類器官在婦科惡性腫瘤中的應(yīng)用

吳嘉興，汪希鵬

類器官（organoid）是在體外培養(yǎng)構(gòu)建出的三維多功能細(xì)胞團(tuán)，具有自我更新和自我組裝、維持其來源組織的結(jié)構(gòu)和生理功能的能力[1-2]，被證實(shí)是良好的人體組織和器官體外模型。類器官具有兩大優(yōu)勢(shì)：其一，高度模擬活體組織的細(xì)胞構(gòu)成，可產(chǎn)生來源組織中所有主要的功能細(xì)胞系；其二，遺傳與表型相對(duì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期培養(yǎng)、擴(kuò)增，也可冷凍保存形成生物樣本庫。類器官培養(yǎng)技術(shù)于2013 年被《Science》雜志評(píng)選為年度科技發(fā)展十大突破之一，于2017 年被《Nature Methods》雜志評(píng)為生命科學(xué)領(lǐng)域的年度技術(shù)。隨著以類器官為基礎(chǔ)的腫瘤研究日益增多，及其構(gòu)建技術(shù)的不斷改進(jìn)，類器官已成為腫瘤學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)研究的有力工具。婦科腫瘤異質(zhì)性程度高，易發(fā)生耐藥，基因變異度高，亟需適用于高通量藥物篩選、能穩(wěn)定維持腫瘤異質(zhì)性的臨床前模型。近年來，越來越多的婦科腫瘤研究使用類器官進(jìn)行高通量藥物篩查（包括藥物敏感性、耐藥機(jī)制、靶向治療和免疫治療等）和機(jī)制研究（包括惡性腫瘤的病因及發(fā)生發(fā)展、惡性腫瘤與宿主周圍環(huán)境的關(guān)系等）[3]?，F(xiàn)綜類器官的發(fā)源發(fā)展及其在婦科惡性腫瘤研究中的應(yīng)用及挑戰(zhàn)，以期為后續(xù)婦科腫瘤類器官研究的開展提供指導(dǎo)。

1 類器官的發(fā)源發(fā)展

1975 年，Rheinwald 和Green 將新鮮分離的角質(zhì)形成細(xì)胞與經(jīng)輻照的小鼠成纖維細(xì)胞（NIH3T3 細(xì)胞）合并培養(yǎng)，首次產(chǎn)生了人類細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)物[4]。隨后，在90 年代初期，他們的同僚Lindberg 等[5]和Pellegrini 等[6]在體外培育出了人源3D 眼角膜結(jié)構(gòu)，延續(xù)了Rheinwald 和Green 的設(shè)想，打開了人源性細(xì)胞類器官培養(yǎng)的大門。雖然在這些研究中沒有使用“類器官”這一稱謂，Rheinwald 和Green 卻是培養(yǎng)人類干細(xì)胞重建3D 組織結(jié)構(gòu)的開創(chuàng)者。到2010 年，Clevers 團(tuán)隊(duì)利用含表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、頭蛋白（Noggin）和R-脊椎蛋白（Rspondin）的3D-Matrigel 培養(yǎng)體系培養(yǎng)小鼠腸道隱窩細(xì)胞，形成類腸組織的隱窩絨毛樣復(fù)合體，由此成功構(gòu)建腸類器官，開啟了類器官研究的新篇章[7]。利用相同的培養(yǎng)體系，他們對(duì)單個(gè)Lgr5+腸干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，也得到了類似生理形態(tài)的微型結(jié)構(gòu)，進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，這些類器官中仍有Lgr5+腸干細(xì)胞的存在，證實(shí)了類器官模型對(duì)腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能均有較好的模擬性[8]。2011 年Sato 等[9]采用類器官技術(shù)培養(yǎng)出腸腺瘤、Barret 上皮組織和結(jié)腸癌組織，真正意義上構(gòu)建出來源于患者腫瘤細(xì)胞的類器官（patientderived organoid，PDO）。上述研究成果一經(jīng)公布，立刻受到了學(xué)界的廣泛關(guān)注，這無疑是類器官研究路上新的里程碑，掀起了類器官研究的熱潮。目前，世界各地的研究人員已經(jīng)報(bào)道了許多成功培養(yǎng)類器官的案例，見表1。

