基于microRNA探討中醫(yī)藥在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞衰老中的調(diào)控作用*

張濤，嚴雋陶，葉斌

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437； 2.上海市第三康復(fù)醫(yī)院，上海 200436

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的滑膜關(guān)節(jié)疾病，其主要特征是軟骨退化以及骨過度生長等。隨著人口老齡化及肥胖癥、關(guān)節(jié)外傷患者的增加，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐年升高，給家庭和社會帶來了巨大的負擔[1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界骨關(guān)節(jié)炎的患病人數(shù)已超2.5億[2]。軟骨細胞衰老在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[3]。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展與關(guān)節(jié)組織中衰老軟骨細胞數(shù)量的增加有關(guān)[4]。衰老軟骨細胞可以通過增加衰老相關(guān)β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal)表達、細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制劑p16INK4a積累、分泌衰老相關(guān)的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)并引起DNA損傷反應(yīng)等，破壞軟骨形態(tài)及結(jié)構(gòu)[5]。同時，作為基因表達的調(diào)節(jié)因子，microRNA在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中被異常調(diào)節(jié)，并在軟骨細胞的衰老過程中發(fā)揮調(diào)控作用，影響疾病的進展[6]，這意味著通過調(diào)控特定的microRNA影響軟骨細胞的衰老過程，可能是一種有效的治療方法。因此，全面了解軟骨細胞衰老相關(guān)microRNA及其機制對骨關(guān)節(jié)炎的研究和治療有著重要意義。

現(xiàn)有研究多集中在microRNA調(diào)控軟骨細胞的增殖、凋亡、自噬等方面，對軟骨細胞衰老的調(diào)控研究較少，且缺少相關(guān)文獻綜述。故本文介紹了在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞衰老中研究較多的microRNA及相關(guān)信號通路的作用機制，并對中醫(yī)藥研究現(xiàn)狀進行了綜述。

1 軟骨細胞衰老

1.1 衰老軟骨細胞的產(chǎn)生機制軟骨細胞衰老可能由線粒體功能障礙、機械載荷過大、復(fù)制衰老、氧化應(yīng)激以及DNA損傷等多種因素導(dǎo)致，繼而引起端粒侵蝕、p53、CDK抑制劑p21和p16INK4a表達增加，通過線粒體功能障礙增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成以及衰老相關(guān)的異染色質(zhì)增加[7]。具體言之，軟骨細胞會隨著時間的推移而衰老和衰退。研究顯示，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率與年齡增長呈顯著的正相關(guān)，而由年齡增長導(dǎo)致的軟骨細胞衰老是其主要發(fā)病機制之一[8]。除了增齡，創(chuàng)傷后的軟骨及細胞外基質(zhì)修復(fù)也會使得軟骨細胞的增殖潛力被激活，加速軟骨細胞衰老，刺激軟骨退化[9]。此外，關(guān)節(jié)的異常機械載荷和剪切應(yīng)力以及高熱量、低營養(yǎng)飲食等不良生活方式也可使軟骨細胞衰老的過程過早啟動[10]。

1.2 衰老軟骨細胞相關(guān)生物標志物軟骨細胞衰老時會發(fā)生特定的形態(tài)和分子變化。在形態(tài)上，衰老會使軟骨細胞趨于扁平和增大，并積累應(yīng)激顆粒和液泡。而在分子變化方面，軟骨細胞的衰老會引起SA-β-gal表達的增高。SA-β-gal是一種糖苷水解酶，可作為哺乳動物組織中識別衰老細胞的生物標志物，其在衰老細胞中活性的升高可能是由于細胞中某些溶酶體酶活性的提高[11]。實驗證實，SA-β-gal陽性染色軟骨細胞在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中增加，且與疾病嚴重程度成正比[12]。

