Caco-2 細胞模型中頭花蓼提取液對左氧氟沙星吸收的影響*

蒙文莎，袁 麗，王 樸，鄭 林，鞏仔鵬，李月婷，王愛民，黃 勇△

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點實驗室·藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004； 3. 貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004）

左氧氟沙星為第3代氟喹諾酮類抗菌藥物，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有廣譜活性，臨床主要用于治療呼吸道和泌尿道感染［1］。頭花蓼為苗族傳統(tǒng)藥用植物頭花蓼的全草，具有利尿通淋、清熱利濕、活血散瘀等功效［2］，對尿路感染有較好療效，其所含多酚化學(xué)成分沒食子酸和原兒茶酸具有抗氧化、抗菌、抗炎等作用［3-5］。目前以頭花蓼為原料藥已上市的苗藥制劑有四季草顆粒、熱淋清顆粒等，其中熱淋清顆粒是以頭花蓼水提物制成的單方制劑，對泌尿系統(tǒng)感染具有獨特療效［6］。熱淋清顆粒常與左氧氟沙星聯(lián)用治療前列腺炎、急性附睪炎等泌尿道感染，與單獨使用相比，聯(lián)用后具有起效快、不良反應(yīng)少、用藥周期短、治愈率高等優(yōu)點［7-9］，但兩藥聯(lián)用后是否發(fā)生藥物相互作用尚未見報道。本課題組前期的藥物代謝動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與單用左氧氟沙星相比，頭花蓼提取液和左氧氟沙星聯(lián)用后，左氧氟沙星的平均駐留時間（MRT）、血藥濃度達峰時間（tmax）、表觀清除率（CLz/F）和表觀分布容積（Vz/F）均顯著增加，而其藥- 時曲線下面積（AUC0-∞）和峰濃度（Cmax）均顯著降低，表明兩藥聯(lián)用后發(fā)生了藥物相互作用［10］。為此，本研究中以沒食子酸和原兒茶酸作為頭花蓼提取物的指標性成分，考察頭花蓼提取液與左氧氟沙星聯(lián)用后對兩藥在Caco - 2 細胞模型中吸收的影響［11-14］，從而為兩藥的臨床使用提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與細胞

儀器：ACQUITY UPLC I- Class/Xevo TQ - S 型超高效液相色譜- 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括自動進樣器，二元梯度泵，柱溫箱，真空脫氣機，MassLynx 4.1質(zhì)譜工作站（美國Waters公司）；Model 680型酶標儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品<上海>有限公司）；TS-100F型倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；Millipore Millicell ERS. 2 型細胞電阻儀（美國Millipore 公司）；8000DH 型CO2培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；Transwell培養(yǎng)板（聚碳酯膜，孔徑0.4 μm，直徑12 mm，美國Coming公司）；MTN-2800D 型氮氣吹干儀裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；KQ - 500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

試藥：頭花蓼提取物（本課題組提?。?5］）；左氧氟沙星對照品（批號為130455-201607，含量97.3%），葛根素對照品（批號為110752-201512，含量98.0%），原兒茶酸對照品（批號為110809-201604，含量90.8%），沒食子酸對照品（批號為110831-201605，含量98.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；BCA 蛋白定量試劑盒（上海索萊寶生物有限公司，批號為20190603）；細胞增殖（MTS）試劑盒（普洛麥格生物有限公司，批號為0000383823）；澳洲胎牛血清（批號為2279804CP），鏈-青霉素（批號為15140122），胰酶消化液（批號為C25200056），DMEM 高 糖 培 養(yǎng) 基（ 批 號 為C11995500BT），均購自美國Gibco 公司；其余試劑均為分析純；水為超純水。

細胞株：結(jié)直腸腺癌Caco - 2 細胞株（中科院上海細胞庫）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 溶液制備

頭花蓼提取液：取頭花蓼提取物500 mg，精密稱定，加入4 950 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）和50 μL 的二甲基亞砜（DMSO），制備成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的頭花蓼溶液，置-20 ℃貯藏，備用。

左氧氟沙星溶液：取左氧氟沙星對照品90 mg，加入2 970 μL PBS和30 μL DMSO，制備成質(zhì)量濃度為30 mg/mL（83 017 μmol/ L）的左氧氟沙星溶液，置- 20 ℃貯藏，備用。

對照品溶液和內(nèi)標溶液：取原兒茶酸、沒食子酸、左氧氟沙星對照品各適量，精密稱定，置容量瓶中，并用甲醇定容至10 mL，得原兒茶酸（0.831 mg/ mL），沒食子酸（1.002 mg/mL），左氧氟沙星（1.002 mg/mL）單一對照品溶液。取葛根素對照品4.95 mg，精密稱定，用50%甲醇定容至10 mL，得葛根素（0.495 mg/mL）對照品溶液；取適量，置100 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，制備成質(zhì)量濃度為20 ng/mL 的內(nèi)標溶液，置-20 ℃貯藏，備用。