表1 不同組織來源類器官的研究時(shí)間及方法

傳統(tǒng)用于腫瘤研究的生物模型包括患者來源的腫瘤細(xì)胞系（patient-derived cancer cell lines，PDC）和患者來源的腫瘤異種移植（patient-derived xenografts，PDX）模型。PDC 誕生于1951 年Hela 細(xì)胞的成功建系，其具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、可體外無限增殖的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模的藥物篩選和實(shí)驗(yàn)室研究中。但是，PDC 在體外培養(yǎng)過程中會(huì)丟失腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和生理特征[4]，導(dǎo)致無法代表一類腫瘤的所有特征。眾所周知，即使是同一類腫瘤，不同細(xì)胞株之間的特異性也很明顯，因此，PDC 不能完美地應(yīng)用于惡性腫瘤研究，尤其是機(jī)制研究。值得一提的是，惡性腫瘤患者自帶的癌細(xì)胞個(gè)體差異顯著，根本無法以細(xì)胞系去表征。例如，目前常用于前列腺腫瘤的細(xì)胞系只有7 株，無法涵蓋臨床上最為常見的突變類型，如SPOP 突變、FOXA1 突變和CHD1 缺失[23]。即使研究人員開發(fā)出更多的腫瘤細(xì)胞系，也會(huì)損失PDC 簡(jiǎn)單易操作的特性，同時(shí)也增加了科學(xué)研究的成本。PDX是將腫瘤組織切塊并移植于免疫缺陷小鼠體內(nèi)而制成的人源腫瘤異種移植模型。PDX 模型完好地保留了來源腫瘤的異質(zhì)性，克服了PDC 在臨床應(yīng)用中的瓶頸，可充分模擬腫瘤與體內(nèi)環(huán)境作用的過程。目前，PDX 模型已廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究和輔助臨床藥物篩選中，但其仍存在移植成功率低、造模周期長(zhǎng)和樣本量難以擴(kuò)大的問題。相較于PDC 和PDX，PDO 經(jīng)歷多次傳代仍能保存絕大多數(shù)腫瘤來源組織的生物學(xué)特征，其既具備腫瘤細(xì)胞系無限增殖的特性，也維持了腫瘤的異質(zhì)性，可以應(yīng)用于高通量藥物篩選或輔助個(gè)性化治療方案的設(shè)定（見表2）。

表2 各種腫瘤研究模型的優(yōu)劣對(duì)比

類器官的出現(xiàn)為再生醫(yī)學(xué)開辟了新途徑，通過與新興技術(shù)的結(jié)合，更可以在類器官水平上完成基因編輯、免疫靶標(biāo)篩選和腫瘤干性探究等操作，對(duì)腫瘤研究有著極大的推動(dòng)作用，是腫瘤研究新的突破點(diǎn)，必然也是婦科惡性腫瘤研究的有力工具[24]。

2 類器官在婦科惡性腫瘤中的研究

2.1 卵巢癌類器官應(yīng)用于婦科惡性腫瘤研究的最早報(bào)道，是通過建立健康人類卵巢上皮組織的體外類器官模型，發(fā)現(xiàn)輸卵管細(xì)胞的球形結(jié)構(gòu)與卵巢皮質(zhì)上皮包涵囊腫的形態(tài)類似，提示輸卵管作為卵巢上皮腫瘤來源的可能[25]。類器官還曾用于研究慢性炎癥與卵巢癌發(fā)生的相關(guān)性，應(yīng)用腫瘤壞死因子在體外反復(fù)刺激卵巢上皮組織類器官模型，結(jié)果類器官中出現(xiàn)了癌前病變，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖重新啟動(dòng)、結(jié)構(gòu)紊亂、上皮極性消失、基底膜降解和細(xì)胞侵襲等。該研究不僅直觀支持慢性炎癥與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，也有力說明了兩者的直接關(guān)系。因此，類器官模型是探究卵巢癌發(fā)生初期過程的有力工具。

