豬血漿半胱氨酸蛋白酶抑制肽的篩選及其機(jī)制

王嘉敏，王逐鹿，常思佳，劉漢雄，王震宇

（大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

我國(guó)豬血資源非常豐富，作為我國(guó)一大禽畜類血液，我國(guó)對(duì)動(dòng)物血液的使用率較低，基本都是被用來(lái)制作成一些血腸、血豆腐等食品，但這些傳統(tǒng)食品的加工效率低、帶來(lái)的綜合效益也較低[1]。近年來(lái)對(duì)動(dòng)物血液的研究才逐漸豐富起來(lái)，在食品加工和生物醫(yī)藥中的應(yīng)用也逐漸增多，如制作一些新型血液制品等，提高了我國(guó)血液的開(kāi)發(fā)利用程度[2-4]。豬血作為畜產(chǎn)品加工的副產(chǎn)物，因其血腥味較重、呈現(xiàn)的鮮紅色或者深紅色的色澤差、儲(chǔ)藏期短，限制了對(duì)豬血的利用，諸多因素導(dǎo)致目前我國(guó)血液加工利用率水平低、產(chǎn)品附加值低，寶貴的血資源得不到充分的利用，更難以發(fā)揮其蛋白的價(jià)值。已有研究表明血漿能夠抑制魚(yú)糜凝膠劣化過(guò)程中組織蛋白酶活性、增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度[5-7]。但是，血漿直接添加可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品顏色、風(fēng)味的顯著變化，影響魚(yú)糜品質(zhì)，因此開(kāi)發(fā)基于血漿的組織蛋白酶抑制肽能夠有效避免上述劣勢(shì)，為豬血漿的綜合利用及其制品在水產(chǎn)加工中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 原料與試劑

新鮮豬血（已加入抗凝劑），購(gòu)買(mǎi)于大連市仟和市場(chǎng)；胰蛋白酶與組織蛋白酶L 購(gòu)買(mǎi)于江蘇南京沃瑞達(dá)斯有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器

超高效液相四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCQ-TOF Impact II），德國(guó)Bruker 公司；分子對(duì)接軟件Discovery Studio v2017，法國(guó)Dassault Systèmes 公司；AKTA avant-25 蛋白純化儀，美國(guó)Cytiva 公司。

1.3 方法

1.3.1 豬血漿蛋白的制備

新鮮豬血漿在4 000 g、10 min 條件下進(jìn)行離心，取上清液。加入硫酸銨至30%飽和度，4 ℃靜置6 h后，8 000 g 離心20 min 取上清，在上清液中繼續(xù)添加硫酸銨至60%飽和度，4 ℃靜置6 h 后10 000 g 離心 20 min 取沉淀的蛋白，加入3 倍（v/w）的PB 緩沖液 （20 mmol·L-1，pH 6.8），在3 500 Da 透析袋中透析12 h，去除其中多余的硫酸銨，4 ℃保存用于后續(xù)酶解反應(yīng)。

1.3.2 多肽的酶解制備

在透析過(guò)的蛋白溶液中，按200 ∶1（原料蛋白∶胰蛋白酶）（w/w）的比例加入胰蛋白酶，在45 ℃，pH 8.0 的條件下酶解3 h，每隔30 min 用0.5 mol·L-1的NaOH 溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)維持pH 恒定，采用pH-state法對(duì)酶解過(guò)程中的水解度進(jìn)行測(cè)定[8]，水解度的計(jì)算公式為

式中：h為酶解液中生成的游離氨基的數(shù)量，mmol·g-1protein；hhot為底物中蛋白質(zhì)中肽鍵的總數(shù)，mmoL·g-1protein，在本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)原料種類選取8.8 mmoL·g-1protein[9]；B為滴定消耗NaOH 的體積，mL；Nb為用于滴定的NaOH 濃度，mol·L-1；a為氨基的解離度，其計(jì)算參考公式（2）；Mp為底物中蛋白質(zhì)的總含量，g。

