健脾解毒湯聯(lián)合5?氟尿嘧啶對胃癌大鼠p53/Hippo 信號通路的調(diào)節(jié)作用

王存吉，余芳，胡亞

（湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院腫瘤一科，湖南株洲412000）

胃癌是全世界發(fā)病率和死亡率均較高的消化道腫瘤疾病之一。在我國胃癌的發(fā)病率位居所有腫瘤疾病的第4 位，死亡率居第2 位[1]。由于胃癌早期的臨床表現(xiàn)不明顯，發(fā)病隱匿，多數(shù)患者就診時已處于胃癌中晚期。目前臨床用于治療胃癌的藥物有限，5?FU 是治療胃癌的常用藥物之一，但在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出有效率低、復(fù)發(fā)率高等缺點[2]，所以對于胃癌治療藥物的探討仍是臨床工作重點。p53/Hippo通路是與腫瘤疾病相關(guān)的信號通路，研究發(fā)現(xiàn)其在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。健脾解毒湯是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)的中藥成方制劑，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在胃癌的治療中能夠增強(qiáng)化療敏感性并減少不良反應(yīng)的發(fā)生[4?5]。本實驗通過研究健脾解毒湯聯(lián)合5?FU對胃癌大鼠p53/Hippo信號通路的調(diào)節(jié)作用，旨在為健脾解毒湯的藥理作用研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

健脾解毒湯藥材飲片薏苡仁30 g（批號190522），野葡萄藤30 g（批號181228），石見穿30 g（批號191012），生黃芪15 g（批號191108），豬苓15 g（批號190809），八月札15 g（批號191008），白術(shù)12 g（批號190705），購自北京同仁堂有限公司，藥材飲片經(jīng)歐陽榮主任藥師鑒定為正品。將藥材飲品置于1 500 mL蒸餾水中煎煮2次，過濾并合并濾液，蒸發(fā)濃縮，制成每毫升含2 g 生藥的制劑；5?FU（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號201906201，規(guī)格10 mL：0.25 g）；大鼠MTL ELISA 試劑盒（武漢益普生物科技有限公司，批號CK?E30376）；大鼠PGI ELISA 試劑盒（上海梵態(tài)生物科技有限公司，批號FT?D24774）；大鼠GAS ELISA 試劑盒（滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司，批號SND?R747）；大鼠TNF?αELISA 試劑盒、cDNA 合成試劑盒、組織裂解液、ECL 化學(xué)發(fā)光液、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（碧云天生物科技有限公司，批號分別為PT516、D7170S、P0013B、P0018S、A0208）；大鼠Bax及Bcl?2 ELISA 試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司，批號CSB?EL002573RA?1、CSB?E08854r?1）；p53、YAP1 及GAPDH 兔多克隆抗體（賽默飛世爾科技有限公司，批號分別為PA5?88098、PA5?17609、PA1?16777）；Trizol 總RNA 抽提試劑、二喹啉甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒、HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為15596026、PC0020、G1120）；PCR 引物設(shè)計及合成由賽默飛世爾科技有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R 臺式高速冷凍離心機(jī)（上海賽弗生物科技有限公司）；CKX41?F32FL熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；YD?202石蠟切片機(jī)（上海文樂生物科技有限公司）；EG1150石蠟包埋機(jī)（德國Leica公司）；iQ5TM PCR 檢測系統(tǒng)（美國Bio?Rad 公司）；E?Gel Imager 凝膠成像儀（賽默飛世爾科技有限公司）；MY?10 組織勻漿器（上海研卉生物科技有限公司）。

1.3 實驗動物

SD大鼠60只，雄性，SPF級，6周齡，180～200 g，購自于湖南省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016?0001，飼養(yǎng)于本院動物房，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～70%，自由飲食，自然光照，實驗動物倫理批號（202010170356）。

1.4 造模、分組

60 只大鼠隨機(jī)分為空白對照組12 只及造模組48 只。參照文獻(xiàn)[6]方法，造模組大鼠自由飲用200 μg/mL 的N?甲基?N?硝基?N?亞硝基胍（MNNG）溶液，連續(xù)16 周，空白對照組喂養(yǎng)自來水。造模結(jié)束后，隨機(jī)取3只大鼠進(jìn)行胃組織病理學(xué)檢查，以大鼠胃組織出現(xiàn)明顯腸上皮化生或異型增生病變視為造模成功，造模組大鼠隨機(jī)分為胃癌模型組、健脾解毒湯組、5?FU組、健脾解毒湯聯(lián)合5?FU組。

