柯氏無梗囊霉雙重培養(yǎng)體系的構(gòu)建1)

董芮豪 姚莉梅 向潤 江龍

(貴州大學(xué)，貴陽，550025)

叢枝菌根(AM)真菌是一種內(nèi)生菌根真菌，可與地球上80%以上的陸生維管植物互利共生[1-2]。叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)的菌絲侵入植物根部，在土壤中形成高度分枝的結(jié)構(gòu)和密集的菌絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[3]，從而增加養(yǎng)分吸收面積，為植物提供大量營養(yǎng)元素促進(jìn)植物生長[4-5]；宿主植物也為叢枝菌根真菌提供生長和發(fā)育的必要碳源[6]。已有研究表明，叢枝菌根真菌可作為天然菌肥和生防制劑[7]，具有促進(jìn)植物對土壤礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收[8]、增強(qiáng)植物抗逆性和抗病性[9-10]、改善土壤結(jié)構(gòu)[11-12]、修復(fù)土壤中的重金屬污染[13-14]等功能；在林業(yè)生產(chǎn)中，特別對培育菌根化苗木，有廣泛的應(yīng)用前景。因此，開展叢枝菌根真菌的生物學(xué)研究，實(shí)現(xiàn)叢枝菌根真菌規(guī)?；a(chǎn)純凈菌劑，是叢枝菌根真菌的重要研究方向[15]。

由于叢枝菌根真菌專性共生的特點(diǎn)，必須依靠寄主植物完成生命周期，這極大地限制了叢枝菌根真菌接種劑的規(guī)?；a(chǎn)[16-17]。為了建立一個(gè)以叢枝菌根真菌為基礎(chǔ)的可持續(xù)產(chǎn)業(yè)，生產(chǎn)大量、純凈的無污染孢子，已經(jīng)開發(fā)了許多技術(shù)研究叢枝菌根真菌的培養(yǎng)，傳統(tǒng)方法包括盆栽法、霧化法、水培法、玻璃珠分室法、叢枝菌根真菌無宿主培養(yǎng)法[18-22]；但是，這些方法在高質(zhì)量接種物生產(chǎn)方面有很大局限性。因此，叢枝菌根真菌培養(yǎng)的主流方法，是利用植物Ri T-DNA轉(zhuǎn)化根作為宿主，接種叢枝菌根真菌孢子，在人工培養(yǎng)基上建立叢枝菌根真菌-Ri T-DNA轉(zhuǎn)化根雙重培養(yǎng)體系，既能在最短的時(shí)間內(nèi)獲得大量、純凈的孢子繁殖體，又能清晰觀察到叢枝菌根真菌完整生活周期，是解決叢枝菌根真菌純培養(yǎng)、菌劑規(guī)?；a(chǎn)最有效的方法[23-24]。目前，雙重培養(yǎng)體系已經(jīng)在馬鈴薯[25]、胡蘿卜[26]、大豆[27-28]、亞麻[29]、紫云英[30]、番茄[31]等植物中成功建立。

叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)是建立雙重培養(yǎng)重要因素之一。在離體條件下，叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)受多種因素的影響，如消毒處理、培養(yǎng)基成分、激素、pH、溫度、孢子密度、孢子自身分泌的抑制物等因素[32]。叢枝菌根真菌表面消毒的傳統(tǒng)方法，是結(jié)合常用消毒劑(如氯胺(T)、吐溫20、硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素等)對孢子進(jìn)行消毒[33]；而在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)效果并不穩(wěn)定，這也是叢枝菌根真菌離體雙重培養(yǎng)重要的難題之一。有研究表明：水瓊脂培養(yǎng)基更有利于叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)，當(dāng)培養(yǎng)基pH<5.5或者pH>8.0時(shí)孢子萌發(fā)率顯著下降，而培養(yǎng)基在pH為6.5環(huán)境中孢子萌發(fā)效果最好[34]；通過加入促進(jìn)孢子萌發(fā)的激素獨(dú)腳金內(nèi)酯(GR24)、精胺(SPM)，能明顯促進(jìn)叢枝菌根真菌孢子的萌發(fā)，但是濃度過高或過低都會降低孢子的萌發(fā)率[35-36]。因此，篩選出孢子萌發(fā)的最適條件，是建立叢枝菌根真菌雙重培養(yǎng)的前提。目前，關(guān)于柯氏無梗囊霉(Acaulosporakoskei)雙重培養(yǎng)的研究較少，為此，本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)C58C1誘導(dǎo)煙草Va116子葉產(chǎn)生毛狀根，與柯氏無梗囊霉成功建立離體雙重培養(yǎng)體系，并產(chǎn)生了新生孢子；本研究結(jié)果，可為叢枝菌根真菌的生理學(xué)、遺傳學(xué)以及叢枝菌根真菌與植物共生分子機(jī)制等方面的研究提供參考，也可為叢枝菌根真菌規(guī)模化生產(chǎn)純凈菌劑提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)菌株為C58C1、煙草品種為Va116，保存于貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。叢枝菌根(AM)真菌菌株，從貴州省梵凈山自然保護(hù)區(qū)土壤中分離獲得的柯氏無梗囊霉(Acaulosporakoskei)。

