標(biāo)準(zhǔn)曲線和單點校正定量方法的結(jié)果比較

胡嘉敏

（鶴山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，廣東 鶴山 529700）

蔬菜和水果在人們的膳食結(jié)構(gòu)中占據(jù)非常重要的位置，其為人們的生存提供了必需的營養(yǎng)物質(zhì)[1]，在水果和蔬菜的種植過程中，為了得到最大的經(jīng)濟效益，農(nóng)民往往會使用各種不同種類的農(nóng)藥和化肥促進(jìn)生長，消滅或預(yù)防病蟲害[2]。其中有機氯、有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等是農(nóng)藥中比較常用的成分，使用這些藥物往往會導(dǎo)致蔬菜水果等生鮮食品的表面存在一些藥物殘留[3]。隨著人們生活水平的提高以及對食品安全意識的增強，農(nóng)藥殘留的相關(guān)問題成了人們生活中十分關(guān)心的話題，農(nóng)藥的使用備受關(guān)注與爭議[4]。

為了更準(zhǔn)確高效地對農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測，檢測技術(shù)不斷進(jìn)步，相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)也在不斷更新，標(biāo)準(zhǔn)中對殘留量的定量方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單點校正法[5]。單點校正法是通過坐標(biāo)原點與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作直線，對未知濃度的待測組分進(jìn)行測定[6]，單點校正法效率高，但當(dāng)待測組分的濃度與標(biāo)準(zhǔn)樣品的已知濃度有較大差別時會出現(xiàn)較大的誤差。標(biāo)準(zhǔn)曲線法通過配制標(biāo)準(zhǔn)樣品的多個濃度梯度繪制成工作曲線，定量時可以直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出待測組分含量[6]。標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制精度要求高，在實際操作中會出現(xiàn)相關(guān)系數(shù)不符合要求的情況[7]。本文以腐霉利、甲基對硫磷、甲氰菊酯、三唑酮、氧樂果5 種農(nóng)藥為代表，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas Chromatography Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）進(jìn)行測定，比較標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單點校正法兩種定量方法的結(jié)果差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純）；乙酸乙酯（色譜純）；安捷倫QuEChERS 法提取包（內(nèi)含氯化鈉1 g、檸檬酸鈉 1 g、硫酸鎂4 g、檸檬酸氫二鈉0.5 g）、凈化包（內(nèi)含PSA 150 mg 及硫酸鎂900 mg）；腐霉利、甲基對硫磷、甲氰菊酯、三唑酮、氧樂果農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研檢測所，濃度為100 μg·mL-1）。

陶瓷均質(zhì)子：2 cm（長）×1 cm（外徑）；微孔濾膜（有機相）：13 mm×0.22 μm。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 8890-7000D，配有EI 電子轟擊源，質(zhì)譜類型：三重四極桿）；電子天平（梅特勒托利多ME4002E，感量0.01 g）；離心機（天美VELOCITY18R，轉(zhuǎn)速3 000 ～12 000 r·min-1）；高速勻漿機（ 天津恒奧HFJ-10， 轉(zhuǎn) 速8 000 ～ 30 000 r·min-1）；水浴氮吹儀（北京成萌偉業(yè)CM-24，可控溫）；組織搗碎機（日本松下MX-151SG1）；漩渦振蕩器（德國IKA MS3 control）。

1.3 實驗方法

1.3.1 試樣制備

本次實驗采用冬瓜作為實驗基質(zhì)樣品，將其去柄，取全瓜，切成小塊，充分混勻，采用四分法選取合適的樣品樣，將取好的樣品直接放入組織搗碎機中搗碎成漿狀，放入合適的聚乙烯瓶中，放于 -18 ℃或-18 ℃以下條件下保存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥添加

在冬瓜基質(zhì)中添加腐霉利、甲基對硫磷、甲氰菊酯、三唑酮、氧樂果5 種農(nóng)藥，添加濃度分別為 0.05 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1、0.12 mg·kg-1。

1.3.3 提取和凈化

本實驗采用GB 23200.113—2018 QuEChERS 的提取和凈化方法。稱取10.00 g 試樣（精確至0.01 g）于50.00 mL 塑料離心管中，加入10.00 mL 乙腈、1 包安捷倫QuEChERS 法提取包（內(nèi)含氯化鈉1 g、檸檬酸鈉1 g、硫酸鎂4 g、檸檬酸氫二鈉0.5 g）及1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min 后4 200 r·min-1離心5 min[8]。吸取6 mL 上清液加到內(nèi)含PSA 150 mg 及硫酸鎂900 mg 的15.00 mL 塑料離心管（即安捷倫QuEChERS 的凈化包）中，渦旋混勻1 min[8]。4 200 r·min-1離心5 min，準(zhǔn)確吸取2.00 mL上清液于10.00 mL 試管中，45 ℃水浴中氮氣吹至近干[8]。加入1.00 mL 乙酸乙酯進(jìn)行復(fù)溶，過微孔濾膜，用于測定。

1.3.4 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（10 μg·mL-1）配制。準(zhǔn)確量取1.00 mL 100 μg·mL-1腐霉利、甲基對硫磷、甲氰菊酯、三唑酮、氧樂果5 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯溶解并定容至10.00 mL，避光保存于-18 ℃環(huán)境下，有效期為3 個月。