2018 年，Hill 等[26]構(gòu)建了來源于12 例高級(jí)別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSOC）患者的22 份腫瘤類器官，結(jié)合藥物敏感性測(cè)試和全外顯子組測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，復(fù)制叉（replication fork）保護(hù)功能缺陷影響卡鉑、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）和ATR 激酶（ataxia telangiectasia-mutated and Rad3-related kinase）抑制劑的敏感性。無論DNA 修復(fù)基因突變情況如何，類器官同源重組功能缺陷都與多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase，PARP]抑制劑敏感性相關(guān)。該研究結(jié)果表明，基因組分析和類器官功能測(cè)試相結(jié)合，可以靶向識(shí)別DNA 損傷修復(fù)缺陷。這些研究結(jié)論提示源自于患者的卵巢癌類器官生長(zhǎng)迅速且在遺傳和功能上與源腫瘤匹配、吻合，類器官可用于DNA 修復(fù)功能分析和藥物敏感性篩選檢測(cè)，并為腫瘤同源重組功能缺陷的評(píng)估及合適治療方案的選擇提供快速、可靠的依據(jù)。

Soragni 等[27]構(gòu)建了來源于卵巢惡性腫瘤的類器官，并使用這些類器官對(duì)具有抗腫瘤藥物潛能的化合物及多肽進(jìn)行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)多肽ReACp53 具有部分恢復(fù)P53 功能的效應(yīng)，經(jīng)此通路發(fā)揮抗腫瘤活性。然后將該多肽注射到移植了腫瘤組織的小鼠腹腔，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的腫瘤移植物體積迅速縮小，證實(shí)多肽ReACp53 具有成為治療卵巢癌以及其他含有P53 變異腫瘤新藥物的可能。該研究成功地將類器官應(yīng)用于抗腫瘤藥物的新藥發(fā)現(xiàn)研究，為后續(xù)研究提供了參考。Hill 等[26]的研究中使用HGSOC 患者來源的腫瘤類器官對(duì)卡鉑、Prexasertib、VE-822、吉西他濱和奧拉帕利等多種抗腫瘤藥物進(jìn)行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)不同的傳統(tǒng)化療藥物與DNA 損傷修復(fù)藥物搭配形成的多個(gè)藥物組合，在含有DNA 修復(fù)缺陷的腫瘤中有效。這些研究證實(shí)了類器官是快速測(cè)試藥物組合的有用模型，類器官在針對(duì)卵巢癌的結(jié)合基因組測(cè)序和測(cè)試藥物反應(yīng)等方面已經(jīng)顯示出了巨大作用，可以預(yù)見其在針對(duì)卵巢癌的分子發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)錄組和生物標(biāo)志物等方面的研究中也有廣闊應(yīng)用前景。

除藥物治療外，卵巢腫瘤類器官在免疫治療中的應(yīng)用仍有較大的探索空間。由于腫瘤類器官的培養(yǎng)過程中缺乏免疫系統(tǒng)的相互作用，將其直接應(yīng)用于免疫治療的研究還存在一些難題。目前已有學(xué)者通過將類器官與免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)解決了這一難題，如Yuki 等[28]將腫瘤類器官與樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞共培養(yǎng)，可以阻斷腫瘤類器官內(nèi)部的程序性死亡受體1 及其配體（programmed death-1/programmed death ligand-1，PD-1/PD-L1）的識(shí)別通路，從而降低腫瘤的進(jìn)展速度?？梢婎惼鞴僮鳛槊庖咧委熜Ч念A(yù)測(cè)工具，在婦科惡性腫瘤中有很大的應(yīng)用價(jià)值。