抗生素：利福平(Rif)、乙酰丁香酮(AS)、特美汀(Tim)、頭孢噻肟(Cef)、氯胺(T)、吐溫20、獨(dú)腳金內(nèi)酯(GR24)、精胺(SPM)、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素，購自北京索萊寶生物公司。

1.2 煙草Va116毛狀根誘導(dǎo)

煙草Va116無菌苗的獲得：先將煙草Va116種子用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒1 min、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的次氯酸鈉消毒15 min，每一步都在無菌水中漂洗3～5次；然后將種子放于Murashige-Skoog(MS)固體培養(yǎng)基上，于25 ℃、14 h/d、光強(qiáng)2 000 lx下培養(yǎng)獲得無菌苗。

發(fā)根農(nóng)桿菌侵染液制備：將發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1在利福平質(zhì)量濃度為100 mg/L的抗性YEP(質(zhì)量濃度為5 g/L的NaCl+質(zhì)量濃度為10 g/L的蛋白胨粉末+質(zhì)量濃度為10 g/L的酵母提取物)培養(yǎng)基活化2次后，當(dāng)菌液在600 nm處的吸光值為0.6～0.8時(shí)，3 000 r/min離心10 min，將底部沉淀移入MS液體培養(yǎng)基中，加入乙酰丁香酮，混勻后，制成濃度為100 mmol/L的侵染液。

毛狀根的誘導(dǎo)：取煙草Va116無菌苗幼嫩葉片，切成約2 cm×2 cm，每皿10片，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，于固體MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3 d，在侵染液中浸泡8～10 min，放入共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基(MS+濃度為100 mmol/L的乙酰丁香酮)，25 ℃暗培養(yǎng)3 d；接著將葉片轉(zhuǎn)移到抑菌固體培養(yǎng)基(MS+質(zhì)量濃度為500 mg/L的頭孢噻肟+質(zhì)量濃度為500 mg/L的特美汀)，pH為6.0，每5～7d轉(zhuǎn)移1次，記錄每次轉(zhuǎn)移的數(shù)據(jù)，并在20 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。待葉片邊緣長出毛狀根后，距葉片1 cm處，將毛狀根切成長度約3 cm的根段，轉(zhuǎn)移到除菌固體培養(yǎng)基(0.5倍MS+質(zhì)量濃度為500 mg/L的頭孢噻肟+質(zhì)量濃度為500 mg/L的特美汀)，pH為6.0，每5～7 d轉(zhuǎn)移1次，直至農(nóng)桿菌除干凈，轉(zhuǎn)入不含任何激素或抗生素的0.5倍MS培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

rolB基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測：用北京擎科生物科技有限公司提供的試劑盒，提取毛狀根總DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系(10 μL)——DNA聚合酶(Premix Ex Taq)為5 μL、正反引物各0.5 μL、模板0.5 μL、超純水3.5 μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件——95 ℃預(yù)變性3 min、95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.3 叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)條件的優(yōu)化

叢枝菌根真菌孢子表面消毒：柯氏無梗囊霉孢子采用濕篩傾注-蔗糖離心法，從土壤中分離[37]。消毒液A的配制——質(zhì)量濃度為20 g/L的氯胺(T)，每0.1 L加2滴吐溫20，混勻后用0.22 μm孔徑濾膜過濾。消毒液B的配制——質(zhì)量濃度為200 mg/L的硫酸鏈霉素+質(zhì)量濃度為100 mg/L的硫酸慶大霉素，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。孢子消毒方?——在A液中浸泡10 min，無菌水沖洗3～5次后，轉(zhuǎn)入B液中處理10 min；孢子消毒方法2——先在體積分?jǐn)?shù)75%的酒精中浸泡1 min，重復(fù)方法1的操作。

不同pH時(shí)孢子萌發(fā)數(shù)量統(tǒng)計(jì)方法：將消毒的孢子放在pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的水瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂質(zhì)量濃度為8 g/L)，4 ℃低溫處理7 d后放入25 ℃恒溫培養(yǎng)，每皿放置20個(gè)孢子，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，20 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