1.5 給藥

參照臨床給藥劑量[4?5]的6.3 倍折算，健脾解毒湯組按照13 g/kg（以生藥含量計）灌胃給予大鼠健脾解毒湯，1 次/d，5?FU 組參照文獻(xiàn)[7]方法，按照17.5 mg/kg 隔日腹腔注射1 次5?FU，健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 組同時給予大鼠健脾解毒湯及5?FU，連續(xù)給藥10 周[6]，空白對照組及胃癌模型組灌胃給予生理鹽水，末次給藥結(jié)束24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.6 大鼠血清MTL、PGI及GAS測定

大鼠麻醉后取腹主動脈血，4 ℃條件下靜置1 h后，3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，分離上清液，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書的方法，檢測血清MTL、PGI及GAS水平。

1.7 大鼠胃組織TNF?α、Bax及Bcl?2測定

斷頭法處死大鼠后，分離胃組織，置于4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液中，在組織勻漿器中研磨勻漿，4 ℃條件下，8 000 r/min，離心10 min，取上清液，使用ELISA試劑盒測定大鼠胃組織TNF-α、Bax及Bcl?2水平。

1.8 胃組織病理檢查

斷頭法處死大鼠后，收集胃組織，用4%（φ）中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，制備5 μm 石蠟切片。隨后，石蠟切片在二甲苯中脫蠟，經(jīng)梯度乙醇脫水后，常規(guī)HE 染色，脫水、透明、封片后，置于顯微鏡下盲法進(jìn)行胃組織病理變化檢查。

1.9 大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA水平測定

斷頭法處死大鼠后用Trizol 試劑從胃組織中提取總RNA，使用cDNA 合成試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)引物序列，采用RT?qPCR檢測胃組織p53 及YAP1 mRNA 水平，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達(dá)量。用于RT?qPC反應(yīng)的基因引物序列為，

GAPDH：正向引物：5′?ATACTACGCCCAGAG?GATGA?3′，反向引物：5′?GAAGAAGAGGAGGTG?GAAGAAC?3′；

p53：正向引物：5′?TCCAACGTGCTTTACTCT?CTATC?3′，反向引物：5′?TGTCAGTTACCAGCGT?CAAATA?3′；

YAP1：正向引物：5′?CTAGGCATCGAGGTTAC?ATT?3′，反向引物：5′?CTTGGCTGAGTACCAC?TCT?TATC?3′。

1.10 大鼠胃組織p53及YAP1蛋白水平測定

取大鼠胃組織，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑的組織裂解液，研磨勻漿，從組織標(biāo)本中提取總蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白總濃度，取相當(dāng)于50 μg 蛋白的組織勻漿液在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中進(jìn)行電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，在牛血清白蛋白中室溫封閉1 h，分別經(jīng)p53、YAP1 及GAPDH 抗體（1∶500 稀釋）在4 ℃條件下孵育過夜，使用含吐溫?20的Tris?Buffer 洗滌3 次，10 min/次，再經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1 000 稀釋）室溫孵育1 h，再次 用含 吐溫?20 的Tris?Buffer 洗滌3 次 后，滴加化學(xué)發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，用ImageJ1.6.0軟件對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.11 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 對胃癌大鼠血清MTL、PGI及GAS的影響

如表1所示，與空白對照組比較，胃癌模型組大鼠血清MTL、PGI及GAS 水平顯著降低（P＜0.05）；與胃癌模型組比較，健脾解毒湯組、5?FU 組及健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 組大鼠血清MTL、PGI及GAS 水平顯著升高（P＜0.05），且健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 組大鼠血清MTL、PGI及GAS 水平較單獨使用健脾解毒湯組或5?FU組顯著升高（P＜0.05）。

