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    藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證結果分析

    2022-04-27 02:15:30張煜琳李哲王建聲杜彥輝
    藥品評價 2022年3期
    關鍵詞:需氧菌無菌菌落

    張煜琳,李哲,王建聲,杜彥輝

    1.慶陽市藥品檢驗檢測中心,甘肅 慶陽 745000;2.慶陽市食品檢驗檢測中心,甘肅 慶陽 745000

    藥品檢驗檢測能力驗證是藥品質量技術監(jiān)管的重要手段,推動實施藥品檢驗檢測技術能力持續(xù)有效提升,更加體現(xiàn)權威性、可靠性、公正性,是藥品檢驗檢測工作高質量發(fā)展的永恒課題。本實驗組人員參加了2021 年由上海市食品藥品檢驗研究院負責實施的“NIFDC-PT-340 藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證”,按照預先制定的實驗方案和作業(yè)指導書,對3 份未知樣品進行檢測,結果為滿意。本研究以此為契機,準確考量影響實驗結果的人員、試劑、設施、環(huán)境等關鍵因素,全面回顧梳理實驗過程,對比分析全國實驗室數(shù)據(jù),重點總結本次實驗結果,為健全完善微生物檢驗內部質量控制管理體系[1-3]提供理論和實踐參考。

    1 實驗材料與試劑

    1.1 樣品

    樣品來源于上海市食品藥品檢驗研究院,編號QA03400502、QA03400327、QA03400657,為藥品制劑的冷凍干燥物,采用玻璃西林瓶密封包裝,瓶身貼有編號標識。收到樣品后立即放置-20 ℃保存,并盡快檢測。

    1.2 培養(yǎng)基及耗材

    胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,批號:20210412,海博生物;紅四氮唑(TTC),批號:20171101,天津大茂;一次性無菌培養(yǎng)皿,廣東環(huán)凱,規(guī)格:90 mm×15 mm;實驗用水均為無菌用水。

    1.3 儀器設備

    超凈工作臺(上海樹立)型號:SW-CJ-2D,生物安全柜(蘇州安泰)型號:BHC-1300IIA2,立式壓力滅菌器(山東新華)型號:LMQ.C-80E,電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊)型號:HPX-9162MBE。

    2 實驗方法

    2.1 檢測方法

    按照《中國藥典》2020 版四部通則1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計數(shù)法中需氧菌總數(shù)計數(shù)平皿法[4]和NIFDC-PT-340 藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證作業(yè)指導書的要求進行檢測。

    2.2 操作步驟

    2.2.1 樣品前處理 首先將樣品放至室溫,用75%乙醇擦拭瓶身,待平衡后,在生物安全柜內小心打開西林瓶蓋,向瓶內緩緩加入10 mL 滅菌用水,蓋好瓶蓋,將樣品完全溶解且混勻,作為待測供試品10 mL,室溫放置15 min 后操作。依照此方法處理3 份樣品。

    2.2.2 樣品稀釋 用移液管吸取上述待測供試品5 mL,置裝有45 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,充分振搖,混勻,制成1∶10 的樣品。吸取1 mL 該溶液置9 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,制成1∶100 的樣品,依次稀釋制備至1∶100 000。以此方法,處理3 份樣品。

    2.2.3 樣品培養(yǎng) 陰性對照:吸取1 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加入到無菌培養(yǎng)皿中;樣品:從各稀釋度取1 mL 加入無菌培養(yǎng)平皿中(平行兩份)。傾注培養(yǎng)基時溫度不超過45 ℃,按反時針方向勻速旋轉平皿,注意不要將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上,使混勻,等待凝固后,將平皿倒置在33 ℃恒溫培養(yǎng)箱內,培養(yǎng)3~5 d,觀察菌落情況。

    2.2.4 計數(shù)與報告 樣品QA03400502 平板上(1∶1 000 稀釋度)有片狀菌落且菌落之間沒有明顯界限,按1 個菌落計,樣品QA03400327 平板上(1∶100稀釋度)有2 個菌落重疊,肉眼能分辨,按2 個菌落計。其余均按平板上生長良好的菌落數(shù)計數(shù)按照《中國藥典》2020 年版四部通則及本次實驗作業(yè)指導書進行報告。