不同質(zhì)量濃度獨(dú)腳金內(nèi)酯處理時(shí)孢子萌發(fā)數(shù)量統(tǒng)計(jì)方法：配制不同質(zhì)量濃度(0、150、450、750、1 050 pg/L)獨(dú)腳金內(nèi)酯(GR24)的水瓊脂培養(yǎng)基(pH=6.0)，加入消毒的孢子，4 ℃低溫處理7 d后，放入恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃暗培養(yǎng)，每皿放置20個(gè)孢子，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，20 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

不同質(zhì)量濃度精胺處理時(shí)孢子萌發(fā)數(shù)量統(tǒng)計(jì)方法：配制不同質(zhì)量濃度(0、40、80、120、160 mg/L)精胺的水瓊脂培養(yǎng)基(pH=6.0)，加入消毒的孢子，4 ℃低溫處理7 d后，放入恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃暗培養(yǎng)，每皿放置20個(gè)孢子，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，20 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.4 柯氏無梗囊霉-煙草Va116毛狀根雙重培養(yǎng)體系的建立

叢枝菌根真菌接種和培養(yǎng)：將長勢好的煙草Va116毛狀根分別接入Modified Strullu-Romand(MSR)培養(yǎng)基、0.5倍MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，孢子消毒后，先接種于水瓊脂培養(yǎng)基中萌發(fā)，觀察并標(biāo)記孢子萌發(fā)的方向，然后將帶有孢子的培養(yǎng)基挖出，移入到預(yù)培養(yǎng)的毛狀根附近，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃倒置培養(yǎng)。

菌根侵染方法：毛狀根的菌根染色，主要參照文獻(xiàn)[38]的方法進(jìn)行染色觀察。

1.5 數(shù)據(jù)處理

毛狀根誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生毛狀根的外植體數(shù)量/外植體總數(shù)量)×100%；

孢子萌發(fā)率=(孢子萌發(fā)數(shù)/接種孢子總數(shù))×100%；

孢子污染率=(孢子污染數(shù)/接種孢子總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草Va116毛狀根的獲得

煙草Va116種子用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒1 min、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的次氯酸鈉消毒15 min，獲得無菌苗(見圖1A)；發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1菌液在600 nm處的吸光值為0.6～0.8、侵染時(shí)間為8～10 min，共培養(yǎng)3 d(見圖1B)，轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基2次后，葉片邊緣出現(xiàn)毛狀根(見圖1C、D)，其毛狀根的誘導(dǎo)率為53.33%。毛狀根經(jīng)過3次的除菌培養(yǎng)后，在無任何激素的0.5倍MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)(見圖1E)，30 d時(shí)毛狀根生長迅速可長滿整個(gè)培養(yǎng)皿(見圖1F)。新生毛狀根具有大量的白色根毛和眾多的分枝，向上或沿培養(yǎng)基生長，無向地性等特征，從形態(tài)學(xué)角度確定煙草毛狀根誘導(dǎo)成功。在分子水平上對煙草Va116毛狀根進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢驗(yàn)，由圖2可見：毛狀根的總DNA中擴(kuò)增出了預(yù)期的rolB基因的特異性條帶741 bp，該條帶和陽性對照發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1擴(kuò)增出的條帶相同，而未轉(zhuǎn)化的則沒有擴(kuò)出。從分子水平上說明，發(fā)根農(nóng)桿菌的T-DNA已經(jīng)整合到了煙草Va116毛狀根基因組中。

2.2 孢子萌發(fā)優(yōu)化培養(yǎng)

2.2.1不同消毒方法對叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)率和污染率的影響

為獲得純凈無污染的孢子建立共生體系，根據(jù)孢子萌發(fā)率和污染率，比較了2種不同消毒方法的消毒效果(見表1)。由表1可見：方法1，污染率較高，20 d時(shí)孢子萌發(fā)率為36.67%、污染率為23.33%；方法2，孢子萌發(fā)效果好，且污染率低，20 d時(shí)孢子萌發(fā)率可達(dá)48.33%、污染率僅為6.67%；兩者之間的差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。由此可知，方法2的消毒效果較好，添加體積分?jǐn)?shù)75%的酒精可明顯降低孢子的污染率，且萌發(fā)率比方法1高1.3倍。

