基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的茯苓甘草湯治療腹水的作用機(jī)制研究

郭利偉，劉佳麗，黃琪，余捷，朱依玲，李亞娜，陳靜

長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025

茯苓甘草湯處方源自東漢張仲景所著《傷寒論》，屬祛濕方。該方由茯苓、桂枝、甘草、生姜4味中藥組成，具有溫胃散飲、通陽行水之功效，用于胃虛水停導(dǎo)致的腹水，主癥心悸、汗出不渴、小便不利[1]。目前，針對茯苓甘草湯的文獻(xiàn)報(bào)道多為其用于治療肝硬化腹水和冠心病的臨床觀察[2-4]，而關(guān)于其發(fā)揮通陽行水功效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機(jī)制尚未見報(bào)道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基因組學(xué)、拓?fù)鋵W(xué)、計(jì)算組學(xué)等多學(xué)科、多技術(shù)的結(jié)合運(yùn)用，在方法學(xué)上具有集整體、動態(tài)、分析于一體的特點(diǎn)，與中藥復(fù)方通過君臣佐使多味中藥協(xié)同作用有異曲同工之妙，強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)性和整體性[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在闡明中藥及其復(fù)方制劑的藥效成分及作用機(jī)制方面具有傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)勢。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對茯苓甘草湯中多個(gè)化合物進(jìn)行了作用靶點(diǎn)和通路預(yù)測，通過構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路-藥理作用-功效”網(wǎng)絡(luò)預(yù)測茯苓甘草湯治療腹水的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與分析平臺

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)：https://tcmspw.com/tcmsp. php；Uniprot數(shù)據(jù)庫：https://www.uniprot.org；Drugbank數(shù)據(jù)庫：https://go.drugbank.com；Genecards數(shù)據(jù)庫：https://www.genecards.org；String數(shù)據(jù)庫：https://www.string-db.org；David數(shù)據(jù)庫：https://david.ncifcrf.gov；PDB數(shù)據(jù)庫：http://www.rcsb.org/；Pubchem數(shù)據(jù)庫：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/。

1.2 茯苓甘草湯活性成分篩選及其靶點(diǎn)的獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)預(yù)測茯苓甘草湯中茯苓、桂枝、生姜、甘草4味中藥中總化學(xué)成分的吸收、分布和代謝。以生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，并去除重復(fù)的化合物，篩選出高活性化合物。

1.3 茯苓甘草湯有效成分靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化

依據(jù)篩選出的關(guān)鍵化合物通過TCMSP獲取相應(yīng)的靶點(diǎn)，設(shè)置物種為Homo sapiens，再通過Uniprot數(shù)據(jù)庫和Drugbank數(shù)據(jù)庫聯(lián)合搜索獲取靶點(diǎn)的Symbol簡稱。

1.4 腹水疾病相關(guān)靶點(diǎn)獲取并篩選與藥物共有靶點(diǎn)

以“Ascites”為關(guān)鍵詞，搜索Genecards數(shù)據(jù)庫，獲得腹水疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將篩選出的藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)繪制韋恩圖。取兩者交集靶點(diǎn)和1.2中篩選的藥物成分，使用Cytoscape軟件繪制“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并使用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?/p>

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

將藥物疾病共有靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建，生物背景設(shè)定為Homo sapiens，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，并將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape中，使用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治觯?gòu)建有效成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO富集分析與KEGG通路富集分析

將藥物治療疾病潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫，設(shè)置生物背景為Homo sapiens，進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cell component，CC)富集分析；根據(jù)京都基因與基因組百科全書(Kyoto-Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析，并繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.7 分子對接驗(yàn)證

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，隨機(jī)選取部分成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)和PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)，與成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的核心成分中度中心性較高的前10種化合物，并分別在PDB數(shù)據(jù)庫獲取相應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白3D模型和Pubchem數(shù)據(jù)庫獲取藥物分子3D模型，然后使用SYBYL-X軟件進(jìn)行分子對接，獲取總分?jǐn)?shù)(total score)值，分值高低表示靶點(diǎn)蛋白與小分子化合物的結(jié)合活性，當(dāng)分值≥4.25，說明分子與靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合活性；分值≥5，說明有較好的結(jié)合活性[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物活性成分篩選及其靶點(diǎn)的獲取

利用TCMSP獲取茯苓甘草湯的總成分，其中茯苓34種，桂枝220種，生姜265種，甘草280種化合物，依據(jù)生物利用度≥30%和類藥性≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)，并去除重復(fù)化合物，共獲得117種高活性關(guān)鍵化合物(見表1)，對應(yīng)了252個(gè)靶點(diǎn)。

表1 茯苓甘草湯篩選后的有效成分Table 1 Active ingredients in Fuling Gancao decoction after screening

(續(xù)表1)

2.2 腹水疾病相關(guān)靶點(diǎn)獲取及與藥物共有靶點(diǎn)