    3 實驗結果與分析

    3.1 樣品檢測結果

    樣品檢測結果及報告數(shù)見表1。相同稀釋度兩個平板的菌落總數(shù)非常相近,說明試驗平行性很好,結果準確。陰性對照試驗無菌落生長,說明試驗過程中無污染,試驗結果有效。對QA03400502 樣品選取1∶1 000 稀釋度進行報送,結果3.8×104cfu/mL。對QA03400327樣品選取1∶10和1∶100 稀釋度進行報送,結果1.6×103cfu/mL。QA03400657 樣品無菌落生長,結果按<10 cfu/mL報送。

    表1 樣品檢測結果(cfu/mL)

    3.2 能力驗證結果與分析

    本實驗室收到中國食品藥品檢定研究院能力驗證結果報告通知單,見表2。按照│z│≤2 為滿意結果,2<│z│≤3 為可疑結果,│z│>3 為不滿意結果,最終評價為三個樣品結果均滿意,則最終結果判定為“滿意”;有一個結果為“可疑”,則最終結果判定為“可疑”;有一個結果為“不滿意”,則最終結果判定為“不滿意”進行評價。從表中得知本實驗室最終結果為滿意。雖然QA03100657 的指定值<1,而本實驗室測定的結果是<10 cfu/mL,評價結果為滿意,但為了提高樣品檢出限,以后進行未知樣品的需氧菌總數(shù)計數(shù)檢驗時,應對供試品原液進行計數(shù)。

    表2 能力驗證評價表

    從中國食品藥品檢定研究院能力驗證結果計劃報告中獲悉,全國共223 家實驗室報送結果,按照每個實驗室z 值大小順序排列成柱狀圖,每個柱條對應唯一編碼的實驗室,本單位編碼為876。從圖1、圖2 中可直觀地反映出本實驗室測定的數(shù)據(jù)趨近準確值。實驗室具備很好檢測藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)的能力。

    圖1 樣品QA03400502能力評價統(tǒng)計圖

    圖2 樣品QA03400327能力評價統(tǒng)計圖

    3.3 需氧菌總數(shù)計數(shù)質量控制分析

    3.3.1 實驗前的準備控制 收到樣品,應及時檢查樣品是否完好、編號是否與能力驗證平臺顯示的樣品編號一致。若樣品存在破損或污染等情況,應及時與實施機構聯(lián)系處理。收樣后應立即單獨放置于-20 ℃保存,并盡快檢測。實驗用的培養(yǎng)基、吸管、毛巾、鑷子、剪刀等均需按要求滅菌,并進行滅菌效果驗證。為了防止高壓滅菌過程中稀釋液和培養(yǎng)基量的減少及減少傳遞過程中的污染,裝培養(yǎng)基和稀釋液的每支試管和三角瓶應用硅膠塞塞住后用牛皮紙單獨包扎。吸管在滅菌前,上端應塞入一小段棉花,可避免外界雜菌吹入管內或不慎將菌液吸出管外,造成污染。

    3.3.2 操作環(huán)境的控制 檢測環(huán)境不低于生產(chǎn)關鍵區(qū)環(huán)境的要求[5],所以在D 級背景下的B 級單向流空氣區(qū)域內進行。并且要嚴格按照無菌操作要求進行實驗,并做好個人安全防護。因樣品內可能含有致病菌,所以本次實驗在生物安全柜中進行。實驗前后要對實驗環(huán)境進行滅菌。