除此之外，p53/p21/視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma，Rb)及p16INK4a/Rb通路相關(guān)基因也是軟骨細胞衰老的生物標志物。雖然引起細胞衰老的上游調(diào)控通路和機制不盡相同，但其最終效應(yīng)通路基本圍繞這兩條通路。DNA損傷后，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生的改變會磷酸化p53，激活p53，上調(diào)其下游靶基因p21的轉(zhuǎn)錄，抑制CDK2的活性進而抑制Rb蛋白去磷酸化，引起軟骨細胞G1期周期阻滯，導(dǎo)致細胞衰老[13]。而p16作為一種與年齡高度相關(guān)的生物標志物，其細胞內(nèi)檢測水平已被證實可以作為細胞衰老和確定生物體生物學(xué)年齡的生物標志物[14]。p16誘導(dǎo)細胞衰老的機制與p21相似，通過阻斷CDK4/6，阻止細胞周期抑制蛋白Rb的下游抑制作用，從而誘導(dǎo)細胞衰老。研究表明，軟骨細胞p21或p16的高表達可以引起細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白的減少，同時上調(diào)SASP表達，導(dǎo)致軟骨破壞[15]。

但值得注意的是，除了受細胞衰老的影響，SA-β-gal還受細胞自噬和溶酶體活性等其他變化的調(diào)控，因此不能單獨將其作為反映細胞衰老的生物標志物[16]。p21、p16基因雖然是軟骨細胞衰老的標志物，但有研究證實，p21、p16基因與骨關(guān)節(jié)炎并無直接因果關(guān)系，誘導(dǎo)衰老軟骨細胞分泌的SASP才是直接導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的關(guān)鍵因素[17]。

雖然衰老軟骨細胞是一種進入穩(wěn)定生長停滯狀態(tài)的細胞，但其依然保持代謝活性，其分泌的趨化因子、細胞因子、蛋白酶和生長因子被統(tǒng)稱為SASP。作為骨關(guān)節(jié)炎最主要、最直接的驅(qū)動因素，持續(xù)存在的SASP分泌可以影響鄰近的細胞和組織，在周圍的微環(huán)境中誘導(dǎo)一系列生理反應(yīng)，如炎癥和生長阻滯等[18]，促進關(guān)節(jié)軟骨ECM大分子的降解，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[19]。具體言之，趨化因子與細胞因子如CCL2、CCL4、白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosisfactor，TNF)等表達的上調(diào)可引起巨噬細胞浸潤，ROS產(chǎn)生，DNA損傷及生長停滯，出現(xiàn)炎癥和疼痛[20]；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo protease，MMP)、Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)等蛋白酶的表達會引起細胞外基質(zhì)降解以及軟骨損失[21]；而生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1(insulin-like growth factor-binding protein，IGFBP)等則可促進骨生長，或?qū)е鹿琴樀男纬蒣4]。

2 microRNA在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞衰老中的調(diào)控

microRNA是一種長約22nt的雙鏈RNA分子，通過與靶mRNA內(nèi)的特定序列結(jié)合，進而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達水平，在軟骨細胞發(fā)育和軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起到了關(guān)鍵作用。研究證明，許多microRNA通過影響不同基因以及信號通路，在軟骨細胞的凋亡、自噬和衰老中發(fā)揮作用。軟骨細胞中任何microRNA的缺失均會導(dǎo)致骨骼發(fā)育缺陷，而某些特定microRNA的缺失則會導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細胞衰老，從而提高骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率[22]。因此，明確microRNA影響衰老的分子機制可為骨關(guān)節(jié)炎的診治提供思路。本文總結(jié)了骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞衰老相關(guān)microRNA，并討論了其在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞衰老相關(guān)病理中的機制及意義。

2.1 miR-140目前，研究最多的軟骨microRNA為miR-140。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-140可通過負調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，Akt)通路相關(guān)基因表達，抑制IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中的衰老相關(guān)標志物SA-βGal、p16INK4a、p21、p53的表達[23]，減少SASP分泌，抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞衰老和ECM穩(wěn)態(tài)失衡[24]。此外，調(diào)節(jié)Notch通路可能是miR-140調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞衰老的機制之一。Notch是單程跨膜細胞表面受體，具有動態(tài)調(diào)控SASP的作用，抑制Notch信號傳導(dǎo)可減少細胞衰老的相關(guān)特征[25]。而Notch信號通路中的關(guān)鍵基因如JAG1 、ADAM10和HEY1等，被證實可作為miR-140的靶點，在細胞衰老過程中發(fā)揮重要作用[23]。

