• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-30a-5p調(diào)控HDAC9對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究

    2022-04-26 14:55:04余敏崔躍黎鵬飛謝丹陳芬
    河北醫(yī)藥 2022年8期
    關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激檢測

    余敏 崔躍 黎鵬飛 謝丹 陳芬

    心肌組織在短時(shí)間內(nèi)供血或供養(yǎng)不足容易引起心血管疾病的發(fā)生,如中風(fēng)、急性心肌梗死和缺血性心臟病等[1,2]。心肌缺血再灌注損傷可以促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷[3,4],這也是急性心肌梗死患者病死率較高的原因[5]。miRNA在心血管疾病中異常表達(dá),可以參與細(xì)胞的增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程,進(jìn)而參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[6,7]。研究發(fā)現(xiàn),抑制NPHP3-AS1通過調(diào)控下調(diào)miR305p減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡,促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖[8]。組蛋白去乙?;?(HDAC9)在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)水平升高,抑制HDAC9表達(dá)可以減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎性損傷[9]。通過生物信息學(xué)網(wǎng)預(yù)測miR-30a-5p和HDAC9可能存在結(jié)合互補(bǔ)位點(diǎn),但筆者發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p是否調(diào)控HDAC9對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷尚不明確,本研究通過建立缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞H9c2模型,探討miR-30a-5p通過調(diào)控HDAC9對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響。報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞與試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司;miR-NC、miR-30a-5p、si-NC、si-HDAC9、pcDNA和HDAC9序列和引物均購自上海吉瑪制藥公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司;凋亡試劑盒、BCA試劑盒、ECL試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶公司;HDAC9抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體購自美國Abcam公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物研究所。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 心肌細(xì)胞H9c2復(fù)蘇后,在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi),置于培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃、飽和濕度為5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞傳代。取對(duì)數(shù)生長期的心肌細(xì)胞H9c2,將細(xì)胞分組:對(duì)照組(Control組):正常條件培養(yǎng)心肌細(xì)胞H9c2;缺氧復(fù)氧組(H/R組):在培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置95% N2、5% CO2進(jìn)行缺氧條件培養(yǎng)12 h,倒掉培養(yǎng)液,然后在培養(yǎng)箱為37℃、20% O2、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h,建立心肌細(xì)胞H9c2的缺氧復(fù)氧模型。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的操作步驟將miR-NC、miR-30a-5p、si-NC、si-HDAC9、miR-30a-5p+pcDNA、miR-30a-5p+HDAC9轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞H9c2內(nèi),6 h后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理,分別記為H/R+miR-NC組、H/R+miR-30a-5p組、H/R+si-NC組、H/R+si-HDAC9組、H/R+miR-30a-5p+pcDNA組、H/R+miR-30a-5p+HDAC9組,繼續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3 qRT-PCR檢測miR-30a-5p和HDAC9 mRNA表達(dá) 收集各組生長對(duì)數(shù)期的心肌細(xì)胞H9c2,加入Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA,在分光光度計(jì)先檢測細(xì)胞濃度和純度,然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟嚴(yán)格進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板按照熒光定量試劑盒說明書操作步驟,miR-30a-5p、HDAC9 mRNA分別以U6、GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過2-△△Ct法檢測miR-30a-5p和HDAC9 mRNA表達(dá)。

    1.4 Western blot檢測HDAC9、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 收集各組心肌細(xì)胞H9c2,加入蛋白裂解液用于提取細(xì)胞的總蛋白,采用BCA試劑盒檢測蛋白的濃度,沸水變性處理細(xì)胞。取35 μg蛋白樣品上樣凝膠電泳處理,結(jié)束后轉(zhuǎn)膜,用脫脂奶粉封閉處理,將膜轉(zhuǎn)移至一抗溶液內(nèi),4℃過夜孵育,加入相應(yīng)二抗溶液,室溫孵育,按照ECL試劑盒說明書,顯影曝光,通過Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白的表達(dá)。

    1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組心肌細(xì)胞H9c2,3 000 r/min離心5 min,離心后在培養(yǎng)內(nèi)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。在各組細(xì)胞內(nèi)加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,然后繼續(xù)加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,嚴(yán)格按照凋亡試劑盒說明書,避光反應(yīng)10 min后,在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。