式中：pH取酶解體系pH 值8.5；堿滴定的情況下pK為氨基解離常數(shù)，取值7.5。

1.3.3 多肽混合物的弱陰離子交換層析

酶解后的多肽混合物使用AKTA avant-25 儀器以及DEAE-Sepharose 柱進(jìn)行分離純化[10]，用含有不同氯化鈉濃度的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，梯度設(shè)置為 0.1 mol·L-1、0.2 mol·L-1、0.3 mol·L-1、0.4 mol·L-1和 0.5 mol·L-1氯化鈉濃度，每個(gè)濃度梯度沖洗一個(gè)柱體積，流速為1 mL·min-1，按峰收集，并測(cè)定抑制活性。

1.3.4 多肽混合物的超濾分級(jí)

取抑制活性最強(qiáng)的陰離子交換組分，分別采用 3 kDa 和10 kDa 的超濾膜進(jìn)行分級(jí)，分別得到分子量為0 ～3 kDa、3 ～10 kDa 以及10 kDa 以上3 個(gè)分子量組分。分別進(jìn)行凍干，超純水復(fù)溶后測(cè)定抑制活性。

1.3.5 多肽組織蛋白酶抑制活性的測(cè)定

組織蛋白酶L 活性的測(cè)定按照Barrett 方法[11-12]，并略微有改動(dòng)。

（1）組織蛋白酶L 活力的測(cè)定。一個(gè)酶活力單位（U）定義為在反應(yīng)溫度37 ℃及條件下，1 min 內(nèi)能夠水解底物并釋放出1 nmol AMC 所需的酶量（1 nmol AMC·min-1）。①溶液配制。反應(yīng)終止液：0.1 mol·L-1乙酸-乙酸鈉緩沖液，含0.1 mol·L-1氯乙酸（pH為6.0）；反應(yīng)緩沖液：0.34 mol·L-1乙酸鈉、0.06 mol·L-1冰乙酸、4 mmol·L-1EDTA-2Na、8 mmol·L-1DTT；底物：Z-苯丙胺酰-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素配制成40 μmol·L-1的溶液，作為組織蛋白酶L 的專一性底物。②組織蛋白酶L 活力的測(cè)定。組織蛋白酶L 與PB 緩沖液按照5 ∶2 充分混合，取混合液100 μL，加入底物Z-苯丙胺酰-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素25 μL，加入反應(yīng)緩沖液50 μL，充分混勻37 ℃水浴15 min，然后再加入200 μL 反應(yīng)終止液，混勻后終止反應(yīng)，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。測(cè)定所用的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為380 nm和460 nm。

（2）豬血漿對(duì)組織蛋白酶L 的抑制活性的測(cè)定。樣品1：0 ～3 kDa；樣品2：3 ～10 kDa，樣品3：10 kDa 以上。測(cè)樣溶液按照表1 進(jìn)行配制，混勻后37 ℃水浴15 min。

表1 測(cè)樣制備

（3）抑制率測(cè)定。在激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm 條件下用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，設(shè)置對(duì)照組為A1，空白組為A2，樣品為A3。抑制率測(cè)定公式為

1.3.6 超高效液相四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定多肽氨基酸序列

通過(guò)用超高效液相四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法對(duì)多肽溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，具體方法參考文獻(xiàn)[13]，在NCBI 網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索豬（S.scrofa）的基因庫(kù)[14]，進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。

1.3.7 分子對(duì)接

將比對(duì)完的多肽氨基酸序列進(jìn)行篩選，用分子對(duì)接軟件Discovry Studio 2017 模擬抑制肽與組織蛋白酶L（PDB ID：3BC3）相互作用，并分析具體的相互作用結(jié)合的具體氨基酸，作用活性位點(diǎn)[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬血漿蛋白的水解過(guò)程