查詢上述117個(gè)高活性化合物的252個(gè)靶點(diǎn)信息，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫和Drugbank數(shù)據(jù)庫聯(lián)合搜索獲取到基因的Symbol名和UniprotID。在Genecard數(shù)據(jù)庫以“Ascites”為關(guān)鍵詞獲取到腹水相關(guān)靶點(diǎn)共計(jì)2848個(gè)，與藥物高活性化合物交集的靶點(diǎn)共計(jì)115個(gè)(見圖1)。

圖1 茯苓甘草湯靶點(diǎn)與腹水靶點(diǎn)的韋恩圖 Fig.1 Venn diagram of targets of Fuling Gancao decoction and ascites

2.3 高活性成分-疾病藥物共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

將高活性成分、疾病藥物共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，設(shè)置節(jié)點(diǎn)與邊線，將其互作關(guān)系繪制成可視化“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。使用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治觯罁?jù)度中心性(Degree)、接近中心性(Closeness Centrality)、中介中心性(Betweenness Centrality)大于等于其中位數(shù)，平均最短路徑長度(Average Shortest Path Length)小于等于其中位數(shù)的規(guī)則篩選核心成分和核心靶點(diǎn)，核心成分有42個(gè)，包含有槲皮素(quercetin)、β谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、刺芒柄花素(formononetin)、柚皮素(naringenin)、異鼠李素(isorhamnetin)、美迪紫檀素(Medicarpin)、甘草查爾酮A(licochalcone a)等，核心靶點(diǎn)有72個(gè)，包含有PTGS2、ESR1、nos、F7、TRPV6、HSP90AB1、AR、PPARG、ARAF、PRSS1等(見圖3)。

注：綠色三角形是疾病與藥物的共同靶點(diǎn)，藍(lán)色圓形是高活性成分，并依據(jù)中心性設(shè)置圖形大小。圖2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Component-target network diagram

圖3 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中的核心靶點(diǎn)Fig.3 The core target of “component-target” network diagram

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

將疾病藥物共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，設(shè)置生物背景為Homo sapiens，篩選評分大于等于0.9的蛋白互作關(guān)系，建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，除去沒有互作關(guān)系的蛋白(見圖4)。該網(wǎng)絡(luò)包含98個(gè)節(jié)點(diǎn)，411條互作關(guān)系。其中評分大于等于0.99的互作關(guān)系有79條，包含AKT1-GSK3B、BAD-BCL2L1、BCL2L1-TP53、BCL2L1-CASP8、CASP3-CASP8、CCNA2-CDK4、CCNA2-CDK2、CCNA2-CDKN1A、CCND1-CDKN1A、CCND1-CDK2等。數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件并使用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治觯罁?jù)度中心性、接近中心性、中介中心性大于等于其中位數(shù)，平均最短路徑長度小于等于其中位數(shù)的規(guī)則篩選出核心靶點(diǎn)，共計(jì)33個(gè)(見圖5)。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network diagram

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的核心靶點(diǎn) Fig.5 The core target of PPI network diagram

2.5 GO富集分析

將疾病藥物共有靶點(diǎn)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫，設(shè)置生物背景為Homo sapiens，進(jìn)行GO的生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)富集分析，篩選P≤0.05的項(xiàng)目，得到398項(xiàng)生物過程，38項(xiàng)細(xì)胞組分，83項(xiàng)分子功能，選取各部分P值最小的前10項(xiàng)繪制柱狀圖，如圖6所示。

圖6 GO富集分析結(jié)果Fig.6 The results of GO enrichment analysis

2.6 KEGG通路富集分析

將疾病藥物共有靶點(diǎn)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫，設(shè)置生物背景為Homo sapiens，進(jìn)行KEGG通路富集分析，篩選P≤0.05的項(xiàng)目，共計(jì)富集到108條信號通路，選取P值最小的前30項(xiàng)繪制氣泡圖，如圖7所示。

圖7 KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.7 The results of KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子對接結(jié)果

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，選取“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)和PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)均包含的13個(gè)靶點(diǎn)PTGS2、ESR1、AR、BCL2、JUN、CASP3、CASP8、CXCL8、AKT1、TNF、STAT5B、CCND1、RB1，與“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的核心成分中度中心性較高的前10項(xiàng)槲皮素、β谷甾醇、山奈酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)、刺芒柄花素、柚皮素、異鼠李素、美迪紫檀素、甘草查爾酮A、2-[(3R)-8,8-dimethyl-3, 4-dihydro-2H-pyrano [6,5-f]chromen-3-yl] -5-methoxyphenol、豆甾醇(Stigmasterol)，將分子對接結(jié)果繪制熱圖，如圖8所示?？偣策M(jìn)行了120次分子對接，其中分值<4.25的占9.6%；分值≥4.25且<5的占12.8%；分值≥5的占77.6%。選取的超過90%的靶點(diǎn)蛋白與化合物分子都具有一定的結(jié)合活性，進(jìn)一步佐證了基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)辨識有效成分的可靠性。

注：總評分<4.25為白色，4.25～5之間為黃到綠色漸變，≥5為綠到黑色漸變。圖8 分子對接結(jié)果熱圖Fig.8 Heat map of molecular docking results

