注射用三磷酸胞苷二鈉含量均勻度測(cè)定方法研究*

張雪艷，周長(zhǎng)明，趙 璇

（北京市藥品檢驗(yàn)研究院·國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

三磷酸胞苷二鈉（CTP）屬核苷酸衍生物，主要參與核酸及磷脂的代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。CTP 可在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化成二磷酸胞苷（CDP）和一磷酸胞苷（CMP），并釋放能量，是腦磷脂合成與核酸代謝的中間產(chǎn)物和能量來源，可通過血- 腦屏障，提高神經(jīng)細(xì)胞抗損傷能力，對(duì)腦組織有營養(yǎng)、促進(jìn)再生、修復(fù)的作用［1-2］?？疾? 廠家29 批注射用三磷酸胞苷二鈉的含量均勻度時(shí)，發(fā)現(xiàn)各家企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中該檢查項(xiàng)差異較大，2 家未設(shè)定該檢查項(xiàng)，5 家采用紫外-可見分光光度法，在280 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定單支樣品溶液吸光度值，并與10 支樣品溶液吸光度的平均值比較。按原國家食品藥品監(jiān)督管理局《化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)：第16 冊(cè)》及多版CTP注射液標(biāo)準(zhǔn)（YBH20032004，YBH24642005，YBH36782005，YBH39322005，YBH07902006，YBH18242006）對(duì) 注 射用三磷酸胞苷二鈉的含量均勻度進(jìn)行測(cè)定，7廠家29批樣品均低于±15%限度值，全部合格。由于CTP 降解生成CDP 和CMP，有效基團(tuán)并未發(fā)生改變，降解產(chǎn)物依然具有紫外吸收，故紫外- 可見分光光度法測(cè)定制劑時(shí)專屬性差，且結(jié)果判定范圍過于寬泛，并不能有效控制制劑質(zhì)量。本研究中建立了以胞苷為對(duì)照品的高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定含量均勻度，并參考2020年版《中國藥典（四部）》通則0941要求，以A+2.2S≤15.0 為判定標(biāo)準(zhǔn)［3］，考察市售注射用三磷酸胞苷二鈉含量均勻度的整體情況。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV - 2450 型紫外分光光度計(jì)，LC - 20AT 型高效液相色譜儀（包括SPD - M20A 型二極管陣列檢測(cè)器、Shimadzu LC - Solution 色譜工作站），均購自日本Shimadzu公司。

1.2 試藥

注射用三磷酸胞苷二鈉（國家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品，來自7 個(gè)廠家，共29 批）；CTP 對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為140758 - 201101，含量92.90%）；胞苷對(duì)照品（美國Sigma 公司，批號(hào)為BCBV5023，含量99.9%）；四丁基溴化銨為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.02 mol/ L 磷酸鹽緩沖液（稱取磷酸二氫鈉3.58 g，磷酸二氫鉀1.36 g，加水900 mL 使溶解，調(diào)pH至7.0，加入四丁基溴化銨1 g，加水定容至1 000 mL）-乙腈（90∶10，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：271 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

稱取CTP對(duì)照品20 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，得質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的CTP 對(duì)照品溶液。稱取胞苷對(duì)照品20 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的胞苷對(duì)照品溶液。取樣品適量，每支用流動(dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL（規(guī)格為20 mg）或100 mL（規(guī)格為40 mg）容量瓶中，用流動(dòng)相定容，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下CTP 對(duì)照溶液適量（水浴1 h），以及胞苷對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。理論板數(shù)按CTP 峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

1.CMP 2.CDP 3.CTP 4. 未知雜質(zhì)A.CTP對(duì)照品溶液 B. 胞苷對(duì)照品溶液 C. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.CMP 2.CDP 3.CTP 4.Unknown impurityA.Reference solution of CTP B.Reference solution of cytidine C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取CTP 對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相制成系列對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以CTP質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=17 256 815X+ 94 796（r= 0.999 9）。結(jié)果表明，CTP 質(zhì)量濃度在0.019 11～1.910 95 mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

進(jìn)樣精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.05%（n=6），表明方法精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量（92.60%）的樣品適量，共9 份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的CTP 對(duì)照品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 以胞苷為對(duì)照品計(jì)算核正因子

標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值：稱取胞苷對(duì)照品4.86，9.18，13.17，19.30，24.65 mg，精密稱定，分別置100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，作為胞苷對(duì)照品系列溶液。取CTP對(duì)照品5.63，12.00，14.37，19.96，25.80 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，作為CTP 對(duì)照品系列溶液。按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得胞苷和CTP回歸方程分別為Y1=33 519 577X1+548 544（r>0.998）和Y2= 15 452 159X2+ 45 500（r> 0.998）。質(zhì)量濃度相同時(shí)，胞苷與CTP的峰面積之比（K胞/KCTP）為2.169。