    1.6 ELISA檢測SOD活性、MDA含量和LDH含量 取各組心肌細(xì)胞H9c2,離心后上清液,用于檢測SOD活性、MDA含量和LDH含量。具體操作步驟嚴(yán)格按照SOD、MDA和LDH檢測試劑盒進(jìn)行。

    1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-30a-5p和HDAC9靶向關(guān)系 通過Star Base預(yù)測顯示miR-30a-5p和HDAC9存在結(jié)合位點(diǎn),然后構(gòu)建HDAC9 3’UTR的野生型載體(HDAC9 3’UTR-wt)和突變型載體(HDAC9 3’UTR-mut)。取對(duì)數(shù)生長期的心肌細(xì)胞H9c2,按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將HDAC9 3’UTR-wt和HDAC9 3’UTR-mut分別于miR-NC或miR-30a-5p轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞H9c2。最后按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒的說明書檢測熒光素酶活性。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-30a-5p和HDAC9在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2中的表達(dá) 與Control組比較,H/R組的心肌細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05),HDAC9 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。見表1,圖1。

    表1 miR-30a-5p和HDAC9在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2中的表達(dá)

    圖1 HDAC9在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2中的表達(dá)

    2.2 過表達(dá)miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響 與Control組比較,H/R組的心肌細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)、Bcl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著降低(P<0.05),而細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著增加(P<0.05);與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-30a-5p組的心肌細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)、Bcl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著增加(P<0.05),而細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著降低(P<0.05)。見圖2,表2。

    圖2 過表達(dá)miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響;A 細(xì)胞凋亡率;B Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

    表2 過表達(dá)miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響

    2.3 miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達(dá) 與miR-NC組比較,miR-30a-5p組中HDAC9 3’UTR-wt熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),而HDAC9 3’UTR-mut熒光素酶活性沒有任何變化(P>0.05)。與anti-miR-N組比較,anti-miR-30a-5p組中miR-30a-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與miR-NC組比較,miR-30a-5p組中HDAC9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與anti-miR-N組比較,anti-miR-30a-5p組中HDAC9蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見圖3,表3、4。

    圖3 miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達(dá);A miR-30a-5p和HDAC9存在結(jié)合位點(diǎn);B miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達(dá)

    表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和anti-miR-30a-5p的轉(zhuǎn)染效率

    2.4 干擾HDAC9對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡、氧化應(yīng)激的影響 與Control組比較,H/R組的心肌細(xì)胞中HDAC9蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而Bcl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與H/R+si-NC組比較,H/R+si-HDAC9組的心肌細(xì)胞中HDAC9蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而Bcl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4,表5。

    表5 干擾HDAC9對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡、氧化應(yīng)激的影響

    圖4 干擾HDAC9對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響;A 細(xì)胞凋亡率;B HDAC9、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

    表4 miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達(dá)

    2.5 過表達(dá)HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響 與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-30a-5p組的心肌細(xì)胞中HDAC9蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著降低(P<0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而Bcl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著增加(P<0.05);與H/R+miR-30a-5p+pcDNA組比較,H/R+miR-30a-5p+HDAC9組的心肌細(xì)胞中HDAC9蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著增加(P<0.05);而Bcl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著降低(P<0.05)。見圖5,表6。

    圖5 過表達(dá)HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響;A 細(xì)胞凋亡率;B HDAC9、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