3 討論

茯苓甘草湯主治心下停飲、心悸、汗出不渴、小便不利、咳而遺溺、奔豚，在臨床上常用于腹水的治療。但茯苓甘草湯現(xiàn)有藥理研究基礎(chǔ)薄弱，急需以茯苓甘草湯處方為研究對象，展開物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究，并建立兩者的關(guān)聯(lián)性，尋找藥物的作用靶點(diǎn)，對其代謝途徑、信號通道等作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，同時(shí)結(jié)合作用機(jī)制，論證有效物質(zhì)基礎(chǔ)，從而使茯苓甘草湯成分明確、藥效可靠、機(jī)制清楚，闡明化飲、利水的科學(xué)內(nèi)涵。

“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，茯苓甘草湯治療腹水是其中多種活性成分協(xié)同作用的結(jié)果，如槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、刺芒柄花素、柚皮苷等，這與目前基礎(chǔ)及臨床研究的結(jié)果相似，證明了本研究預(yù)測結(jié)果的可靠性[7-14]。ANWER等[7]制備了槲皮素PLGA聚合物納米顆粒，使槲皮素的體內(nèi)吸收得到了優(yōu)化，表現(xiàn)出良好的體內(nèi)利尿活性。β-谷甾醇具有抗微生物、抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)作用[8]，山奈酚是一種類黃酮，可以治療多種急性慢性炎癥、多種肝損傷疾病、抑制血管內(nèi)皮炎等[9]，刺芒柄花素可減輕腎損傷，用于腎病治療[10,11]，柚皮苷具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用和利尿作用，可用于肝臟疾病的治療[12-14]。而腹水常并發(fā)于各種肝病、腎病，茯苓甘草湯的上述活性成分可能是其治療腹水的物質(zhì)基礎(chǔ)，該結(jié)果有待進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證。

在“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)的分析中PTGS2、BCL2、JUN、CASP3、CASP8、CXCL8、AKT1等被預(yù)測為關(guān)鍵靶點(diǎn)。PTGS2與炎癥反應(yīng)有關(guān)，是包括阿司匹林在內(nèi)的非甾體抗炎藥的主要靶點(diǎn)之一[15]。BCL2可以抑制多種細(xì)胞的凋亡[16]。JUN在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育分化中起重要作用[17,18]。CASP3與CASP8都屬于細(xì)胞凋亡的分子開關(guān)，MA等[19]發(fā)現(xiàn)熊果酸可以通過調(diào)控CASP3抑制肝細(xì)胞凋亡來減輕酒精造成的肝損傷，WANG等[20]發(fā)現(xiàn)靶向CASP8藥物可以治療非酒精性脂肪性肝炎。CXCL8是一種趨化因子，在炎癥介質(zhì)的激活、運(yùn)輸以及癌癥的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中至關(guān)重要[21]。AKT1可以調(diào)節(jié)多種生物過程，如代謝、細(xì)胞增殖、生長、血管生成等，REYES-GORDILLO等[22]發(fā)現(xiàn)AKT1在調(diào)節(jié)酒精性肝炎及纖維化的發(fā)展中起重要作用。

GO富集分析顯示，生物學(xué)功能除了如對藥物(GO:0042493)和毒物(GO:0009636)反應(yīng)等這類正常應(yīng)激外，主要涉及到如凋亡負(fù)調(diào)節(jié)(GO:0043066)、血管生成(GO:0001525)、平滑肌細(xì)胞增殖(GO:0048661)、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(GO:0045893)、細(xì)胞遷移正調(diào)控(GO:0030335)、器官再生(GO:0031100)等對機(jī)體損傷的修復(fù)性調(diào)節(jié)，以及如炎癥反應(yīng)(GO:0006954)、促進(jìn)一氧化氮合成(GO:0045429)、對雌二醇的反應(yīng)(GO:0032355)、對脂多糖的反應(yīng)(GO:0032496)等這類對炎癥過程的調(diào)控。

KEGG通路富集分析顯示，茯苓甘草湯治療腹水主要涉及到的通路有HIF-1通路(hsa04066)、TNF通路(hsa04668)、PI3K-Akt通路(hsa04151)等。ZHANG等[23]發(fā)現(xiàn)HIF-1通路可以調(diào)節(jié)腎臟水和電解質(zhì)的平衡，抑制腎髓質(zhì)中的HIF-1α表達(dá)有抗利尿的效果。LU等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以調(diào)節(jié)活性氧水平，抑制PI3K-Akt通路所調(diào)控的Caspase-3和NF-κB激活，控制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善高果糖喂養(yǎng)小鼠的動脈粥樣硬化的發(fā)展。PITALOKA等[25]發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺可以通過PI3K-Akt通路，影響高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的肝的糖原分解和糖原異生，調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。TNF信號通路涉及到細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫等[26-28]。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析茯苓甘草湯治療腹水的作用機(jī)制是通過多種活性成分作用于多靶點(diǎn)、多通路產(chǎn)生了利尿、調(diào)控炎癥過程、調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)細(xì)胞增殖、修復(fù)肝損傷等的綜合效果，該結(jié)果可為后續(xù)深入研究茯苓甘草湯治療腹水的藥理機(jī)制提供參考。