胞苷吸收系數(shù)測(cè)定：取胞苷對(duì)照品溶液與相同濃度CTP對(duì)照品溶液，以流動(dòng)相為稀釋劑，于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描紫外光譜圖，狹縫寬度為1.0 nm，得到胞苷和CTP 最大吸收波長(zhǎng)均為271 nm。取胞苷對(duì)照品溶液與CTP 對(duì)照品溶液，分別以紫外分光光度計(jì)測(cè)定271 nm 波長(zhǎng)處吸光度值，并用最大值計(jì)算吸收系數(shù)（E）。結(jié)果胞苷吸收系數(shù)為375.7，CTP 吸收系數(shù)為172.4，兩者吸收系數(shù)比值為2.179。

2.5 樣品含量均勻度測(cè)定

取29 批樣品各適量，分別按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積，以胞苷為對(duì)照品的外標(biāo)法，采用2.167 為折算系數(shù)計(jì)算樣品含量均勻度。并與法定檢驗(yàn)方法［3］結(jié)果比較。結(jié)果見表2。

表2 各生產(chǎn)廠家樣品含量均勻度測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of uniformity of dosage unit of samples from different manufacturers

3 討論

根據(jù)批準(zhǔn)文號(hào)信息，多數(shù)生產(chǎn)廠家采用紙電泳法測(cè)定含量，含量均勻度采用紫外分光光度法在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算10支樣品吸光度值的偏差。紫外分光光度法測(cè)定的吸光度值不能反映CTP 主成分降解情況，即不能準(zhǔn)確測(cè)定藥物制劑的含量均勻度。根據(jù)本課題組前期已優(yōu)化好的色譜條件及文獻(xiàn)［4 - 5］，本研究中采用了2種確定校正因子的測(cè)定方法：質(zhì)量濃度相同時(shí)胞苷與CTP 的峰面積之比為2.169；紫外吸收系數(shù)之比為2.179，這兩種方法與CTP 的質(zhì)量比的經(jīng)典公式中的2.167（CTP 相對(duì)分子質(zhì)量與胞苷相對(duì)分子質(zhì)量比值MCTP/M胞= 527.1/ 243.2 = 2.167）標(biāo)準(zhǔn)差≤0.5%。考慮到HPLC 法及紫外分光光度法測(cè)定結(jié)果存在一定誤差，計(jì)算過程中折算系數(shù)采用質(zhì)量比公式中的2.167。本研究中建立了以胞苷為對(duì)照品，以2.167為折算系數(shù)的外標(biāo)法，考察了國家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)中注射用三磷酸胞苷二鈉的含量均勻度。

注射用三磷酸胞苷二鈉由于熱不穩(wěn)定等原因，結(jié)合市場(chǎng)藥品實(shí)際情況，目前現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)含量測(cè)定設(shè)置上限，企業(yè)存在多投料，以規(guī)避產(chǎn)品降解后含量測(cè)定不合格的風(fēng)險(xiǎn)。按照2020 年版《中國藥典（四部）》判定含量均勻度結(jié)果，A+ 2.2S，其中A值可以對(duì)目前市場(chǎng)上高投料的情況進(jìn)行控制，2.2S值可對(duì)同一批樣品中每瓶的均質(zhì)程度進(jìn)行控制。裝量差異或紫外分光光度法均無法對(duì)主成分的均勻性進(jìn)行考察，均為間接測(cè)定產(chǎn)品符合標(biāo)示量程度的指標(biāo)。

另有企業(yè)采用HPLC 法根據(jù)經(jīng)典公式計(jì)算CTP 的質(zhì)量比（%），再結(jié)合紫外分光光度法測(cè)定總核苷酸，最終通過計(jì)算得到含量［6］。該方法采用HPLC 和紫外兩步測(cè)定，易造成系統(tǒng)誤差；還有一種試行標(biāo)準(zhǔn)以CTP 為對(duì)照品的外標(biāo)法測(cè)定，CTP 對(duì)照品具有較強(qiáng)的引濕性，并對(duì)溫度敏感，需低溫保存，易發(fā)生降解。以胞苷為對(duì)照品，不僅可準(zhǔn)確測(cè)定樣品中主成分的含量，同時(shí)，在后期研究中，可準(zhǔn)確地測(cè)定有關(guān)物質(zhì)中CTP 的降解情況，便于對(duì)其他雜質(zhì)的控制。

綜上所述，現(xiàn)行藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量均勻度測(cè)定項(xiàng)存在一定問題。以胞苷為對(duì)照品的HPLC 法測(cè)定注射用三磷酸胞苷二鈉含量均勻度，方法更科學(xué)、更準(zhǔn)確，能更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。