    表6 過表達(dá)HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響

    3 討論

    微小RNA(miRNA)在心血管疾病中研究作用已經(jīng)獲得大量研究的認(rèn)可,而且miRNA在心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等研究過程中也備受關(guān)注[10],其中miR-143、miR-519d-3p和miR-27a-3p等已被證明[11-13]。Liu等[14]研究結(jié)果顯示,缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞后,miRNA-15b表達(dá)顯著增加,過表達(dá)miRNA-15b明顯促進(jìn)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡,這與本研究結(jié)果相反。Yang等[15]研究結(jié)果顯示,miR-22在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中低表達(dá),miR-22通過調(diào)控CBP/AP-1途徑減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎性損傷,進(jìn)而起到保護(hù)心臟的作用。在急性心肌梗死構(gòu)建的缺氧模型中發(fā)現(xiàn),miR-483-5p在缺氧誘導(dǎo)人心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),過表達(dá)miR-483-5p明顯促進(jìn)了缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,這與本研究結(jié)果相反[16]。miR-499-5p在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)miR-499-5p明顯抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[17],這與本研究結(jié)果相似。miR-30a-5p報(bào)道參與可腎臟損傷、心肌缺血和再灌注損傷模型[18,19]。本研究結(jié)果顯示,通過建立缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2模型,缺氧處理后明顯降低心肌細(xì)胞明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激水平,以及上調(diào)Bax蛋白表達(dá),下調(diào)Bcl-2的表達(dá);進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,miR-30a-5p在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中低表達(dá),過表達(dá)miR-30a-5p明顯抑制心肌細(xì)胞H9c2的凋亡和氧化應(yīng)激水平,以及下調(diào)Bax蛋白表達(dá),上調(diào)Bcl-2的表達(dá),這說miR-30a-5p參與了缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c的氧化應(yīng)激損傷的作用。

    HDAC9是HDACs家族成員的轉(zhuǎn)錄因子之一,位于7號(hào)染色體q21.1位置上,與酵母HAD-I樣酶具有高度的同源性,主要存在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[20,21]。HDAC9在多種癌癥中發(fā)揮著重要作用,且在動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈中高表達(dá)[22,23]。研究結(jié)果顯示,HDAC9在缺血再灌注損傷模型中高表達(dá),與缺血性腦卒中密切相關(guān)[24]。Shi等[25]研究發(fā)現(xiàn),HDAC9在大鼠腦缺血/再灌注表達(dá)上調(diào),轉(zhuǎn)染慢病毒HDAC9降低了腦部中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn);沉默HDAC9明顯抑制了OGD誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和凋亡。本研究結(jié)果顯示,HDAC9 mRNA和蛋白表達(dá)在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中高表達(dá),干擾HDAC9明顯抑制心肌細(xì)胞H9c2的凋亡和氧化應(yīng)激水平,以及下調(diào)Bax蛋白表達(dá),上調(diào)Bcl-2的表達(dá);通過生物信息學(xué)網(wǎng)站和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),miR-30a-5p可以靶向調(diào)控HDAC9表達(dá),過表達(dá)HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的作用,這說明miR-30a-5p通過靶向調(diào)控HDAC9抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激水平,對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

    綜上所述,過表達(dá)miR-30a-5p可以減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激水平,其作用機(jī)制可能與HDAC9有關(guān),起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