2.2 子宮內(nèi)膜癌子宮內(nèi)膜癌是常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病與生活方式有密切關(guān)系。我國(guó)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年升高，目前僅次于宮頸癌，居?jì)D科惡性腫瘤第2 位。由于缺乏理想的研究模型，闡釋子宮內(nèi)膜癌分子機(jī)制的研究較少。近年來，模擬生理狀態(tài)的子宮內(nèi)膜類器官研究進(jìn)展迅速[29-31]。Girda等[32]使用無血清的新型培養(yǎng)模式，成功對(duì)子宮內(nèi)膜癌組織來源的類器官進(jìn)行構(gòu)建及傳代，并使用雌激素類似物對(duì)其進(jìn)行敏感度測(cè)試，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌類器官對(duì)雌激素產(chǎn)生了濃度依賴性的反應(yīng)，表明子宮內(nèi)膜癌類器官可用于雌激素及藥物敏感性測(cè)試。此外，該研究還表明，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抑制劑——BBI608 用于類器官培養(yǎng)物及體外培養(yǎng)的人體組織，表現(xiàn)出幾乎一致的抑制作用。因此，該抑制劑有可能成為治療子宮內(nèi)膜癌的一種新型靶向治療藥物。

盡管類器官培養(yǎng)可用于子宮內(nèi)膜癌的藥物敏感性檢測(cè)，但類器官培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果及其與患者預(yù)后的關(guān)系，仍需大樣本臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證；類器官用于預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者的藥物反應(yīng)，還需要對(duì)正在接受治療患者的實(shí)際臨床結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，從而評(píng)價(jià)類器官藥物敏感性試驗(yàn)用于個(gè)體化臨床決策的有效性。如已報(bào)道的對(duì)胃癌類器官的臨床研究中，Vlachogiannis 等[33]將PDO 的原位小鼠腫瘤異種移植模型對(duì)體外抗癌劑的反應(yīng)與臨床試驗(yàn)中患者的反應(yīng)進(jìn)行了頭對(duì)頭比較研究（head to head comparative trail），證實(shí)了PDO 異種移植模型能同等水平地反映患者臨床中對(duì)于體外抗癌劑的反應(yīng)。

2.3 宮頸癌宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，由高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）引起。與腺上皮細(xì)胞來源的類器官不同，宮頸癌以鱗狀細(xì)胞癌為主要類型，這就需要基于鱗狀細(xì)胞的類器官模型，而目前尚缺乏人源培養(yǎng)系統(tǒng)來研究宮頸上皮及其衍生的惡性腫瘤。2021 年，Clevers團(tuán)隊(duì)率先創(chuàng)建宮頸模型來研究HPV 介導(dǎo)的宮頸癌，他們利用在臨床檢查期間用巴氏刷獲得的有限數(shù)量的宮頸組織培育出類器官，繼而利用單純皰疹病毒1 型（herpes simplex virus-1，HSV-1）感染類器官，通過熒光染色證明了類器官可以模擬HSV-1 感染的完整過程；團(tuán)隊(duì)使用同樣的技術(shù)利用宮頸鱗狀細(xì)胞癌或?qū)m頸腺癌患者的細(xì)胞生成了宮頸鱗狀細(xì)胞癌或?qū)m頸腺癌的類器官[34]。類器官的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示其與原始天然腫瘤高度相似，包括不同的HPV 致癌基因介導(dǎo)的基因組特征。因此，宮頸癌類器官是一種有效的工具，可以模擬宮頸癌和性傳播感染的病理生理學(xué)。除人為模擬病毒感染介導(dǎo)的宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生過程外，通過基因編輯手段構(gòu)建宮頸癌類器官將成為未來研究的新熱點(diǎn)。另外，結(jié)合基因編輯技術(shù)，可以在類器官模型上考察惡性腫瘤驅(qū)動(dòng)基因?qū)δ[瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。Matano 等[35]使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)結(jié)腸類器官進(jìn)行基因編輯，涉及結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、SMAD家族成員4（SMAD family member 4，SMAD4）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p35，TP53）、鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）及磷脂酰肌醇3 激酶催化亞單位α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）多個(gè)抑癌/原癌基因，獲得了眾多不同表型的結(jié)腸癌類器官模型。對(duì)于不同組織學(xué)類型的宮頸惡性腫瘤類器官的構(gòu)建具有良好的借鑒意義。