2.2 健脾解毒湯聯(lián)合5?FU對胃癌大鼠胃組織TNF?α、Bax及Bcl?2的影響

如表2所示，與空白對照組比較，胃癌模型組大鼠胃組織TNF?α及Bcl?2 水平顯著升高（P＜0.05），Bax水平顯著降低（P＜0.05）；與胃癌模型組比較，健脾解毒湯組、5?FU 組及健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 組大鼠胃組織TNF?α及Bcl?2 水平顯著降低（P＜0.05），Bax 水平顯著升高（P＜0.05），且健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 組大鼠胃組織TNF?α及Bcl?2水平較單獨使用健脾解毒湯組或5?FU 組均顯著降低（P＜0.05），Bax水平顯著升高（P＜0.05）。

2.3 健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 對胃癌大鼠胃組織病理變化的影響

如圖1 所示，空白對照組大鼠胃腺及上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，無明顯病理性改變。與空白對照組比較，胃癌模型組大鼠胃組織上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，腺體結(jié)構(gòu)擁擠，細(xì)胞異型性改變，極性喪失，細(xì)胞核染色加深，核質(zhì)比增大；與胃癌模型組比較，健脾解毒湯組、5?FU 組及健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 組大鼠胃組織病理學(xué)不同程度改善。

2.4 健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 對胃癌大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA水平的影響

如表3 所示，結(jié)果表明，與空白對照組比較，胃癌模型組大鼠胃組織p53 及YAP1 mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）；與胃癌模型組比較，健脾解毒湯組、5?FU 組及健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 組大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），且健脾解毒湯聯(lián)合5?FU組大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA水平較單獨使用健脾解毒湯組或5?FU 組均顯著降低（P＜0.05）。

2.5 健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 對胃癌大鼠胃組織p53及YAP1蛋白水平的影響

如圖2 所示，結(jié)果表明，與空白對照組比較，胃癌模型組大鼠胃組織p53 及YAP1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與胃癌模型組比較，健脾解毒湯組、5?FU 組及健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 組大鼠胃組織p53 及YAP1 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），且健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 組大鼠胃組織p53 及YAP1 蛋白水平較單獨使用健脾解毒湯組或5?FU 組均顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清MTL、PGI及GAS的比較Table 1 Comparison of serum MTL，PGI and GAS levels in each group(±s)

表1 各組大鼠血清MTL、PGI及GAS的比較Table 1 Comparison of serum MTL，PGI and GAS levels in each group(±s)

與空白對照組比較：*P＜0.05；與胃癌模型組比較：#P＜0.05；與健脾解毒湯組比較：&P＜0.05；與5?FU組比較：$P＜0.05。

組別空白對照組胃癌模型組健脾解毒湯組5?FU組健脾解毒湯聯(lián)合5?FU組N 12 11 12 11 11 ρ（MTL）/（pg·mL-1）163.29±1.22 104.28±1.61*115.65±1.36#132.22±1.08#&154.86±1.34#&$ρ（PGI）/（ng·mL-1）7.89±0.34 3.11±0.18*4.25±0.69#5.87±0.39#&7.19±0.52#&$ρ（GAS）/（pg·mL-1）118.13±1.53 66.29±1.88*78.61±1.55#90.25±1.48#&106.21±1.73#&$

表2 各組大鼠胃組織TNF?α、Bax及Bcl?2水平的比較Table 2 Comparison of TNF?α，Bax and Bcl?2 levels in gastric tissues of each group rats (±s) ρ/(ng·mL-1)

表2 各組大鼠胃組織TNF?α、Bax及Bcl?2水平的比較Table 2 Comparison of TNF?α，Bax and Bcl?2 levels in gastric tissues of each group rats (±s) ρ/(ng·mL-1)

與空白對照組比較：*P＜0.05；與胃癌模型組比較：#P＜0.05；與健脾解毒湯組比較：&P＜0.05；與5?FU組比較：$P＜0.05。

組別空白對照組胃癌模型組健脾解毒湯組5?FU組健脾解毒湯聯(lián)合5?FU組12 11 12 11 11 23.46±1.12 48.53±1.33*41.21±0.89#36.21±0.90#&30.67±0.74#&$85.60±1.55 22.56±1.34*38.53±2.44#51.40±0.82#&77.65±1.64#&$12.18±1.47 42.84±1.88*32.85±0.82#26.11±0.73#&18.51±0.55#&$