    猜你喜歡
    氧化應(yīng)激檢測
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    基于炎癥-氧化應(yīng)激角度探討中藥對(duì)新型冠狀病毒肺炎的干預(yù)作用
    小波變換在PCB缺陷檢測中的應(yīng)用
    氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變
    尿酸對(duì)人肝細(xì)胞功能及氧化應(yīng)激的影響
    乙肝病毒S蛋白對(duì)人精子氧化應(yīng)激的影響
    在线观看国产h片| 国产 一区精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 99re6热这里在线精品视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 成人毛片a级毛片在线播放| freevideosex欧美| 亚洲精品视频女| 中文欧美无线码| 2022亚洲国产成人精品| 99re6热这里在线精品视频| 宅男免费午夜| 国产成人一区二区在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 最近的中文字幕免费完整| 最近中文字幕高清免费大全6| 高清不卡的av网站| 热re99久久国产66热| 国产亚洲精品久久久com| 热99国产精品久久久久久7| 久久精品夜色国产| 亚洲丝袜综合中文字幕| 1024视频免费在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 啦啦啦啦在线视频资源| 91精品三级在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲内射少妇av| 春色校园在线视频观看| 国产免费又黄又爽又色| 男女边摸边吃奶| 久久久国产一区二区| 婷婷色综合www| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品一区二区在线观看99| 少妇被粗大猛烈的视频| 毛片一级片免费看久久久久| av线在线观看网站| 久久久久精品人妻al黑| 精品国产乱码久久久久久小说| 最近中文字幕高清免费大全6| 婷婷色av中文字幕| 91精品三级在线观看| 成人手机av| 91久久精品国产一区二区三区| 9热在线视频观看99| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 精品久久国产蜜桃| 狂野欧美激情性bbbbbb| 色5月婷婷丁香| 午夜日本视频在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 七月丁香在线播放| www日本在线高清视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 伦理电影大哥的女人| 99香蕉大伊视频| 黄色怎么调成土黄色| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美变态另类bdsm刘玥| 1024视频免费在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 美女视频免费永久观看网站| 国产精品一区二区在线观看99| 草草在线视频免费看| 嫩草影院入口| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品人妻久久久久久| 日韩av不卡免费在线播放| 夫妻午夜视频| 丝袜在线中文字幕| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲国产av新网站| 久久久久精品性色| 国产精品国产av在线观看| 18在线观看网站| 久久ye,这里只有精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲欧美成人精品一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 观看美女的网站| 视频中文字幕在线观看| 欧美3d第一页| 亚洲精品美女久久av网站| 婷婷色麻豆天堂久久| 日本午夜av视频| 黄片播放在线免费| 成年人午夜在线观看视频| 欧美成人午夜免费资源| 久久鲁丝午夜福利片| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产1区2区3区精品| av线在线观看网站| 一级片免费观看大全| 男女国产视频网站| 一二三四在线观看免费中文在 | 国产成人免费观看mmmm| 亚洲国产最新在线播放| 夜夜爽夜夜爽视频| av在线观看视频网站免费| 黄片播放在线免费| 涩涩av久久男人的天堂| 九九在线视频观看精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 水蜜桃什么品种好| 免费看光身美女| 看非洲黑人一级黄片| 91精品国产国语对白视频| 久久久久久人妻| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲精品乱久久久久久| 激情视频va一区二区三区| 尾随美女入室| 精品国产一区二区久久| 高清欧美精品videossex| 成人综合一区亚洲| 两性夫妻黄色片 | 国产精品国产av在线观看| 成人手机av| 国产成人免费无遮挡视频| av在线app专区| 成人亚洲欧美一区二区av| 成人国产av品久久久| 国产精品欧美亚洲77777| 最近2019中文字幕mv第一页| 性高湖久久久久久久久免费观看| av片东京热男人的天堂| 一二三四在线观看免费中文在 | 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品一二三区在线看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 99久久中文字幕三级久久日本| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲精品一二三| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| av在线播放精品| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 看免费av毛片| 天天影视国产精品| 久久免费观看电影| 男男h啪啪无遮挡| tube8黄色片| 视频在线观看一区二区三区| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品国产av在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产成人a∨麻豆精品| 老女人水多毛片| av网站免费在线观看视频| 久久影院123| 欧美日韩亚洲高清精品| 母亲3免费完整高清在线观看 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 欧美变态另类bdsm刘玥| 少妇人妻 视频| 我要看黄色一级片免费的| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 中国三级夫妇交换| 天堂俺去俺来也www色官网| 女性生殖器流出的白浆| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久精品夜色国产| 插逼视频在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久亚洲精品成人影院| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久久久久久国产电影| 国产精品 国内视频| 久久97久久精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 男人舔女人的私密视频| 伊人亚洲综合成人网| 在线观看美女被高潮喷水网站| 十八禁高潮呻吟视频| 九九在线视频观看精品| 少妇的丰满在线观看| 久久 成人 亚洲| 激情视频va一区二区三区| 秋霞伦理黄片| 久久久久久久久久久久大奶| 国产成人精品婷婷| 免费日韩欧美在线观看| 精品一区二区三卡| 大话2 男鬼变身卡| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲国产色片| 久热这里只有精品99| 日本黄大片高清| www.