2.2.2 不同pH對叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)的影響

將已消毒的孢子分別接種在pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的水瓊脂培養(yǎng)基中，孢子在pH為6.0的水瓊脂上萌發(fā)率最高(為48.34%)，顯著高于其他pH的培養(yǎng)基(P<0.05)。pH>6.5時(shí)會抑制孢子的萌發(fā)；pH為7.0、7.5時(shí)，孢子萌發(fā)率分別為21.67%、18.34%(見表2)。

2.2.3 獨(dú)腳金內(nèi)酯對叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)的影響

為了提高孢子萌發(fā)率，通過加入獨(dú)腳金內(nèi)酯促進(jìn)孢子萌發(fā)(見表3)。由表3可見：獨(dú)腳金內(nèi)酯質(zhì)量濃度在0～450 pg/L之間，促進(jìn)了孢子萌發(fā)，質(zhì)量濃度在450 pg/L時(shí)萌發(fā)率達(dá)到最高值(為61.67%)，顯著高于其他質(zhì)量濃度(P<0.05)；質(zhì)量濃度大于450 pg/L時(shí)，隨質(zhì)量濃度的增加，抑制了孢子的萌發(fā)。

2.2.4 精胺對叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)的影響

由表4可見：不同質(zhì)量濃度的精胺對孢子萌發(fā)有顯著影響。精胺質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)萌發(fā)率最高(為58.34%)，顯著高于其他質(zhì)量濃度的(P<0.05)；隨著質(zhì)量濃度的提高，孢子萌發(fā)率不斷降低，且低于對照組的萌發(fā)率，說明精胺質(zhì)量濃度>40 mg/L時(shí)均對孢子萌發(fā)起到抑制作用。

2.3 煙草Va116毛狀根與柯氏無梗囊霉雙重培養(yǎng)

將萌發(fā)的孢子放入MSR培養(yǎng)基中的煙草Va116毛狀根附近(見圖3A)；培養(yǎng)15 d后，孢子的菌絲逐漸伸長，與毛狀根接觸，形成多級分枝；30 d左右，在毛狀根周圍形成菌絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(見圖3B)，在根的表皮上形成入侵點(diǎn)(見圖3C)，并且一些分支的菌絲逐漸變得膨大，形成菌絲圈(見圖3D)；直到45 d時(shí)，首次長出新生孢子，新形成的孢子最初呈乳白色，直徑為20～40 μm(見圖3E～H)。繼續(xù)觀察，孢子逐漸成熟，成熟時(shí)孢子的壁也慢慢變厚，直徑40～60 μm，此時(shí)孢子為棕黑色(見圖3I)。

采用臺盼藍(lán)染液對侵染的根段進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察到孢子的菌絲接觸根的表皮形成入侵點(diǎn)(見圖4A)，菌絲從根表皮入侵到皮層內(nèi)形成大量的根內(nèi)菌絲(見圖4B～E)，并且還觀察到泡囊結(jié)構(gòu)的形成(見圖4F)。由此可見，煙草Va116離體毛狀根，能作為宿主為柯氏無梗囊霉孢子提供營養(yǎng)，使其完成整個(gè)生命周期。

培養(yǎng)基的成分，對孢子萌發(fā)和雙重培養(yǎng)的建立有直接影響。將萌發(fā)的孢子分別接入0.5倍MS、MSR培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)MSR培養(yǎng)基中孢子10 d就能與毛狀根接觸，在0.5倍MS培養(yǎng)基中孢子萌發(fā)比較慢，導(dǎo)致萌發(fā)的菌絲還未接觸到毛狀根就停止生長。0.5倍MS培養(yǎng)基中，柯氏無梗囊霉不能與煙草Va116毛狀根建立雙重培養(yǎng)。

3 討論

本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1誘導(dǎo)煙草Va116毛狀根，建立了穩(wěn)定的煙草毛狀根體系，獲得了大量的毛狀根，與柯氏無梗囊霉首次建立雙重培養(yǎng)體系，并成功產(chǎn)孢。毛狀根的誘導(dǎo)，是通過發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞，使其Ri T-DNA整合到植物基因組中；除菌培養(yǎng)，是誘導(dǎo)毛狀根最關(guān)鍵的步驟，在除菌過程中需要定期更換培養(yǎng)基，否則，農(nóng)桿菌復(fù)發(fā)會使毛狀根致死[39]。離體雙重培養(yǎng)的前提，是獲得大量的毛狀根，以毛狀根作為宿主，生長狀況不良可直接影響叢枝菌根真菌孢子的發(fā)育。而發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的毛狀根，不僅在無激素培養(yǎng)基上迅速生長，而且能保持良好的遺傳穩(wěn)定性，為叢枝菌根真菌的接種和雙重培養(yǎng)提供了大量宿主材料[40]。

