大蒜對常見益生菌的體外抑菌活性研究

黃莉來

（平陽縣質(zhì)量檢驗檢測研究院，浙江 溫州 325410）

大蒜為百合科蔥屬植物的地下鱗莖，不僅可作為調(diào)味料，還可入藥，是著名的食藥兩用植物。大蒜對人類多種致病菌有抑殺功效，對植物病原菌也有抑制作用。大蒜的抑菌有效成分是大蒜素，大蒜素的化學(xué)成分是易揮發(fā)的硫醚化合物，包括二烯丙基一硫醚、二烯丙基四硫醚、二烯丙基三硫醚和二烯丙基二硫醚[1]。目前有關(guān)大蒜及其提取物對多種病原菌的抑菌試驗有較多報道，但對人體益生菌的作用報道較少見，以益生菌為主要活性成分的食品及藥品能否與大蒜產(chǎn)品配伍的報道也較少見[2]?？莶輻U菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酵母菌是常用的腸道益生菌，能促進人體消化吸收，提高機體免疫力，維持腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡等。本試驗以前人的成果為基礎(chǔ)，進一步研究了大蒜抑制有害菌的活性，并對大蒜抑制益生菌活性進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大蒜及大蒜制品

新鮮大蒜為農(nóng)貿(mào)市場上采購，隨機采購15 份大蒜，要求每份大蒜無蟲、無霉，瓣肉潔白。經(jīng)醋、糖、醬油腌制而成的大蒜成品，包括臘八蒜、糖蒜、咸蒜各采購15 份。

1.1.2 試驗菌種

益生菌：枯草桿菌（Bacillus subtilis）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和酵母菌（Saccharomyces）。有害菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）和白色念珠菌（Monilia albican）。以上菌種均來自ATCC。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母菌、白色念珠菌采用沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；保加利亞乳桿菌采用MRS 肉湯和MRS 瓊脂；嗜熱鏈球菌采用改良M17肉湯和M17 瓊脂。其余菌株的培養(yǎng)采用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂。

1.1.4 儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（SHP-150，上海森保實驗儀器有限公司）；生物安全柜（HR40-IIA2，青島海爾特種電器有限公司）；霉菌培養(yǎng)箱（MJ-70F-1,上海一恒科技有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50SII，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS-QP2010Ultra，日本島津公司)。

1.2 方法

（1）大蒜及其制品的制備。以無菌操作取新鮮大蒜、臘八蒜、咸蒜和糖蒜的蒜瓣，攪碎成蒜泥，稱取適量蒜泥，加入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中稀釋，采用試管法倍比稀釋，新鮮大蒜稀釋成8 個濃度： 100.000 00 mg·mL-1、50.000 00 mg·mL-1、 25.000 00 mg·mL-1、12.500 00 mg·mL-1、 6.250 00 mg·mL-1、3.125 00 mg·mL-1、1.562 50 mg·mL-1和0.781 25 mg·mL-1。臘八蒜稀釋成8 個濃度：800.00 mg·mL-1、400.00 mg·mL-1、200.00 mg·mL-1、100.00 mg·mL-1、50.00 mg·mL-1、25.00 mg·mL-1、12.50 mg·mL-1和6.25 mg·mL-1。咸蒜和糖蒜稀釋成6個濃度：10 000.0 mg·mL-1、5 000.0 mg·mL-1、 2 500.0 mg·mL-1、1 250.0 mg·mL-1、625.0 mg·mL-1和312.5 mg·mL-1。

（2）菌懸液的制備。取試驗菌新鮮培養(yǎng)物，用生理鹽水稀釋至105～106CFU·mL-1，制成菌懸液備用。

（3）最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）的測定。在上述試管中，加入菌懸液0.05 mL，另設(shè)培養(yǎng)液對照。培養(yǎng)后肉眼觀察認(rèn)為無菌生長的試管濃度為最小抑菌濃度。

（4）最小殺菌濃度的測定（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）。再以0.01 mL 接種環(huán)取肉眼觀察認(rèn)為無菌生長的試管接種一環(huán)于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中，能殺死99.9%原始種入的細(xì)菌濃度即為該菌的最小殺菌濃度。