由圖1 可知，酶解前期，在0 ～1.0 h，由于底物蛋白濃度較高，胰蛋白酶活旺盛，酶解體系pH基本不變，酶解程度較高，蛋白酶水解較快，水解度高幅度增長(zhǎng)；隨著酶解的持續(xù)進(jìn)行，從進(jìn)行酶解 1.0 h 后胰蛋白酶酶解速度開(kāi)始降低，胰蛋白酶降解，酶解體系pH 變化大，酶解速度降低，水解度雖然一直有提升趨勢(shì)但增長(zhǎng)變得逐漸緩慢。胰蛋白酶酶解 3.0 h 的水解度為3.65%。

圖1 酶解反應(yīng)中蛋白水解度變化曲線

對(duì)血漿全蛋白、鹽析得到的蛋白沉淀以及酶解后得到的多肽混合物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2 所示，豬血漿蛋白分子量大小基本集中在50 kDa 以上，少部分為15 kDa 和25 kDa，由此可得出豬血漿中的蛋白大多都可被胰蛋白酶水解為肽；用硫酸銨鹽溶液鹽析后的血漿蛋白分子量大小集中于50 ～75 kDa，少部分為25 kDa 和15 kDa，比鹽析之前的血漿蛋白量有所減少，說(shuō)明鹽析使得大部分蛋白沉淀下來(lái)；血漿蛋白酶解后，大蛋白幾乎被降解，肽的分子量主要集中分布在20 kDa 以下，呈彌散條帶，分布范圍廣，說(shuō)明大部分蛋白基本都被酶解為肽，且酶解后的肽其中的成分復(fù)雜，由多種小分子肽組成。

圖2 豬血漿蛋白及鹽析和酶解后的SDS-PAGE 凝膠電泳分析

2.2 豬血漿半胱氨酸蛋白酶抑制肽的分離純化

根據(jù)目標(biāo)多肽的性質(zhì)預(yù)測(cè)，選用陰離子交換層析作為第一步純化。大量呈正電荷的多肽沒(méi)有被填料吸附，在梯度洗脫程序前即流出。使用含有氯化鈉的緩沖液，通過(guò)改變進(jìn)入柱子的緩沖液的電導(dǎo)率，將不同結(jié)合力的蛋白沖洗下來(lái)并進(jìn)行收集。根據(jù)出峰結(jié)果適當(dāng)調(diào)整氯化鈉濃度梯度，最終得到如圖3所示的4 個(gè)分離完全、不拖尾的洗脫峰，按出峰位置分別收集洗脫液。

圖3 豬血漿酶解物DEAE-弱陰離子交換層析分離純化

從表2 中可以看出經(jīng)過(guò)陰離子交換層析后，帶有負(fù)電荷的多肽組分普遍具有更高的酶活抑制率，其中洗脫峰1 的抑制率最高，為26.83%。雖然其體現(xiàn)出了較顯著的組織蛋白酶抑制活性，但抑制率仍較低，需要對(duì)其組分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

表2 豬血漿酶解物陰離子交換層析后組分的酶活抑制率

進(jìn)一步采用超濾分級(jí)的方式對(duì)洗脫峰1 中的組分進(jìn)行分離，并對(duì)回收的多肽組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，如圖4 所示。由圖4 可知，10 kDa 以上超濾截留液中含有大量分子量15 kDa 左右以及超 35 kD 的蛋白，而0 ～3 kDa 超濾截留液中幾乎不含有大分子蛋白條帶，僅顯示了最下端的多肽條帶，3 ～ 10 kDa 超濾截留液中大蛋白含量明顯減少，小分子蛋白和多肽的條帶明顯。在對(duì)上述3 個(gè)組分進(jìn)行組織蛋白酶抑制率分析后（表3），可見(jiàn)小分子量組分普遍具有更高的酶抑制活性，其中洗脫峰1 中分子量0 ～3 kDa 的組分其酶活抑制率最高，達(dá)35.15%。該組分具有一定量的負(fù)電荷，同時(shí)分子量較小，能有效與組織蛋白酶相結(jié)合，進(jìn)而達(dá)到競(jìng)爭(zhēng)性抑制的效果，但具體多肽的氨基酸序列情況以及發(fā)揮功效的作用機(jī)制還有待探究。因此有必要對(duì)其中的多肽氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定分析。