空白細胞懸液：取Caco - 2 細胞適量，接種于含10%胎牛血清和1%鏈-青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長約80%時，用0.25%胰蛋白酶消化液消化細胞，按1×105mL-1密度接種于6 孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，1 周內(nèi)隔天換液1 次，1 周后每天換液1 次，連續(xù)14 d，復(fù)制屏障模型細胞［16-21］。取模型細胞，用Hanks緩沖液洗去細胞表面雜質(zhì)，加入超純水2 mL，反復(fù)凍融裂解細胞，收集細胞懸液，置-20 ℃保存，待用。

樣品溶液：取細胞懸液500 μL，加入20 ng/mL內(nèi)標溶液50 μL，再加入500 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理10 min，12 000 r/ min 離心10 min，取上清液置離心管中，37 ℃下N2吹干；200 μL 50%甲醇水溶液互溶，渦旋超聲10 min，12 000 r/ min 離心10 min，取上清液，即得。

2.1.2 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Waters BEH C18柱（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；保護柱為Waters Van Guard BEH C18柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）- 0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～0.3 min 時90% A，0.3～1 min 時90% A→85% A，1～2 min 時85%A→90%A，2～3 min 時90%A，3～4 min 時90%A→10% A）；流速為0.30 mL/min；柱溫為40 ℃，進樣體積為1 μL。

1. 左氧氟沙星 2. 葛根素 3. 原兒茶酸 4. 沒食子酸A. 空白細胞懸液 B. 空白細胞懸液+對照品溶液 C. 細胞攝取樣品圖1 超高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)色譜圖1.Levofloxacin 2.Puerarin 3.Protocatechuic acid 4.Gallic acidA.Blank cell suspension B.Blank cell suspension+ reference solution C.Samples solution after cell absorptionFig.1 UPLC-MS/MS chromatograms

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI），正、負離子模式；毛細管電壓為2.0 kV，離子源溫度為120 ℃；噴霧氣與反吹氣為N2，去溶劑氣流速為800 L/h，去溶劑氣溫度為400 ℃，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描方式，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx 4.1 質(zhì)譜工作站。待測成分及內(nèi)標的質(zhì)譜條件見表1。色譜圖見圖1。

表1 待則成分及內(nèi)標的質(zhì)譜條件Tab.1 Mass spectrometry conditions of components to be tested and internal standard

2.1.3 方法學(xué)考察

精密量取2.1.1項下各單一對照品溶液適量，分別量取適量空白細胞懸液加入，用甲醇倍比稀釋，制成系列混合對照品溶液，按“2.1.1 樣品溶液處理”項下方法操作，按2.1.2 項下試驗條件進樣測定，以待測成分質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，按相關(guān)規(guī)定計算定量限［15］?；貧w方程與線性范圍、定量限見表2。并進行精密度、穩(wěn)定性、提取回收試驗。結(jié)果3種待測成分日內(nèi)精密度的RSD為3.53%～11.69%（n=6），日間精密度的RSD為4.22%～13.23%（n=6）；樣品室溫下放置1，2，3 d 時儀器響應(yīng)值的RSD均小于15%（n=5）；提取回收率為87.06%～105.59%。

表2 回歸方程、線性范圍、定量限Tab.2 Regression equations，linear ranges and LOQs

2.2 細胞形態(tài)觀察

取2.1.1項下空白細胞懸液中模型細胞，顯微鏡下觀察，可見細胞生長均勻，邊界清晰，成單層膜狀態(tài)。詳見圖2。

A. 培養(yǎng)2 d B. 培養(yǎng)14 d圖2 Caco-2細胞一般形態(tài)A.Culture for 2 d B.Culture for 14 dFig.2 General morphology of Caco-2 cells

2.3 Caco-2 細胞毒性考察

取生長狀態(tài)良好的Caco-2細胞適量，以每孔100 μL，1×105mL-1的密度接種于96孔板中，在37 ℃及5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。試驗分為空白對照組、給藥組?？瞻讓φ战M加入完全培養(yǎng)基溶液（10%胎牛血清+ 1%鏈-青霉素+ 89%高糖DMEM 培養(yǎng)基）；給藥組分別加入0.5，1.0，2.0，4.0，5.0，8.0，16.0 mg/ mL 頭花蓼提取液和5，10，20，40，80，160，320，640 μmol/mL 左氧氟沙星溶液，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h 后，用MTS 法考察頭花蓼提取液和左氧氟沙星對Caco-2細胞的安全性。每個濃度平行6 個孔，重復(fù)操作3 次。結(jié)果見圖3?？梢?，頭花蓼提取液質(zhì)量濃度在0～1 mg/mL時對細胞存活率無顯著影響，>1 mg/mL時有一定影響。故選擇1 mg/mL作為給藥質(zhì)量濃度；左氧氟沙星質(zhì)量濃度在0～160 μmol/mL范圍時對細胞存活率無明顯影響，> 160 μmol/ mL 時有一定影響。故選擇160 μmol/mL作為給藥質(zhì)量濃度。

