Ⅰ的含量(P<0.05)；三七根提取物能明顯提高細(xì)胞中Col Ⅲ的含量(P<0.01)，而其余組對(duì)細(xì)胞中Col Ⅲ的含量無影響(P>0.01)。與三七根提取物組比較，三七莖提取物組、三七葉提取物組及三七花提取物組HFF-1細(xì)胞內(nèi)Col Ⅰ的含量顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注：與空白對(duì)照組比較，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與三七根提取物組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4 討論

自由基是機(jī)體在生化反應(yīng)中產(chǎn)生的性質(zhì)活潑并具有極強(qiáng)氧化功能且可導(dǎo)致機(jī)體快速衰老的物質(zhì)，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，其外層軌道上含有一個(gè)或一個(gè)以上未配對(duì)電子的分子、原子、離子或基團(tuán)[20]。人體內(nèi)的自由基主要以氧自由基為主，大約占自由基總數(shù)的95%，氧自由基主要指超氧陰離子自由基和羥自由基，其可引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使糖類、蛋白質(zhì)、核酸及脂類等發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞衰老和死亡，引起廣泛的關(guān)注[21-22]。抑制或清除機(jī)體內(nèi)過多的自由基，可避免或減少氧化應(yīng)激所引起的氧化損傷。本研究聚焦體內(nèi)數(shù)量最多、危害最大的兩類氧自由基，采用快速、靈敏和實(shí)用的體外超氧陰離子及羥自由基清除實(shí)驗(yàn)研究三七不同部位的抗氧化活性。結(jié)果顯示，三七根、莖、葉、花提取物均具有超氧陰離子及羥自由基清除活性，具有較好的抗氧化作用，其中，三七根提取物對(duì)超氧陰離子及羥自由基清除的IC50最小，其自由基清除活性優(yōu)于其他部位提取物。

皮膚成纖維細(xì)胞是組成皮膚真皮的主要結(jié)構(gòu)成分，是維持皮膚結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要組成部分，也是皮膚衰老和細(xì)胞受損后的主要修復(fù)細(xì)胞[23]。HFF-1 細(xì)胞來源于人包皮皮膚成纖維細(xì)胞，被廣泛應(yīng)用于皮膚抗衰老研究。H2O2作為氧化劑，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，致使細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)耗竭，氧化物質(zhì)增多，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡，被廣泛用于體外細(xì)胞過氧化損傷模型的造模[24]。MDA可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞氧化損傷的程度，而SOD和GSH是體內(nèi)主要抗氧化物質(zhì)，能夠清除體內(nèi)自由基，對(duì)維持機(jī)體細(xì)胞中氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[25]。膠原蛋白作為一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是人體皮膚的主要組成成分之一。人皮膚中的膠原蛋白主要包括ColⅠ和ColⅢ，為皮膚提供強(qiáng)度和支撐，膠原蛋白肽的分解和流失是皮膚衰老最典型的象征[26]，因此，細(xì)胞中膠原蛋白的含量可間接反映細(xì)胞衰老的程度。本研究結(jié)果顯示，三七不同部位提取物干預(yù)氧化損傷模型HFF-1細(xì)胞后，可不同程度的提高細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)水平，降低氧化物質(zhì)的產(chǎn)生，提高細(xì)胞活力及細(xì)胞中膠原蛋白的合成，且三七根提取物抗氧化功效最為顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)，三七不同部位提取物的抗氧化作用具有明顯差異。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，三七中具有抗氧化作用的成分主要有總皂苷、多糖、總黃酮、人參二醇、槲皮素等[11-16]，而這些成分在三七根、葉、花部位基本都有發(fā)現(xiàn)[27-30]，推測，三七不同部位的抗氧化功效可能是由其抗氧化成分的含量所決定。

綜上所述，三七根、莖、葉、花提取物均具有抗氧化功效，且三七根提取物的抗氧化功效最為顯著，是三七化妝品原料的最佳選擇部位。本文為三七化妝品原料的研究及三七資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。