（5）培養(yǎng)條件。細(xì)菌在36 ℃恒溫下，培養(yǎng)24 ～48 h；真菌在28 ℃恒溫下，培養(yǎng)48 ～72 h。

（6）大蒜素含量的測定。大蒜的生物效應(yīng)主要來自其特有的有機硫化物——大蒜素及其衍生物。完整的大蒜不含生物活性的大蒜素，以不穩(wěn)定的蒜氨酸形式存在，大蒜經(jīng)機械破碎，經(jīng)蒜氨酸酶的催化生成了大蒜素。大蒜素主要成分為二烯丙基三硫醚，目前多采用氣相色譜法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定[3]。相較于氣相色譜法，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測靈敏度高，定性可靠，其含量以二烯丙基三硫醚的檢測結(jié)果計。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜素的含量測定結(jié)果

新鮮大蒜、臘八蒜、咸蒜和糖蒜各15 份，計算二烯丙基三硫醚的平均值，結(jié)果見表1，從高到低排序：新鮮大蒜＞臘八蒜＞咸蒜＞糖蒜。二烯丙基三硫醚在新鮮大蒜中的含量明顯高于其他3 種，將新鮮大蒜和臘八蒜的二烯丙基三硫醚的含量進行T檢驗，t值為6.374 6，P＜0.05，有顯著性差異，新鮮大蒜的大蒜素含量高于臘八蒜。

表1 大蒜及大蒜制品二烯丙基三硫醚的含量表

研究表明，大蒜素的穩(wěn)定性受多種因素影響，如溫度、pH 值、紫外線和保存時間。大蒜素在偏酸的環(huán)境中相對穩(wěn)定，15 份臘八蒜的pH 值最小的為3.78，最大的為4.21。臘八蒜由于在酸性環(huán)境中，大蒜素可保存較長時間，含量高于咸蒜和糖蒜[4]。

2.2 新鮮大蒜的抑菌和殺菌活性

新鮮大蒜對真菌和細(xì)菌有很強的抑殺作用， 15 份新鮮大蒜其中13 份樣品在1.562 5 mg·mL-1的濃度下即對白色念珠菌和酵母菌產(chǎn)生抑制，經(jīng)T檢驗，t值為0.096 05，P＞0.05，對二者的抑菌效果無顯著性差異。有7 份樣品在3.125 mg·mL-1的濃度即可殺死這兩種真菌。金黃色葡萄球菌和保加利亞乳桿菌的MIC 經(jīng)T檢驗，t值為0.140 4，P＞0.05，同樣對二者的抑菌效果無顯著性差異。

2.3 MIC 和MBC 測定結(jié)果

由表2 可知，在體外條件下，4 種益生菌對大蒜敏感，臘八蒜次之，咸蒜和糖蒜的抑殺活性微弱，這與大蒜素的含量高低有關(guān)。因此建議服用含酵母菌、枯草桿菌、嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌等益生菌制劑者，最好不要同時食用大蒜,否則有可能導(dǎo)致益生菌制劑不能發(fā)揮作用。

表2 大蒜及大蒜制品對試驗株的MIC 和MBC 平均濃度表（單位：mg·mL-1）

2.4 新鮮大蒜對4 種益生菌的抑菌強度比較

由表3 可看出，15 份樣品的大蒜素含量差距不明顯。大蒜對酵母菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、枯草桿菌的抑菌效果不同。對酵母菌最強，在很低的濃度就能抑制其生長。其次是枯草桿菌，最后是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。

表3 新鮮大蒜對4 種益生菌的抑菌強度比較結(jié)果表

大蒜對真菌有很強的殺傷作用，研究證實，大蒜素能夠破壞氧化還原平衡（還原型谷胱甘肽被氧化），導(dǎo)致酵母細(xì)胞凋亡。大蒜素還能通過抑制不同的轉(zhuǎn)錄因子（YAP1、MSN2/4、RPN4 和SKN7 等），降低一些重要酶類的基因表達(dá)，包括氨基酸代謝（尤其是蛋氨酸）、鐵攝取、呼吸鏈、硫胺素代謝和蛋白酶體的蛋白質(zhì)降解過程[5]。

3 結(jié)論

綜上所述，大蒜對試驗益生菌及有害菌均有抑制作用，兩組微生物并無顯著性差異。大蒜對人體有害菌的抗菌優(yōu)勢使其能用于防病保健，但要注意與活菌制劑及食品的配伍，二者應(yīng)分開使用。本次實驗只選了4 種益生菌進行研究，大蒜對其他益生菌是否具有抑制作用有待進一步研究。大蒜的抑菌活性說明大蒜不僅可應(yīng)用于醫(yī)療保健領(lǐng)域，還可應(yīng)用于食品保鮮[6]。此外，大蒜油有刺激性的氣味且理化性質(zhì)不穩(wěn)定，若能對其進行脫臭處理并制成相關(guān)劑型以保持其穩(wěn)定性，可使其有更廣闊的市場應(yīng)用。