圖1 大鼠胃組織病理檢查結(jié)果（HE，200×）Figure 1 Histopathological examination of rat stomach tissues(HE staining,200×)

表3 各組大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA水平的比較Table 3 Comparison of p53 and YAP1 mRNA levels in gas?tric tissues of each group rats (±s)

表3 各組大鼠胃組織p53及YAP1 mRNA水平的比較Table 3 Comparison of p53 and YAP1 mRNA levels in gas?tric tissues of each group rats (±s)

與空白對照組比較：*P＜0.05；與胃癌模型組比較：#P＜0.05；與健脾解毒湯組比較：&P＜0.05；與5?FU組比較：$P＜0.05。

組別空白對照組胃癌模型組健脾解毒湯組5?FU組健脾解毒湯聯(lián)合5?FU組N 12 11 12 11 11 p53 mRNA相對表達(dá)量0.78±0.23 4.82±0.94*3.17±0.17#1.98±0.28#&1.23±0.12#&$YAP1 mRNA相對表達(dá)量1.15±0.79 5.41±0.26*3.09±0.19#2.17±0.34#&1.68±0.33#&$

圖2 各組大鼠胃組織p53及YAP1蛋白水平的比較Figure 2 Comparison of p53 and YAP1 protein levels in gas?tric tissues of each group rats

3 討論

胃癌是由胃黏膜上皮病變引起的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病具有性別及地區(qū)差異。胃癌的發(fā)病機(jī)制與飲食習(xí)慣、胃部炎癥病變、幽門螺旋桿菌感染及家族遺傳等多種因素有關(guān)[8]。由于胃癌早期臨床癥狀與胃炎、胃潰瘍等癥狀表現(xiàn)相似，特異性不明顯，容易被忽略，導(dǎo)致胃癌早期診斷率較低，也是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后較差、死亡率高的原因之一。胃癌的臨床治療目前主要包括外科手術(shù)治療及藥物治療等，但都存在有效率低、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后效果差等多種缺點[9]，所以對于胃癌治療藥物的探索仍是臨床的工作重點。5?FU 是胸苷酸合成酶抑制劑，用于胃癌等多種消化道腫瘤疾病的治療，然而近年來臨床研究表明5?FU用于胃癌的治療中出現(xiàn)有效率低，預(yù)后效果較差[10]，所以5?FU 與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用用于胃癌的治療成為臨床中探索的新方向。

健脾解毒湯是基于中醫(yī)理論，由生黃芪、生白術(shù)等多種傳統(tǒng)中藥材組成的中藥成方制劑，具有健脾和胃、清熱解毒的功效。方中生黃芪為君藥，性溫味甘，起到健脾和胃的功效，生白術(shù)有補(bǔ)中益氣、祛濕除熱的功效，為臣藥，野葡萄藤清熱利濕、消腫解毒，薏苡仁味甘性涼、利水透濕、解毒散結(jié)，八月札散瘀止痛、理氣活血，諸藥合用起到散瘀止痛、清熱解毒之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[11]，健脾解毒湯具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗消化性潰瘍等多種藥理作用。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)健脾解毒湯在胃癌的治療中表現(xiàn)出顯著療效，袁旭等[5]臨床研究發(fā)現(xiàn)，在奧沙利鉑聯(lián)合替吉奧化療的基礎(chǔ)上給予胃癌患者健脾解毒湯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健脾解毒湯聯(lián)合化療組胃癌患者疾病控制率、無進(jìn)展生存期均顯著提高，同時顯著減少神經(jīng)毒性及乏力等不良反應(yīng)的發(fā)生率；何群英等[4]發(fā)現(xiàn)健脾解毒湯能顯著提高胃癌患者化療效果，并降低化療引起的惡心、嘔吐等不良反應(yīng)的發(fā)生率。由此可見健脾解毒湯在胃癌的治療中具有較大潛力。