A為臺盼藍(lán)染色顯示柯氏無梗囊霉孢子菌絲侵入毛狀根；B～E為根內(nèi)菌絲的形成；F為囊泡結(jié)構(gòu)的形成。

孢子消毒，是實(shí)現(xiàn)高效體外培養(yǎng)的最關(guān)鍵步驟。孢子消毒的以往研究中，球狀巨孢囊霉(Gigasporamargarita)孢子用質(zhì)量濃度為50 g/L的氯胺(T)+質(zhì)量濃度為400 mg/L的鏈霉素+2滴吐溫20，進(jìn)行消毒，孢子萌發(fā)率為72%、污染率為10%[33]；摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)孢子用質(zhì)量濃度為20 g/L的氯胺(T)+2滴吐溫20、質(zhì)量濃度為100 mg/L的硫酸慶大霉素+質(zhì)量濃度為200 mg/L的硫酸鏈霉素消毒，孢子萌發(fā)率為48.88%、污染率為9.98%[26]。因此，本研究在已有研究的基礎(chǔ)上對消毒方法做了改進(jìn)，先用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡1 min，再結(jié)合常用消毒劑處理孢子，既提高了孢子萌發(fā)率，最高可達(dá)48.34%，又降低了孢子污染率，僅為6.67%，這為叢枝菌根真菌孢子消毒提供了可行的方法。

在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)影響雙重培養(yǎng)體系的因素很多，如毛狀根生長狀況、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度、外源物質(zhì)等[41]。Raj et al.[42]利用胡蘿卜毛狀根與異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)在MSR培養(yǎng)基中產(chǎn)生了大量孢子；Costa et al.[43]利用胡蘿卜毛狀根與易誤巨孢囊霉(Gigasporadecipiens)、明根孢囊霉(Rhizophagusclarus)進(jìn)行雙重培養(yǎng)，易誤巨孢囊霉孢子培養(yǎng)基最適pH為6.5、培養(yǎng)溫度為26.5 ℃時(shí)，孢子產(chǎn)量最高；而明根孢囊霉培養(yǎng)基最適pH為4.0、培養(yǎng)溫度為26.7 ℃時(shí)，孢子產(chǎn)量最高。Becard et al.[44]通過在培養(yǎng)基中加入一些外源激素，可促進(jìn)叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)。本研究采用的孢子培養(yǎng)基為MSR培養(yǎng)基，pH為6.0，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，成功建立雙重培養(yǎng)體系，產(chǎn)生了新生孢子。經(jīng)過4個(gè)月的培養(yǎng)，孢子菌絲形成多級分支分布于整個(gè)生長空間，其中最長的菌絲約為4 048 μm，每條菌絲上都有菌絲圈，并且產(chǎn)生孢子的菌絲都是以主干菌絲分支成二分叉結(jié)構(gòu)，尤其在根段周圍菌絲的分支更多；可能是因?yàn)槊珷罡浇阪咦雍蜔煵軻a116毛狀根之間養(yǎng)分的相互運(yùn)輸，促進(jìn)了菌絲的生長，這與已有研究的結(jié)果[31]相似。不同的接種方法，對柯氏無梗囊霉建立共生體系具有很大的影響。將消毒后的柯氏無梗囊霉孢子直接接種于煙草Va116毛狀根附近，在觀察過程中發(fā)現(xiàn)，孢子萌發(fā)的菌絲背離毛狀根生長，使得菌絲侵染毛狀根的時(shí)間延長，且大部分菌絲還未接觸到毛狀根就停止生長，這與已有研究結(jié)果[26]相似。但是，將孢子消毒后先放入水瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)后，標(biāo)記孢子萌發(fā)方向，將菌絲生長方向正向接到毛狀根附近，提高了菌絲和毛狀根的接觸率，縮短了孢子菌絲侵入毛狀根時(shí)間，這與李欣欣等[28]研究結(jié)果相似。

綜上所述，使用消毒方法2，水瓊脂培養(yǎng)基pH為6.0、獨(dú)腳金內(nèi)酯質(zhì)量濃度為450 pg/L、精胺質(zhì)量濃度為40 mg/L，叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)率最高。將萌發(fā)的孢子放入MSR培養(yǎng)基中與煙草Va116毛狀根共培養(yǎng)，首次建立了柯氏無梗囊霉孢子雙重培養(yǎng)體系，為叢枝菌根真菌菌劑的生產(chǎn)開辟了一條新的途徑，也為進(jìn)一步研究菌根的生理生化特性提供了可行的試驗(yàn)方法。