2.2 miR-34amiR-34a在由人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞提取的衰老細胞胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)中表達增多，而清除衰老軟骨細胞可使EVs中miR-34a下降[26]。轉(zhuǎn)染miR-34a可以通過PI3K/Akt信號通路，負調(diào)節(jié)DLL1，激發(fā)軟骨細胞的死亡和衰老，增加 SA-β-gal 陽性染色的軟骨細胞，上調(diào)p16基因水平及其下游相關(guān)SASP的表達，誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[27]。同時，miR-34a在控制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的軟骨細胞衰老過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a通過靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silence infor-mation regulator 1，sirtuin 1，SIRT 1)誘導(dǎo)細胞衰老，而在衰老細胞或衰老組織中上調(diào)的miR-335、miR-494和miR-34a可抑制參與抗氧化通路的基因，使衰老細胞更易受氧化應(yīng)激的影響[28]。

2.3 miR-146amiR-146a在早期人骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨中高度表達，可通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路靶向腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)和IRAK1，減少白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)誘導(dǎo)的MMP-13表達，影響炎癥、軟骨細胞自噬、凋亡、衰老以及細胞外基質(zhì)基因的表達[29]。研究表明，miR-146a 還可以通過靶向Notch信號通路，抑制SASP(包括IL-1β、IL-6、TNFα和IL-8)的表達，并通過直接調(diào)節(jié)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞的分解代謝作用來調(diào)節(jié)軟骨細胞炎癥[30]。

2.4 miR-199與miR-193b研究表明，miR-199a-3p與miR-193b的表達隨年齡的增長而上調(diào)，并通過抑制BMP信號通路的關(guān)鍵下游介質(zhì)Smad1的表達，降低軟骨低聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)、Ⅱ型膠原蛋白(collagen-Ⅱ，Col-Ⅱ)I和Sox9等軟骨形成的早期標記基因的表達，延緩軟骨細胞的衰老[31]。另有最新研究同樣發(fā)現(xiàn)，miR-199的表達在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中發(fā)揮了消極作用，這是由于miR-199可以通過調(diào)控IL-1β與MMP3水平，影響相關(guān)金屬蛋白酶和細胞因子的表達水平，加速軟骨細胞的衰老進程[32]。

2.5 miR-495miR-495在人骨關(guān)節(jié)炎軟骨中也有升高。研究表明，miR-495過表達可直接靶向AKT1/mTOR信號通路，增加衰老標志物 SA-β-gal、p16等的表達，刺激ECM降解相關(guān)的酶的產(chǎn)生，誘導(dǎo)軟骨細胞衰老和凋亡。而下調(diào)體內(nèi)miR-495的表達則可抑制ADAMTS-5、MMP-1、MMP-13等SASP的產(chǎn)生，并增加Col Ⅱ和聚集蛋白聚糖的表達[33]。

2.6 miR-204研究顯示，持續(xù)氧化應(yīng)激會導(dǎo)致軟骨細胞內(nèi)DNA損傷逐漸積累，增加miR-204表達水平，導(dǎo)致軟骨細胞衰老。同時，衰老細胞或衰老組織中上調(diào)的miR-204會抑制參與抗氧化通路的基因，使衰老細胞更容易受到氧化應(yīng)激的影響。另有研究證實，miR-204是控制軟骨細胞中硫酸化蛋白聚糖(proteoglycan，PG)合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，抑制miR-204的表達可恢復(fù)PG合成，抑制軟骨細胞中炎癥性SASP的表達，促進骨關(guān)節(jié)炎的恢復(fù)[34]。

2.7 miR-24miR-24是細胞周期抑制劑p16INK4a的負調(diào)節(jié)劑。Philipot等[35]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng) IL-1β 處理的關(guān)節(jié)軟骨細胞中出現(xiàn)了miR-24和miR-24編碼簇的抑制，使p16INK4a及后續(xù)的SASP(包括MMP1、MMP13)表達增加，從而將軟骨細胞推向類似于終末分化軟骨細胞的衰老樣表型。研究提示，恢復(fù)或維持miR-24編碼簇的表達水平可作為骨關(guān)節(jié)炎的一種治療方法。