圖4 豬血漿蛋白酶解超濾后肽的SDS-PAGE 凝膠電泳分析

表3 洗脫峰1 中不同分子量組分的酶活抑制率

2.3 組織蛋白酶抑制肽組分中的多肽氨基酸序列

將超濾分級(jí)后分子量為0 ～3 kDa 的肽溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析。在Mascot 軟件上對(duì)UPLC-Q-TOF 聯(lián)用質(zhì)譜后的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，再利用NCBI 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中豬的基因庫(kù)進(jìn)行多肽氨基酸序列的比對(duì)，一共比對(duì)出35 條肽段，如表4 所示，長(zhǎng)度范圍為16 ～40 aa，分子量為2 013.9 ～4 306.7 Da，來(lái)源蛋白包括假定蛋白質(zhì)、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)錄激活蛋白Pur-alpha、 N-甲基轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞周期素依賴性激酶1、KH 結(jié)構(gòu)域RNA 結(jié)合蛋白、琥珀酰輔酶A 合成酶、血紅蛋白、肌聯(lián)蛋白、纖溶酶原、未表征蛋白、包膜糖蛋白、假定轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、唾液酸胎球蛋白、烯醇化酶1(α)、內(nèi)源性因子鈷胺素、F-box 蛋白、假定胰蛋白酶以及二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1 等。根據(jù)目標(biāo)蛋白來(lái)源、細(xì)胞定位進(jìn)行篩選，例如琥珀酰輔酶A 合成酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄激活蛋白Pur-alpha、N-甲基轉(zhuǎn)移酶都是在酶解血漿蛋白時(shí)細(xì)胞所產(chǎn)生的作用酶，用以提供酶解過(guò)程的需要或者其他活動(dòng)，不是豬血漿本身所含有物質(zhì)酶解之后產(chǎn)生的，是細(xì)胞生理活動(dòng)中所產(chǎn)生的。因此，此類多肽氨基酸序列不做進(jìn)一步研究。根據(jù)上述超濾分級(jí)后酶活性測(cè)定等實(shí)驗(yàn)的分析得到的分子量為0 ～3 kDa 的多肽氨基酸序列抑制率最高，篩選出分子量為3 kDa 以下的多肽氨基酸序列。再如，某些蛋白在血漿中的含量較少的也不作進(jìn)一步研究。因此本實(shí)驗(yàn)共篩選出分子量小于3 kDa 的兩個(gè)肽段，如表4 所示，將序號(hào)24 和25 的兩條多肽氨基酸序列命名為PP1、PP2，PP1 蛋白來(lái)源為血紅蛋白，其氨基酸序列分別為EAVLGLWGKVNVDEVGGEALGR，長(zhǎng)度為22 aa，分子量為2 267.2 Da，PP2 蛋白來(lái)源為纖溶酶原，其氨基酸序列為VILGAHEEYHLGEGVQEIDVSK，長(zhǎng)度為22 aa，分子量為2 421.2 Da，然后進(jìn)一步通過(guò)分子對(duì)接模擬探索半胱氨酸蛋白酶抑制劑的作用機(jī)制。