A. 頭花蓼提取液 B. 左氧氟沙星圖3 藥物對Caco-2細胞存活率的影響（± s，n=6）注：與0 mg/mL比較，*P < 0.01。圖4同。A.Polygonum capitatum extract solution B.LevofloxacinFig.3 Effect of drugs on survival rate of Caco-2 cells（±s，n=6）Note：Compared with 0 mg/mL，*P < 0.01（for Fig.3-4）.

2.4 細胞攝取試驗

取2.2項下模型細胞，用Hanks緩沖液（HBSS）洗去表面雜質(zhì)。實驗分為3 組，頭花蓼提取物組（A 組）加入1 mg / mL 頭花蓼提取液2 mL；左氧氟沙星給藥組（B 組）加入160 μmol/ mL 左氧氟沙星溶液2 mL；頭花蓼提取液與左氧氟沙星合用組（C 組）加入1 mg/mL 頭花蓼提取液和160 μmol/mL 左氧氟沙星溶液共2 mL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，取出，加入4 ℃超純水終止試驗，并快速用超純水清洗3遍細胞單分子層，最后每孔加入2 mL超純水。反復(fù)凍融裂解細胞，取出細胞，超聲處理10 min，得細胞懸液，按“2.1.2樣品處理方法”項處理，進樣分析并計算攝取量。另取10 μL的細胞懸液，采用BCA 法測定蛋白含量。攝取量= 藥物（mg）/ 蛋白（g）。結(jié)果見圖4?？梢?，左氧氟沙星與頭花蓼提取液合用后，左氧氟沙星的細胞攝取量為（3.903±0.394）μg / g顯著少于單用時的（5.895 ± 0.663）μg / g（P< 0.01）；頭花蓼提取液指標性成分沒食子酸和原兒茶酸合用后的細胞攝取量分別為（0.076±0.015）μg / g和（0.060±0.008）μg / g，少于單用時的（0.094 ± 0.022）μg / g 和（0.074±0.018）μg / g，但無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

藥物是基于細胞內(nèi)眾多特定靶點而設(shè)計的分子實體，必須通過多重生物屏障，與胞內(nèi)靶點結(jié)合，才能發(fā)揮效應(yīng)。傳統(tǒng)藥物代謝動力學(xué)僅以血藥濃度表征藥物作用濃度，不能完全反映真實的藥物效應(yīng)，故迫切需要將傳統(tǒng)、宏觀的藥物代謝動力學(xué)研究拓展到細胞/ 亞細胞水平行進入靶細胞的藥物代謝動力學(xué)研究。

A. 左氧氟沙星 B. 原兒茶酸 C. 沒食子酸圖4 左氧氟沙星與頭花蓼提取液聯(lián)用前后3種成分的細胞攝取量比較（± s，n=5）A.Levofloxacin B.Protocatechuic acid C.Gallic acidFig.4 Comparison of cell absorption of three compounds before and after levofloxacin combined with Polygonum capitatum extract solution（±s，n=5）

本研究中，頭花蓼提取液與左氧氟沙星合用后，左氧氟沙星在Caco-2細胞中的攝取量減少，而頭花蓼提取液中指標性成分沒食子酸和原兒茶酸在Caco - 2細胞中的攝取未受明顯影響。其原因可能為，化學(xué)藥物常具有明確的作用靶部位／靶點，而中藥重在調(diào)理機體的功能狀態(tài)，通過調(diào)控靶部位的生理狀態(tài)，創(chuàng)造更有利于化學(xué)藥物代謝處置、發(fā)揮藥效的微環(huán)境。左氧氟沙星為P 糖蛋白（P - gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等外排蛋白的底物［22-23］，頭花蓼提取液可能通過調(diào)控Caco - 2 細胞的生理狀態(tài)從而誘導(dǎo)了上述外排蛋白的活性，將左氧氟沙星從細胞中外排，降低了其在細胞內(nèi)的濃度。中藥發(fā)揮作用是多組分多靶點產(chǎn)生的協(xié)同效果，而化學(xué)藥具有明確的作用靶點，故左氧氟沙星不能顯著影響頭花蓼提取液的攝取。兩藥聯(lián)用的具體機制有待下一步研究證實。

綜上所述，頭花蓼提取液能顯著降低左氧氟沙星在Caco - 2 細胞中的吸收，而左氧氟沙星對頭花蓼提取液的吸收無影響。該研究可為兩藥的臨床使用提供參考。