小麥莖基腐病病原鑒定及其對(duì)殺菌劑的敏感性測(cè)定

李月嬌 孫淑琴 霍建飛 馬浩軒 史碩 楊秀榮 李亮

摘要：為了解天津小麥莖基腐病的發(fā)生情況，本試驗(yàn)分別在天津市薊州區(qū)、寶坻區(qū)、武清區(qū)、靜海區(qū)和北辰區(qū)5個(gè)小麥主栽區(qū)采集莖基腐病害樣品33份，分離真菌菌株204個(gè)。經(jīng)致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)觀察及對(duì)rDNAITS的分子檢測(cè)，最終確定為5類病原菌，分別為小麥根腐離蠕孢（Bipolarissorkiniana）、假禾谷鐮刀菌（紫紅色、黃色，F(xiàn)usariumpseudograminearum）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）和木賊鐮刀菌（F.equiseti），優(yōu)勢(shì)菌株為假禾谷鐮刀菌，占分離病原菌總數(shù)的74.5%。5類病原菌對(duì)8種殺菌劑的敏感性測(cè)定結(jié)果表明，咯菌腈、丙硫菌唑和咪鮮胺對(duì)蠕孢菌的抑制效果最好，咯菌腈、咪鮮胺和多菌靈對(duì)鐮刀菌的抑制效果最好。

關(guān)鍵詞：小麥莖基腐病;分離與鑒定;殺菌劑;敏感性測(cè)定

小麥?zhǔn)俏覈?guó)三大主要糧食作物之一，年產(chǎn)量約占主要糧食作物總產(chǎn)量的20%[1]。近年來(lái)，由于氣候變暖、秸稈還田導(dǎo)致的土壤中病原菌的積累，以及耕作制度演變等諸多因素的影響，小麥莖基腐?。╳heatcrownrot）的發(fā)生與危害不斷加重和蔓延[2，3]。小麥莖基腐病可造成小麥減產(chǎn)約35%，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致部分田塊絕收，威脅小麥的生產(chǎn)[4-6]。

小麥莖基腐病是一種由多種病原菌復(fù)合侵染引起的土傳性真菌病害，在小麥的各個(gè)生育期均可發(fā)生[2，7-9]。在中國(guó)，由陳厚德于1996年首次報(bào)道該病害在江蘇省發(fā)生，隨后河南、河北、山東、安徽和陜西等小麥主產(chǎn)區(qū)也報(bào)道小麥莖基腐病的發(fā)生，對(duì)我國(guó)小麥種植業(yè)造成極大影響[8，10-14]。小麥莖基腐病至少可由16種以上的鐮刀菌侵染引起，已報(bào)道致病菌有禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum）、假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum）、木賊鐮刀菌（F.equiseti）、三線鐮刀菌（F.tricinctum）和層出鐮刀菌（F.proliferatum）。其中假禾谷鐮刀菌在中國(guó)黃淮和西北地區(qū)被報(bào)道為引起小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)菌株，其田間發(fā)病率可達(dá)70%[8，9，15-17]。此外，小麥根腐離蠕孢（Bipolarissorkiniana）也是導(dǎo)致小麥莖基部變褐的主要病原菌之一[18]。

天津市小麥年栽培面積在10～12萬(wàn)公頃之間，主要集中在武清區(qū)、寶坻區(qū)、靜海區(qū)、薊州區(qū)和北辰區(qū)。據(jù)調(diào)查，近年來(lái)天津市小麥莖基腐病發(fā)生普遍，嚴(yán)重地塊引起死苗、死蘗，減產(chǎn)30%以上。為了明確天津地區(qū)小麥莖基腐病的病原菌組成及優(yōu)勢(shì)菌株，本試驗(yàn)開(kāi)展了病原菌的分離、致病力測(cè)定、rDNA-ITS的分子鑒定等研究，結(jié)合形態(tài)特征，鑒定得到5類病原菌，優(yōu)勢(shì)菌株為假禾谷鐮刀菌。此外，小麥莖基腐病在小麥各個(gè)生育期均可發(fā)病，目前尚未選育出能有效抵抗該病害的小麥品種，當(dāng)前對(duì)該病害仍以化學(xué)藥劑防控為主[15，19-21]。因此本試驗(yàn)采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了5類病原真菌對(duì)8種殺菌劑的敏感性，以期為小麥莖基腐病的高效防治提供參考。

1材料與方法

1.1小麥莖基腐病害樣品采集

自天津市薊州區(qū)、寶坻區(qū)、靜海區(qū)、武清區(qū)、北辰區(qū)5個(gè)小麥種植區(qū)共采集33份小麥莖基腐病病害樣品。

1.2病原菌的分離

采用組織分離法[22]：首先用無(wú)菌水將小麥病株根莖部沖洗干凈，吸干水分后將病健交界處組織剪成長(zhǎng)寬約為4mm的小塊，采用5%次氯酸鈉溶液對(duì)病塊組織表面消毒3min，隨后用無(wú)菌水漂洗，置于滅菌濾紙上晾干后轉(zhuǎn)移至PSA平板，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