MTL、PGI、GAS水平是反映胃組織細(xì)胞正常功能的指標(biāo)，胃黏膜組織細(xì)胞病變時，MTL、GAS 水平顯著降低，胃組織功能明顯降低[12]；PGI是反映胃黏膜細(xì)胞形態(tài)和功能的重要指標(biāo)，吳異蘭等[13]研究報道了血清PGI水平降低是胃癌進(jìn)展、胃組織黏膜細(xì)胞病變的的重要標(biāo)志。本實驗結(jié)果表明，胃癌模型大鼠血清MTL、PGI、GAS 水平顯著降低，給予大鼠健脾解毒湯及5?FU后，大鼠血清MTL、PGI、GAS水平有不同程度的恢復(fù)，且健脾解毒湯聯(lián)合5?FU組較健脾解毒湯組及5?FU組均明顯升高，提示健脾解毒湯聯(lián)合5?FU能夠顯著改善胃癌大鼠胃功能指標(biāo)，促進(jìn)胃組織細(xì)胞功能的恢復(fù)，其效果優(yōu)于5?FU單獨化療組。胃癌組織TNF?α水平是反映胃組織病變程度的指標(biāo)之一，袁虎勤等[14]研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織內(nèi)TNF?α水平顯著升高與胃癌病變程度及進(jìn)展有關(guān)，抑制TNF?α水平則能夠阻止胃組織進(jìn)一步癌變；黃國棟等[15]研究表明抑制胃癌組織內(nèi)TNF?α水平能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡進(jìn)而阻止胃癌進(jìn)展。Bax及Bcl?2是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白，Bax為促凋亡蛋白，其水平升高提示組織細(xì)胞凋亡率升高，Bcl?2為抗凋亡蛋白，其水平升高提示組織細(xì)胞趨向異常增殖。鄭拓等[16]研究發(fā)現(xiàn)胃癌MGC80?3 細(xì)胞Bax 水平顯著降低，Bcl?2 水平升高與MGC80?3 細(xì)胞的異常增殖有關(guān)，而提高Bax水平，降低Bcl?2水平則能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。肖麟等[17]研究也表明胃癌大鼠Bcl?2水平升高及Bax 水平降低與胃癌進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果表明，胃癌大鼠胃組織TNF?α及Bcl?2水平升高，Bax水平降低，給予胃癌大鼠健脾解毒湯及5?FU后，大鼠胃組織TNF?α及Bcl?2水平不同程度降低，Bax水平升高，且聯(lián)合給藥組相關(guān)指標(biāo)變化較5?FU單獨給藥組效果更明顯，提示健脾解毒湯能顯著調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)胃癌的疾病進(jìn)展。

p53/Hippo通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移的重要信號通路，該通路相關(guān)蛋白水平的異常改變則會導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，因此肺癌、胃癌等多種腫瘤疾病的發(fā)生均與該通路相關(guān)。林海鵬等[18]報道了胃癌患者腫瘤組織中p53 蛋白水平顯著升高，且影響胃癌的進(jìn)展及腫瘤TNM 分期；徐鋮等[19]也報道了p53 水平的升高與胃癌的腫瘤分期及分化程度呈正相關(guān)。YAP1 是Hippo 通路中與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白，付婭等[20]研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中YAP1 顯著升高與胃癌細(xì)胞的侵襲過程密切相關(guān)，賈業(yè)貴等[21]發(fā)現(xiàn)YAP1 蛋白水平與胃癌的惡性程度表現(xiàn)出相關(guān)性，且YAP1 蛋白水平越高，胃癌惡性程度也越高。本實驗結(jié)果表明，胃癌模型大鼠體內(nèi)p53及YAP1水平均顯著升高，而健脾解毒湯組、5?FU 組及聯(lián)合給藥組大鼠p53及YAP1水平均有不同程度的降低，且聯(lián)合給藥組大鼠p53及YAP1水平降低更明顯，提示健脾解毒湯聯(lián)合5?FU 可能通過調(diào)節(jié)p53/Hippo 通路，進(jìn)而發(fā)揮對胃癌大鼠的改善作用。

綜上所述，健脾解毒湯聯(lián)合5?FU能夠顯著恢復(fù)胃癌大鼠胃組織功能，調(diào)節(jié)胃組織炎癥因子及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平，改善胃組織病理改變，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)p53/Hippo通路有關(guān)。