    3.3.3 樣品的制備及稀釋過程控制 實驗前先將樣品放至室溫,用75%的乙醇擦拭瓶蓋后,在生物安全柜內以無菌操作打開西林瓶,向瓶內緩緩加入10 mL 滅菌水,將樣品完全溶解并混勻,作為待測供試品(作業(yè)指導書明確規(guī)定),室溫放置15 min 后再進行后續(xù)稀釋操作。為了確保樣品稀釋的準確性,用無菌吸管吸取待測供試品5 mL,置盛有45 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基錐形瓶中,充分振搖,制成1∶10 的樣品溶液。參考《中國藥典》2020 年版四部藥品中需氧菌總數(shù)的控制限度,將3 份樣品均稀釋至10-5,每個稀釋級至少制備2 個平板。樣品的制備和稀釋過程中,菌液的均勻性很重要,因此每次稀釋前后,均要在混勻器上充分混勻?;靹蜻^程要注意控制力度,避免菌液飛濺,造成污染。為了提高樣品檢出限,應對供試品原液進行計數(shù)。

    3.3.4 培養(yǎng)基控制 實驗所使用培養(yǎng)基的pH 值、適用性檢查經(jīng)前期確認[6-7],確保所使用的培養(yǎng)基性能良好。培養(yǎng)基應臨用新配,配制后,微生物易增殖[8],應立即滅菌。滅菌后放入45~50 ℃的水浴中保溫,避免溫度過低或過高影響實驗結果。培養(yǎng)基傾注量應為15~20 mL,太少時在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基會干裂,太多則容易污染,影響計數(shù)。傾注培養(yǎng)基混勻時應注意防止混合物濺到皿邊及皿蓋上。培養(yǎng)皿應倒置培養(yǎng),既可防止培養(yǎng)過程中水分蒸發(fā)形成的冷凝水滴落到培養(yǎng)基上造成染菌,也可防止菌落蔓延造成計數(shù)不準。計數(shù)時,在瓊脂培養(yǎng)基中加入TTC,因TTC 的濃度過高會有抑菌作用[9],經(jīng)試驗,TTC 的使用濃度為0.01 g/L,即每1 000 mL 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中加入1 mL 無菌的1% TTC 溶液。

    3.3.5 計數(shù)觀察控制 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在培養(yǎng)2 d 后就應進行一次觀察計數(shù),以防菌落被覆蓋而影響計數(shù)結果。之后分別再培養(yǎng)3、4、5 d 各計數(shù)一次,查看菌落變化情況。必須注意計數(shù)應在超凈工作臺內進行,不要打開培養(yǎng)皿蓋子,輕拿輕放,防止自身及交叉污染。此次實驗中菌落計數(shù)時平板上有2 個菌落重疊,肉眼能分辨,按2 個菌落計。有片狀菌落且菌落之間沒有明顯界限,按1 個菌落計。

    3.3.6 廢棄物的處理控制 所有的實驗用具、含菌溶液或培養(yǎng)物均需經(jīng)過滅菌后洗滌或處理,保證生物安全,減少環(huán)境污染。

    3.3.7 結果上報控制 點計菌落數(shù)后,計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù),選取平均菌落數(shù)小于300 cfu的稀釋級,作為菌數(shù)報告依據(jù)。若同稀釋級兩個平板的菌落數(shù)平均值不小于15,則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。取最高的平均菌落數(shù),計算每1 mL 供試品中所含的需氧菌總數(shù),取兩位有效數(shù)字報告。若各稀釋級的平板上均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板上有菌落生長,但平均菌落數(shù)小于1 時,以小于1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。數(shù)據(jù)上傳到能力驗證平臺時應仔細核查校對,確保所填信息準確無誤,并在截止日期前按要求上報所有數(shù)據(jù)和記錄。

    4 總結

    根據(jù)能力驗證的結果反饋情況,說明了本實驗室具備藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力測定。能力驗證已逐漸成為實驗室技術能力和管理水平的考核方法,同時也成為重要且有效的實驗室外部質量控制評估手段。通過參加藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證,分析總結檢驗過程中的控制要點,能夠提升實驗室內部質量控制,進一步確保實驗室檢測結果的真實性、可靠性,同時強化政府監(jiān)管部門對實驗室水平的信任度,最終為人民用藥安全保駕護航。

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