1.3致病力測(cè)定

以小麥“津農(nóng)6號(hào)”為測(cè)試材料，剪下植株同一部位葉片，用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，并將葉片分成兩組，一組用滅菌牙簽刺穿葉片后將5mm菌餅貼于傷口處，另一組直接將菌餅緊貼于小麥葉片上，每組重復(fù)3次，每重復(fù)3片葉，將其放置于25℃、濕度100%的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)48h后調(diào)查發(fā)病情況。

1.4病原菌分子鑒定

將分離菌株在PSA平板培養(yǎng)3d后，刮取少量菌絲，采用擎科生物科技有限公司生產(chǎn)的2×T5DirectPCRKit進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用通用引物ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）擴(kuò)增目標(biāo)片段[23]，擴(kuò)增體系：模板DNA2μL，引物（10μmol/L）各2μL，2×T5DirectPCRMix25μL，ddH2O補(bǔ)足至50μL。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性3min;98℃變性10s，61℃退火10s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min，4℃保存。隨后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并將電泳后有明顯單一條帶的PCR產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI基因庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定病原菌種類。采用軟件MEGA5.05進(jìn)行ClustalW比對(duì)，以鄰近相接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[24]。

1.5化學(xué)藥劑

針對(duì)鐮刀菌及蠕孢菌兩大類病原菌，選擇目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用的8種化學(xué)藥劑：97.2%戊唑醇原藥（天津市華宇農(nóng)藥有限公司）、96.0%苯醚甲環(huán)唑原藥（一帆生物科技集團(tuán)有限公司）、97.0%咪鮮胺原藥（武漢能仁醫(yī)藥化工有限公司）、98.0%惡霉靈原藥（天津市綠亨化工有限公司）、97.0%多菌靈原藥（湖北萬(wàn)業(yè)醫(yī)藥有限公司）、95.0%福美雙原藥（河北冠龍農(nóng)化有限公司）、97.0%丙硫菌唑原藥（天津市華宇農(nóng)藥有限公司）、95.0%咯菌腈原藥（瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）。

1.6毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定。分別準(zhǔn)確稱取以上化學(xué)藥劑原藥，每種原藥加入1mL丙酮和10μL吐溫80溶解，加入無(wú)菌水配成母液。將計(jì)算好的一定量（根據(jù)預(yù)試驗(yàn)得出的抑菌率為10%～80%時(shí)的藥劑濃度范圍）的藥劑加入50℃左右的PSA培養(yǎng)基中，充分振蕩混勻后，傾入直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度重復(fù)3～4次，以加無(wú)菌水的平板為空白對(duì)照。用接種針將待測(cè)菌株的菌餅分別移入不同濃度的含藥培養(yǎng)基平板上，正面向下（每皿一餅），置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后調(diào)查菌落直徑。以藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為X，抑菌率的機(jī)率值為Y，求出藥劑的毒力回歸方程Y=a+bX和相關(guān)系數(shù)，并計(jì)算有效中濃度EC50值。

2結(jié)果與分析

2.1小麥莖基腐病田間癥狀

于2021年4月25日小麥分蘗期和6月9日小麥灌漿期自天津市薊州區(qū)、寶坻區(qū)、靜海區(qū)、武清區(qū)、北辰區(qū)5個(gè)小麥種植區(qū)，共采集小麥莖基腐病害樣品33份。病株癥狀如圖1所示，苗期癥狀：葉片變黃，植株莖基部1～2節(jié)變褐;成熟期癥狀：白穗，莖節(jié)或根部變褐，早衰死亡。

2.2小麥莖基腐病病原菌分離結(jié)果

33份小麥莖基腐病害樣本中共分離到204株病原真菌。根據(jù)菌落顏色、生長(zhǎng)速度和孢子形態(tài)等指標(biāo)將204株病原菌歸類為A、B、C、D、E五類菌群。如表1所示，B類菌株的檢出率最高，共分離出102株，分離頻率為50.0%;C類和A類菌株次之，分別得到50株和44株，分離頻率分別為24.5%和21.6%;D類和E類菌株的檢出率較低，分別分離到6株和2株，占分離病原菌總數(shù)的2.9%和1.0%。A類菌株主要分布在北辰區(qū)，極少數(shù)來(lái)源于薊州區(qū)和寶坻區(qū);B類菌株在天津市5個(gè)區(qū)均有分布;C類菌株除北辰區(qū)和靜海區(qū)外，其余3個(gè)區(qū)均有分布;D類菌株在薊州區(qū)、寶坻區(qū)和北辰區(qū)有分布;E類菌株僅在寶坻區(qū)分離到。以上結(jié)果表明引起天津小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)致病菌為B類菌株，且該菌株在5個(gè)區(qū)均有分布。