（2）配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取5 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各2.0 mL，置于10.00 mL 的容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2.00 μg·mL-1。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液保存于0 ～4 ℃避光環(huán)境下，有效期2 周。

（3）基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制。準(zhǔn)確量取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙酸乙酯逐級稀釋成0.005 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1、0.050 μg·mL-1、0.100 μg·mL-1、 0.120 μg·mL-1、0.500 μg·mL-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。用氮氣吹干冬瓜基質(zhì)溶液，加入1.0 mL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行復(fù)溶。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液使用時需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.5 測定條件

測定的儀器條件：色譜柱型號為HP-5MS UI （30 m×0.25 mm×0.25 mm）；色譜柱升溫過程：60 ℃ 保持1 min，按照 40℃·min-1的速度升溫到170 ℃，再按照10 ℃·min-1的速度升溫到310 ℃，310 ℃保持3 min；載氣為氦氣，流速為1.2 mL·min-1，純度大于99.999%；電子轟擊源能量為70 eV；進(jìn)樣口的溫度為280 ℃；傳輸線的溫度為280 ℃；離子源的溫度為280 ℃；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，樣品溶液由自動進(jìn)樣器進(jìn)樣；溶劑延遲時間為4 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法來進(jìn)行定量，使用1.3.5 的測定條件 集0.005 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1、 0.050 μg·mL-1、0.100 μg·mL-1、0.500 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，得出的線性回歸方程見表1。從表1 可知，5 種農(nóng)藥的線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性符合要求。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)結(jié)果

2.2 方法的精密度及回收率

本實驗以冬瓜為基質(zhì)，分別添加腐霉利、甲基對硫磷、甲氰菊酯、三唑酮、氧樂果濃度為0.05 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1、0.12 mg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥，進(jìn)行6 次重復(fù)測定，測定結(jié)果見表2。根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告2386 號公告，添加濃度在0.01 ～0.10 mg·kg-1，回收率要求在70%～120%、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差要求≤20%，添加濃度在0.10 ～1.00 mg·kg-1的回收率要求在70%～110%、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差要求≤15%。從表2 中結(jié)果可得，腐霉利、甲基對硫磷、甲氰菊酯、三唑酮、氧樂果5 種農(nóng)藥不同的添加濃度用標(biāo)準(zhǔn)曲線和單點校正兩種方法進(jìn)行定量的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合要求。

2.3 兩種定量方法的測定結(jié)果比較

2.3.1 定量方法和濃度比較

分別對表2 中腐霉利、甲基對硫磷、甲氰菊酯、三唑酮、氧樂果5 種農(nóng)藥在添加濃度0.05 mg·kg-1、 0.10 mg·kg-1、0.12 mg·kg-1的測定結(jié)果進(jìn)行可重復(fù)雙因素方差分析，比較不同添加濃度和不同定量方法對測定結(jié)果的影響。在顯著性水平0.05 下，利用Excel 數(shù)據(jù)分析功能中的方差分析-可重復(fù)雙因素分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表3。從表3 中可知，5 種農(nóng)藥交互的F值均小于臨界值Fcrit=3.32，結(jié)果表明不同的添加濃度采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單點校正法兩種方法進(jìn)行定量的結(jié)果之間沒有顯著差異 （P＞0.05）。

表2 兩種定量方法的測定結(jié)果

表3 不同添加濃度和定量方法的可重復(fù)雙因素方差分析結(jié)果

2.3.2 定量方法和農(nóng)藥品種比較

對添加濃度為0.12 mg·kg-1的腐霉利、甲氰菊酯、甲基對硫磷、氧樂果、三唑酮5 種農(nóng)藥采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單點校正法兩種方法定量的測定結(jié)果進(jìn)行可重復(fù)雙因素方差分析，比較不同農(nóng)藥種類和不同定量方法對測定結(jié)果的影響。在顯著性水平0.05 下，利用Excel 數(shù)據(jù)分析功能中的方差分析-可重復(fù)雙因素分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表4。表4 中交互的F值為0.332 小于Fcrit=2.56，結(jié)果表明不同農(nóng)藥種類采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單點校正法兩種方法進(jìn)行定量的結(jié)果之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

表4 不同農(nóng)藥種類和定量方法的可重復(fù)雙因素方差分析結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，以冬瓜為基質(zhì)，對添加濃度為0.05 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1、 0.12 mg·kg-1的腐霉利、甲基對硫磷、甲氰菊酯、三唑酮、氧樂果進(jìn)行測定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單點校正法兩種方法進(jìn)行定量分析。對測定結(jié)果分為兩類別進(jìn)行可重復(fù)雙因素方差分析：同一農(nóng)藥不同添加濃度和不同定量方法對測定結(jié)果的影響、不同農(nóng)藥種類和不同定量方法對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，不同的添加濃度采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單點校正法兩種方法進(jìn)行定量的結(jié)果之間沒有明顯差異（P＞0.05），不同農(nóng)藥種類采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單點校正法兩種方法進(jìn)行定量的結(jié)果之間沒有顯著差異（P＞0.05）。配制標(biāo)準(zhǔn)曲線過程需要較高的準(zhǔn)確度，當(dāng)數(shù)據(jù)分析中出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)不符合要求的情況時，可以選擇采用單點校正法來進(jìn)行定量，以減少誤差。對于一些易分解的農(nóng)藥種類也可以選用單點校正法，以減少配制時間和上機時間，提高定量準(zhǔn)確性。