色视频.com| 国产1区2区3区精品| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 国产男女超爽视频在线观看| 免费观看在线日韩| 两性夫妻黄色片 | 国产成人aa在线观看| 午夜福利,免费看| 中文欧美无线码| 欧美精品av麻豆av| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产免费视频播放在线视频| 三上悠亚av全集在线观看| 国产免费现黄频在线看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久久人人人人人| 国产一区二区激情短视频 | 99国产综合亚洲精品| 国产麻豆69| 一本久久精品| 丝袜喷水一区| 精品福利永久在线观看| 久久 成人 亚洲| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品,欧美精品| 春色校园在线视频观看| 国产免费现黄频在线看| xxxhd国产人妻xxx| 欧美97在线视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 五月天丁香电影| 日韩成人伦理影院| 各种免费的搞黄视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲色图综合在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 国产麻豆69| 国产精品一二三区在线看| 天堂中文最新版在线下载| 国精品久久久久久国模美| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 亚洲国产欧美日韩在线播放| 人成视频在线观看免费观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 黄色一级大片看看| 久久久久人妻精品一区果冻| av在线老鸭窝| 亚洲国产av新网站| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 五月天丁香电影| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲情色 制服丝袜| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 99热全是精品| 亚洲av欧美aⅴ国产| 毛片一级片免费看久久久久| 在线天堂中文资源库| 丰满乱子伦码专区| 国产又爽黄色视频| 美女国产视频在线观看| 丝袜在线中文字幕| av播播在线观看一区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久鲁丝午夜福利片| 激情五月婷婷亚洲| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲成国产人片在线观看| 丝袜在线中文字幕| 欧美精品一区二区免费开放| 国产乱来视频区| 国产精品无大码| 国产亚洲最大av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久人人爽人人爽人人片va| 午夜福利视频精品| 建设人人有责人人尽责人人享有的| a级片在线免费高清观看视频| 边亲边吃奶的免费视频| 99热网站在线观看| 婷婷色综合www| 丝袜喷水一区| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲av福利一区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 另类亚洲欧美激情| 国产成人精品久久久久久| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 大香蕉久久成人网| 国产精品偷伦视频观看了| 在线看a的网站| 大码成人一级视频| www日本在线高清视频| 日韩欧美一区视频在线观看| freevideosex欧美| av免费在线看不卡| 亚洲五月色婷婷综合| videosex国产| 五月玫瑰六月丁香| 青春草国产在线视频| 宅男免费午夜| 国产精品偷伦视频观看了| 精品少妇久久久久久888优播| 内地一区二区视频在线| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲av成人精品一二三区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日本免费在线观看一区| 欧美日韩视频精品一区| 看免费av毛片| 亚洲国产精品国产精品| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品午夜福利在线看| a级毛色黄片| 插逼视频在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 视频中文字幕在线观看| av黄色大香蕉| 只有这里有精品99| 99久久精品国产国产毛片| 成年人免费黄色播放视频| 一边亲一边摸免费视频| 97精品久久久久久久久久精品| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲美女视频黄频| 国产成人aa在线观看| 五月开心婷婷网| 黑人高潮一二区| 国产成人aa在线观看| videosex国产| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲人与动物交配视频| 精品一区二区三卡| 精品熟女少妇av免费看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 999精品在线视频| 99视频精品全部免费 在线| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 99热这里只有是精品在线观看| 久久这里有精品视频免费| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美成人精品欧美一级黄| 成人免费观看视频高清| 欧美另类一区| 亚洲av综合色区一区| 波野结衣二区三区在线| 制服人妻中文乱码| 丁香六月天网| 波多野结衣一区麻豆| 午夜福利影视在线免费观看| 免费大片黄手机在线观看| 国产成人精品婷婷| av线在线观看网站| 国产黄频视频在线观看| 丰满少妇做爰视频| 999精品在线视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 免费大片18禁| 精品人妻一区二区三区麻豆| 1024视频免费在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 18禁国产床啪视频网站| xxx大片免费视频| 妹子高潮喷水视频| 最近中文字幕2019免费版| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产成人欧美| 国产一区二区激情短视频 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 看免费av毛片| 在线观看一区二区三区激情| 国产精品成人在线| 久久国内精品自在自线图片| 深夜精品福利| 久久久久久伊人网av| 下体分泌物呈黄色| 九草在线视频观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 丝袜在线中文字幕| 色网站视频免费| 久久久国产一区二区| 国产精品久久久久久精品古装| 插逼视频在线观看| 国产亚洲最大av| 男女午夜视频在线观看 | 91精品国产国语对白视频| 日韩电影二区| 波多野结衣一区麻豆| av不卡在线播放| 宅男免费午夜| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 天堂中文最新版在线下载| av在线播放精品| xxxhd国产人妻xxx| 好男人视频免费观看在线| 亚洲在久久综合| 黑人高潮一二区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 视频中文字幕在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 极品人妻少妇av视频| av女优亚洲男人天堂| 亚洲成人av在线免费| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 在现免费观看毛片| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲,欧美精品.