2.3病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

A類菌株：在PSA平板上產(chǎn)生白色氣生菌絲，較繁茂，菌落顏色隨培養(yǎng)天數(shù)的增加逐漸加深，直至呈灰綠色或黑綠色。分生孢子長(zhǎng)橢圓形或長(zhǎng)梭形，直或彎曲，黑褐色，有分隔，以5～7隔居多。初步鑒定，該菌株為小麥根腐離蠕孢（Bipolarissorokiniana），屬半知菌亞門離蠕孢屬真菌（圖2A）。

B類菌株：在PSA平板上產(chǎn)生大量白色絮狀氣生菌絲，菌落背面成紫紅色，隨培養(yǎng)天數(shù)的增加顏色逐漸加深。大型分生孢子呈鐮刀形，頂胞較尖呈鳥嘴狀，3～7個(gè)隔膜，3個(gè)隔膜居多，分隔明顯（圖2B）。

C類菌株：在PSA平板上產(chǎn)生大量白色絮狀氣生菌絲，菌落背面成黃色，隨培養(yǎng)天數(shù)的增加顏色逐漸加深。大型分生孢子呈鐮刀形，頂胞較尖呈鳥嘴狀，3～7個(gè)隔膜，3個(gè)隔膜居多，分隔明顯（圖2C）。

D類菌株：在PSA平板上產(chǎn)生短羊毛狀氣生菌絲，菌落呈紫紅色，后期菌落正面長(zhǎng)有少部分黃色菌絲并呈環(huán)狀分布，背面呈深紫紅色。大型分生孢子細(xì)長(zhǎng)且直，呈線形，1～3個(gè)隔膜（圖2D）

E類菌株：在PSA平板上產(chǎn)生致密平坦的絮狀氣生菌絲，菌落初期為白色至粉色，后逐漸變?yōu)橥咙S色。大型分生孢子呈鐮刀狀，細(xì)長(zhǎng)彎曲，頂細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)且基細(xì)胞足跟比較明顯，3～7個(gè)隔膜（圖2E）。

2.4致病力測(cè)定

病原菌對(duì)小麥葉片的侵染結(jié)果如圖3所示，5種真菌對(duì)小麥葉片均具有致病力。病原菌A在有傷口的情況下可快速侵染小麥葉片組織并蔓延，而在沒(méi)有傷口時(shí)，未見(jiàn)有明顯侵染，表明傷口對(duì)其侵染起重要作用;病原菌B、C、D和E有無(wú)傷口對(duì)其侵染無(wú)明顯影響，濕度較大時(shí)均能成功侵染并蔓延生長(zhǎng)，尤其是B和C菌株生長(zhǎng)速度極快，引起小麥葉片組織的黃化和腐爛;菌株D的致病性較弱（圖3）。

將接種發(fā)病的小麥組織表面消毒后，重新在PSA平板上進(jìn)行病原菌分離，均分離到對(duì)應(yīng)的接種病原菌，表明分離到的5種真菌均為致病菌。

2.5病原菌分子生物學(xué)鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

基于形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，初步鑒定菌株B、C、D和E屬于鐮刀菌屬。為進(jìn)一步明確上述4種病原菌，對(duì)菌株B～E的rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果（圖4）顯示，4株菌的PCR產(chǎn)物在500～750bp之間均有一條明亮且單一的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示菌株B～E擴(kuò)增片段大小分別為581、586、610、597bp。將測(cè)序結(jié)果與NCBI基因庫(kù)中已發(fā)表的鐮刀菌rDNA-ITS序列進(jìn)行比對(duì)，菌株B和C的rDNA-ITS序列與已報(bào)道的假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum，ID：MH333075）序列高度相似，相似性分別為99.28%和99.10%;菌株D為燕麥鐮刀菌（F.avenaceum，ID：KT963799），其rDNAITS序列與已報(bào)到的序列相似性為99.32%;菌株E為木賊鐮刀菌（F.equiseti，ID：MH054915），其序列相似性達(dá)99.47%。

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）可知，4株致病菌聚為兩個(gè)大的分支，MH681156等13個(gè)序列與菌株B、C和E的序列聚在一起，KT963799等9個(gè)序列與菌株D的序列聚為另一個(gè)分支。菌株B和C與假禾谷鐮刀菌的序列以98%的支持率聚在一起，菌株D與燕麥鐮刀菌以97%的支持率匯聚為一個(gè)子分支，菌株E與木賊鐮刀菌以99%的支持率匯聚為一個(gè)子分支。