2.8 miR-101癌基因HRAS的過表達可通過MAPK信號通路減弱IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡、衰老和ECM降解。而新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-101可對HRAS的表達起到抑制作用。但通過使用內(nèi)源性競爭RNA(ceRNA)LINC00623與HRAS競爭miR-101結(jié)合，可以減弱miR-101對HRAS的抑制作用[36]。

3 microRNA與骨關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)防治

3.1 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞衰老的中醫(yī)病機骨關(guān)節(jié)炎在祖國醫(yī)學(xué)中當屬“骨痹”范疇，臨床表現(xiàn)以“關(guān)節(jié)疼痛不用，關(guān)節(jié)拘攣，步履艱難，骨節(jié)沉重，活動不利”為主，其主要病機包括腎氣虧虛與氣滯血瘀，而此內(nèi)外兩因與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于軟骨細胞的衰老機制具有相似的內(nèi)涵。

在中醫(yī)理論中，腎為先天之本，內(nèi)藏一身之精氣，主司機體的生長發(fā)育，并具有“主骨生髓”的生理功能?！夺t(yī)精經(jīng)義》中所載：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所主也；髓者，腎精所生，精足則髓足，髓足者則骨強”，說明腎中充足的精氣是骨關(guān)節(jié)維持正常的生長發(fā)育及再生修復(fù)的重要保障。但隨著年齡的逐漸增長，腎中精氣逐漸耗竭，會出現(xiàn)以腎氣虧虛為主要表現(xiàn)的各種機體功能的衰退[37]，這種功能的衰退對應(yīng)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中衰老的過程。腎氣虛衰，則氣血生成不足，骨關(guān)節(jié)失于濡養(yǎng)，失去正常的再生與自我修復(fù)功能。由此可見，腎氣虧虛后筋骨失于濡養(yǎng)而導(dǎo)致的軟骨再生修復(fù)功能的衰退，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞衰老的復(fù)制性衰老機制相似。

此外，無論風(fēng)寒、痰濕之邪侵襲關(guān)節(jié)，或勞累過度，亦或外傷，最終都將導(dǎo)致關(guān)節(jié)的脈絡(luò)瘀阻、氣血不通。骨關(guān)節(jié)周圍經(jīng)絡(luò)不通，氣血難以濡養(yǎng)筋骨，筋骨不榮則痛[38]；氣血運行不暢還會使關(guān)節(jié)損傷或衰老后的病理產(chǎn)物難以代謝，積于關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)不通則痛，加速軟骨關(guān)節(jié)的衰老。這也在一定程度上解釋了軟骨細胞應(yīng)激性衰老的產(chǎn)生機制。

3.2 中醫(yī)藥防治骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞衰老的microRNA調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨衰老的基本病機為腎氣虧虛及氣滯血瘀，因此中醫(yī)臨床治療骨關(guān)節(jié)炎以補益肝腎、逐瘀通經(jīng)兩種治則為主。補肝腎以固本，延緩機體、關(guān)節(jié)的自然衰老；調(diào)氣血以治標，改善因外邪、外傷、勞累等各種原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)功能衰退?，F(xiàn)有研究表明，中醫(yī)藥在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中能夠在軟骨細胞的衰老機制方面發(fā)揮積極的調(diào)控作用。如鄭允彬等[39]使用具有補益肝腎、活血祛瘀功效的羌歸膝舒丸治療膝骨關(guān)節(jié)炎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藥可升高miR-140以及miR-146a的表達，降低SASP炎性因子IL-6、IL-1β的表達，緩解骨關(guān)節(jié)炎疼痛、僵硬，改善日常生活能力。王歡等[40]發(fā)現(xiàn)桂枝有效成分桂皮醛在調(diào)節(jié)miR-146a干擾的骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎方面同樣具有積極的治療作用。有學(xué)者研究證實，補腎活血中藥在膝骨關(guān)節(jié)炎的防治中具有較好的療效，其機制可能是通過調(diào)節(jié)軟骨細胞內(nèi)miR-140及其下游相關(guān)靶基因的表達，減少衰老相關(guān)標志物的生成，緩解軟骨關(guān)節(jié)的炎癥[41]。吳廣文等[42]使用獨活寄生湯灌胃3個月，觀察膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于模型組，獨活寄生湯灌胃后的大鼠軟骨組織中miR-146a表達上升，miR-155表達下降，下游相關(guān)靶基因 NF-κB p65以及p38MAPK表達顯著下降，使得組織一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶2、MMP3和MMP13檢測值降低，提示獨活寄生湯可通過調(diào)控miR-146a和miR-155的表達水平，影響其下游NF-κB/p38MAPK信號通路，抑制軟骨細胞衰老及炎癥的發(fā)生，發(fā)揮治療作用。