Zhang 等[36]主導(dǎo)的一項(xiàng)前瞻性研究中，發(fā)現(xiàn)鱗狀上皮（squamous epithelial）、鱗狀間充質(zhì)（squamous mesenchymal）和腺上皮（adenocarcinoma）3 種類型的宮頸癌中，鱗狀間充質(zhì)亞型腫瘤患者的生存結(jié)局較差，隨之以宮頸癌類器官模型證明，宮頸癌細(xì)胞中間充質(zhì)成分增多與形成類器官的能力和對(duì)輻射的抵抗力呈正相關(guān)，表現(xiàn)為糖酵解水平升高的宮頸癌類器官對(duì)輻射的抗性增高，導(dǎo)致放療效果變差。該研究通過整合大數(shù)據(jù)集提供了一種反應(yīng)預(yù)測(cè)策略，并強(qiáng)調(diào)了代謝指標(biāo)在宮頸癌放射性治療效果預(yù)測(cè)中的價(jià)值。

3 結(jié)語與展望

雖然類器官模型的培養(yǎng)已為婦科惡性腫瘤的研究帶來很大進(jìn)展，但仍有需要突破和改進(jìn)的不足之處。第一，類器官模型缺乏體內(nèi)類似環(huán)境中的多種間質(zhì)細(xì)胞，如免疫T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞、神經(jīng)組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞等。間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞相互作用的缺失將導(dǎo)致一部分的腫瘤內(nèi)部信息丟失，Maru 等[37]的一項(xiàng)病例報(bào)告提到，宮頸透明細(xì)胞癌類器官丟失了原始腫瘤細(xì)胞中TP53 雙等位基因失活的重要遺傳信息，無法重現(xiàn)原始腫瘤組織中局灶腺癌病變的表型。第二，腫瘤類器官培養(yǎng)技術(shù)繁復(fù)，國(guó)際上缺乏統(tǒng)一有效的培養(yǎng)準(zhǔn)則，統(tǒng)一完善的類器官生物樣本庫的建立尚需努力。第三，目前類器官培養(yǎng)技術(shù)的成功率有待提高，培養(yǎng)周期和經(jīng)濟(jì)消耗方面并未達(dá)到最理想狀態(tài)，也是導(dǎo)致大多數(shù)研究停留在基礎(chǔ)研究及實(shí)驗(yàn)室階段，不能迅速應(yīng)用于臨床的原因之一。這些問題需要生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程和材料科學(xué)等多方協(xié)作以求完善。Fong 等[38]用富孔隙水凝膠替代以往的基質(zhì)膠建立海綿樣培養(yǎng)體系，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了新型的肝癌類器官，這種新型的材料有望進(jìn)一步應(yīng)用于婦科腫瘤類器官中。

類器官為體外個(gè)性化地模擬來源組織和器官提供了選擇，它的出現(xiàn)有利于推動(dòng)臨床個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。這種接近生理狀態(tài)的3D 模型有助于準(zhǔn)確研究一系列的體內(nèi)過程，包括組織更新、干細(xì)胞功能、藥物反應(yīng)及突變或損傷。在婦產(chǎn)科領(lǐng)域，類器官可很好地用于婦科惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究和臨床前藥物篩選等，也是研究免疫治療和靶向治療的有效工具，這些優(yōu)勢(shì)對(duì)于為患者進(jìn)行精準(zhǔn)化治療和個(gè)體化治療提供了新的思路和解決方法。因此，類器官在婦科惡性腫瘤領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)于探索婦科惡性腫瘤有效的治療策略意義重大。