表4 豬血漿中0 ～3 kDa 肽溶液質(zhì)譜分析后氨基酸序列檢索結(jié)果

2.4 抑制肽PP1 和PP2 與組織蛋白酶L 相互作用的機(jī)制

如圖5（a）所示，紅色球部為組織蛋白酶L 的作用部位，圖5（b）中球棍分子模型為PP1，條帶分子模型為組織蛋白酶L，其鉤狀凹下的部位為作用活性部位催化中心，PP1在組織蛋白酶L 的活性位點(diǎn)作用，阻止了組織蛋白酶L 與其他蛋白等物質(zhì)的結(jié)合作用，起到了抑制其作用活性的目的。圖6 所展示的是分子模擬分析二者相互作用位點(diǎn)附近關(guān)鍵氨基酸。表5 可以看出抑制劑與組織蛋白酶L 之間的相互作用情況，其分子間作用力有靜電力、氫鍵，其中氫鍵為二者發(fā)生相互作用的主要作用力，分子間作用力鍵長(zhǎng)范圍為1.961 04 ～5.018 80 ?。分子模擬結(jié)果表明組織蛋白酶L 作用的作用位點(diǎn)為H166、H234、H239、H244、H256、H313，其氨基酸位點(diǎn)為L(zhǎng)YS117、SER158、GLU159，肽作用位點(diǎn)為H3、H4、H6、H14、N15，其氨基酸位點(diǎn)為GLY20、GLN21、GLY23，在二者的混合體系中，兩者通過(guò)活性位點(diǎn)緊密貼合，并相互作用。

表5 PP1 與組織蛋白酶L 相互作用的關(guān)鍵氨基酸化學(xué)作用力類型及鍵長(zhǎng)

圖5 組織蛋白酶L 的作用部位及其與PP1 相互作用的分子模擬

圖6 PP1 與組織蛋白酶L 相互作用位點(diǎn)附近的關(guān)鍵氨基酸

如圖7 所示，圖中條帶模型分子為組織蛋白酶L，球棍模型分子為PP2，以抑制劑纖溶酶原作為供體，組織蛋白酶L 為受體，鉤狀凹下的部位為作用活性部位催化中心，PP2 在組織蛋白酶L 的活性位點(diǎn)作用，阻止了組織蛋白酶L 與其他蛋白等物質(zhì)的結(jié)合作用，起到了抑制其作用活性的目的，與PP1 對(duì)組織蛋白酶L 的抑制作用原理是相同的。圖8 所顯示的是二者結(jié)合相互作用位點(diǎn)附近的關(guān)鍵氨基酸。抑制劑與蛋白酶之間相互結(jié)合的分子間作用力只有氫鍵，鍵長(zhǎng)為2.443 32 ?，肽作用位點(diǎn)氨基酸為GLN21，組織蛋白酶L 作用位點(diǎn)為H243，作用活性位點(diǎn)只有一個(gè)的原因可能是PP2 與組織蛋白酶L 的相互結(jié)合的關(guān)系不緊密或PP2 對(duì)組織蛋白酶L 的抑制作用不明顯，作用力較弱，需要進(jìn)一步的實(shí)際實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證和深入的研究。

圖7 PP2 與組織蛋白酶L 相互作用的分子對(duì)接模型

圖8 PP2 與組織蛋白酶L 相互作用位點(diǎn)附近的關(guān)鍵氨基酸

3 結(jié)論

本研究以豬血漿為研究對(duì)象，將其血漿蛋白經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽溶液分級(jí)沉淀、胰蛋白酶酶解，再利用陰離子交換層析和超濾分級(jí)的方法對(duì)其中的半胱氨酸蛋白酶抑制肽組分進(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)具有少量負(fù)電荷的多肽組分、分子量小于3 kDa 的組分具有更高的酶活抑制率，最高抑制率達(dá)35.15%，再通過(guò)UPLC-QTOF 聯(lián)用質(zhì)譜鑒定分析，然后在NCBI 中檢索比對(duì)抑制肽的氨基酸序列，并從中篩選出具有有效成分的多肽氨基酸序列PP1 和PP2，通過(guò)抑制肽與組織蛋白酶L 模擬分子對(duì)接分析抑制肽和組織蛋白酶L 的結(jié)合作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PP1 抑制肽可與組織蛋白酶L 通過(guò)活性中心緊密結(jié)合，模擬結(jié)果顯示PP1 與組織蛋白酶L 之間存在13 個(gè)作用位點(diǎn)，且分子間作用力主要為氫鍵，極少部分為靜電力。上述研究結(jié)果為豬血漿蛋白高效綜合利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。