除了中藥治療，針灸對于骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞衰老同樣具有較好的治療作用。陳后煌[43]以電針進行干預(yù)，觀察其對骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)可以明顯改善膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷及炎癥狀態(tài)，調(diào)控miR-34a、miR-146a 及miR-27b的基因表達水平，抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號通路及其下游因子的激活，促進軟骨細胞Col Ⅱ的合成，延緩骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變。

4 討論與展望

引起軟骨細胞衰老的主要因素有線粒體功能障礙、機械載荷過大、復(fù)制衰老、氧化應(yīng)激、DNA損傷等，上述因素會導(dǎo)致端粒損傷，提高p53、p21、p16等基因的表達及ROS的生成，繼而引起SASP分泌的增加，導(dǎo)致軟骨細胞ECM降解的增多，此亦為軟骨細胞衰老發(fā)病的主要機制。目前，基于microRNA的調(diào)控軟骨細胞衰老的相關(guān)研究主要圍繞p53、p21、p16INK4a、SIRT1、Smad1、COLII、Sox9等基因及PI3K/AKT、Notch、NF-κB、AKT1/mTOR等信號通路展開，多通過調(diào)節(jié)軟骨細胞SASP分泌及ECM穩(wěn)態(tài)對軟骨細胞的衰老發(fā)揮作用。目前，研究重點為明確microRNA在軟骨細胞衰老中的不同調(diào)控作用，根據(jù)其具體功能恢復(fù)、維持或抑制、下調(diào)其表達，從軟骨細胞衰老的角度入手為骨關(guān)節(jié)炎的診治提供思路。

中醫(yī)認為，骨關(guān)節(jié)炎的病機包括腎氣虧虛之內(nèi)因、氣滯血瘀之外因兩方面，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的復(fù)制衰老及損傷應(yīng)激機制具有相似內(nèi)涵。雖然目前中醫(yī)藥干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的研究日漸增多，補益腎氣、活血化瘀類中藥及針灸調(diào)控microRNA及軟骨細胞衰老的作用機制也已被證實，但相關(guān)研究仍有待深入、系統(tǒng)地開展，推拿、針灸等中醫(yī)外治法研究也需進一步加強。

在世界范圍內(nèi)，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率仍在逐年上升。軟骨細胞衰老作為骨關(guān)節(jié)炎的重要發(fā)病機制，已經(jīng)成為當前臨床及科研的研究熱點。microRNA作為一種新的基因表達調(diào)控分子，在調(diào)控軟骨細胞衰老方面發(fā)揮著重要作用，深入了解microRNA的調(diào)控機制對于骨關(guān)節(jié)炎的防治至關(guān)重要，但目前對其分子機制尚未完全闡明，microRNA和軟骨細胞衰老之間的具體關(guān)系亦有待明確，且中醫(yī)藥干預(yù)的研究方法、研究手段存在局限性。

今后，中醫(yī)藥調(diào)控microRNA相關(guān)研究可圍繞骨關(guān)節(jié)炎的內(nèi)外病機展開，從分子生物學(xué)角度研究中醫(yī)補益腎氣、行氣活血的現(xiàn)代科學(xué)機制，闡釋中醫(yī)藥防治骨關(guān)節(jié)炎的潛在機制，為臨床治療提供新的思路。