2.6化學(xué)藥劑的毒力測(cè)定

由表2可知，針對(duì)小麥根腐離蠕孢菌，多菌靈和惡霉靈的EC50值最高，分別為97.2477mg/L和77.7393mg/L，表明離蠕孢菌對(duì)上述兩種殺菌劑不敏感，單獨(dú)使用這兩種藥劑不能有效防控小麥莖基腐病;其他6種藥劑對(duì)離蠕孢菌的抑制活性較高，EC50值為0.0704～16.9555mg/L，其中咯菌腈、丙硫菌唑和咪鮮胺的抑制效果最好，福美雙的抑制效果較弱。供試殺菌劑對(duì)離蠕孢菌的殺菌活性順序?yàn)榭┚?gt;丙硫菌唑>咪鮮胺>戊唑醇>苯醚甲環(huán)唑>福美雙>惡霉靈>多菌靈?？┚妗⒈蚓?、咪鮮胺、戊唑醇可作為對(duì)由離蠕孢菌引起的小麥莖基腐病化學(xué)防治的候選殺菌劑。

8種殺菌劑對(duì)4種鐮刀菌的毒力測(cè)定結(jié)果如表3所示，8種藥劑在一定濃度下對(duì)4種鐮刀菌均表現(xiàn)出抑制作用，且隨濃度的增加，抑制效果更為明顯。不同藥劑對(duì)鐮刀菌的EC50值不同，其中咯菌腈和咪鮮胺的EC50值最小，多菌靈次之;咯菌腈的EC50值分布在0.0704～0.8678mg/L之間，咪鮮胺的EC50值在0.0627～7.9713mg/L之間，多菌靈的EC50值在0.2732～14.1241mg/L之間，表明上述3種殺菌劑對(duì)4種鐮刀菌均具有極強(qiáng)的抑制活性。其他5種殺菌劑對(duì)鐮刀菌的抑菌活性相對(duì)較弱。上述8種殺菌劑均可作為對(duì)由鐮刀菌引起的小麥莖基腐病化學(xué)防治的候選殺菌劑，其中咯菌腈、咪鮮胺和多菌靈的防治效果最佳。

3討論與結(jié)論

近年來(lái)，小麥莖基腐病在中國(guó)小麥各主產(chǎn)區(qū)頻繁發(fā)生，嚴(yán)重威脅小麥生產(chǎn)。本研究從采自天津5個(gè)主要小麥種植區(qū)的33份小麥樣品中共分離到真菌菌株204個(gè)，分為5個(gè)菌群，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和基于rDNA-ITS的分子鑒定，確定為小麥根腐離蠕孢菌、假禾谷鐮刀菌（紫紅色、黃色）、燕麥鐮刀菌和木賊鐮刀菌。其中假禾谷鐮刀菌檢出率達(dá)74.5%，在天津5個(gè)區(qū)均有分布;離蠕孢菌的分布次之，檢出率為21.6%，絕大部分來(lái)源于北辰區(qū)。不同地區(qū)病原菌的種類存在差異，引起天津地區(qū)小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌為假禾谷鐮刀菌，其次為小麥根腐離蠕孢。

明確病原菌的組成及致病性的差異，對(duì)制定防治策略和指導(dǎo)抗病育種具有重要意義。本試驗(yàn)結(jié)果表明，假禾谷鐮刀菌比小麥根腐離蠕孢的致病力更強(qiáng)，離蠕孢菌僅在有傷口時(shí)快速侵染小麥組織并蔓延，而在沒(méi)有傷口時(shí)未發(fā)生侵染，表明傷口是其侵染所必須的。相反，有無(wú)傷口對(duì)鐮刀菌菌株的致病性沒(méi)有影響，只要濕度充足，病原菌都能侵染小麥組織并蔓延生長(zhǎng)，尤其是假禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)速度極快，引起小麥組織的黃化和腐爛。

在采樣的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)小麥長(zhǎng)勢(shì)弱或受到傷害（除草劑、缺素癥等）時(shí)會(huì)加重病害的發(fā)生。此外，已發(fā)病的田塊當(dāng)澆水不當(dāng)導(dǎo)致土壤濕度過(guò)高，或者因地塊不平出現(xiàn)的低洼區(qū)域發(fā)病情況較重。但是，當(dāng)小麥種子進(jìn)行包衣處理后，發(fā)病程度較不進(jìn)行種子包衣的田塊減輕[25-27]。因此，建議小麥在播種前進(jìn)行種子處理，且優(yōu)先選用咯菌腈和咪鮮胺，并根據(jù)當(dāng)?shù)夭≡M成搭配使用多菌靈和丙硫菌唑，避免抗藥性的產(chǎn)生。