| 色婷婷av一区二区三区视频| 秋霞在线观看毛片| 香蕉丝袜av| 亚洲情色 制服丝袜| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 极品人妻少妇av视频| 九九爱精品视频在线观看| 91国产中文字幕| 天堂8中文在线网| 国产高清三级在线| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日韩欧美精品免费久久| 97超碰精品成人国产| 日韩中文字幕视频在线看片| 香蕉精品网在线| 亚洲av日韩在线播放| 午夜免费鲁丝| 成人综合一区亚洲| 日本av免费视频播放| 亚洲欧美清纯卡通| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 日韩av免费高清视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 婷婷色综合大香蕉| 丝袜脚勾引网站| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 韩国av在线不卡| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 综合色丁香网| h视频一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 视频在线观看一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美软件 | 搡老乐熟女国产| 亚洲少妇的诱惑av| 国产日韩欧美在线精品| 岛国毛片在线播放| 国产精品人妻久久久影院| 伊人久久国产一区二区| 国产一区二区三区综合在线观看 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一二三四在线观看免费中文在 | 久久久亚洲精品成人影院| 精品少妇内射三级| 亚洲,欧美精品.| 一级毛片电影观看| 美女中出高潮动态图| 亚洲美女视频黄频| 99热全是精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 日韩三级伦理在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 又黄又粗又硬又大视频| 九九爱精品视频在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 涩涩av久久男人的天堂| 国产免费一级a男人的天堂| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产欧美亚洲国产| 国产精品欧美亚洲77777| 高清在线视频一区二区三区| 在线天堂最新版资源| 观看美女的网站| h视频一区二区三区| 观看av在线不卡| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美xxⅹ黑人| 国产片特级美女逼逼视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 一级毛片我不卡| 成年美女黄网站色视频大全免费| 久久人人爽人人片av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日本av手机在线免费观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 美女国产高潮福利片在线看| 日本午夜av视频| 一级爰片在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 性色avwww在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 18禁观看日本| 午夜激情久久久久久久| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 97在线视频观看| 一二三四在线观看免费中文在 | 亚洲国产精品999| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 两个人看的免费小视频| 国产成人一区二区在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 久久精品国产综合久久久 | 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲精品一区蜜桃| 久久毛片免费看一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品一品国产午夜福利视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 在线观看人妻少妇| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美日韩精品成人综合77777| 免费黄网站久久成人精品| 视频在线观看一区二区三区| 香蕉精品网在线| 日本vs欧美在线观看视频| 国产成人精品一,二区| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久精品免费免费高清| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲在久久综合| 国产精品久久久久久av不卡| 成人亚洲欧美一区二区av| 老司机亚洲免费影院| 男女边摸边吃奶| 激情视频va一区二区三区| 中文字幕人妻熟女乱码| 97在线人人人人妻| 国产激情久久老熟女| 另类亚洲欧美激情| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 黑丝袜美女国产一区| 天堂中文最新版在线下载| 我要看黄色一级片免费的| 永久网站在线| 午夜91福利影院| 亚洲,欧美,日韩| 男男h啪啪无遮挡| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日本午夜av视频| 免费黄频网站在线观看国产| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 中国国产av一级| 国产在线视频一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 日本黄大片高清| 麻豆乱淫一区二区| 视频区图区小说| 国产又爽黄色视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 九草在线视频观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产1区2区3区精品| 国产有黄有色有爽视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久久久人人人人人| 五月玫瑰六月丁香| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 大话2 男鬼变身卡| 另类精品久久| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久99热这里只频精品6学生| 大陆偷拍与自拍| 国产在视频线精品| 18在线观看网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美人与善性xxx| videossex国产| 男女边摸边吃奶| 免费黄网站久久成人精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 捣出白浆h1v1| 亚洲四区av| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 多毛熟女@视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 黄色毛片三级朝国网站| 日本黄大片高清| 亚洲精品中文字幕在线视频| 26uuu在线亚洲综合色| 在线观看人妻少妇| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 伦理电影大哥的女人| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久99一区二区三区| 三级国产精品片| 成人国产av品久久久| 99香蕉大伊视频| 男女午夜视频在线观看 | 欧美激情 高清一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久久久久久久久大奶|