甘薯IbERF071基因的克隆及表達(dá)特性分析

徐樂，陳培茹,，劉意,，焦春海，雷劍，王連軍，柴沙沙，靳曉杰，楊園園，程賢亮，楊新筍，張文英

1. 長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025 2. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，湖北 武漢 430064

甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)是旋花科(Convolvulaceae)六倍體作物(2n=6×=90，B1B1B2B2B2B2)，它不僅營養(yǎng)豐富，而且具有多種保健功能及藥用價(jià)值，是世界第七大糧食作物、我國第四大糧食作物[1]。近年來，我國甘薯產(chǎn)業(yè)規(guī)模日益擴(kuò)大，目前栽培面積和總產(chǎn)量均位居全球首位[2]。然而，甘薯病害的發(fā)生制約了甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中，甘薯蔓割病又稱鐮刀菌枯萎病(Fusariumoxysporumf.batatas)，是世界甘薯產(chǎn)區(qū)的主要病害之一，嚴(yán)重影響了甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[3,4]。因此，研究甘薯抗蔓割病分子機(jī)制對(duì)于培育甘薯抗蔓割病新品種具有重要的意義。

乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子(ethylence-responsive element binding factor，ERF)屬于AP2/ERF超級(jí)家族(AP2/ERF superfamily)中的ERF亞族，含有一個(gè)高度保守的由58或59個(gè)氨基酸殘基組成的AP2結(jié)構(gòu)域，具有典型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，保證ERF與GCC-box DNA序列相互作用，參與植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[5-7]。大量研究表明，AP2/ERF超級(jí)家族中的ERF轉(zhuǎn)錄因子在抗鐮刀菌枯萎病(真菌病原體)中發(fā)揮重要作用。ERF轉(zhuǎn)錄因子通過與下游啟動(dòng)子中的順式作用元件結(jié)合，激活下游多個(gè)防衛(wèi)基因如致病相關(guān)PR(Pathogenesis-related gene)基因的表達(dá)量以增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性[8]。WANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，野生葡萄VaERF20基因在擬南芥植株中可以誘導(dǎo)抗病基因的表達(dá)，從而提高植株對(duì)丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringaepv.tomato)和灰霉菌(B.cinerea)的抗性；ZHANG等[10]研究發(fā)現(xiàn)油桐中異源過表達(dá)VmAP2/ERF036，可以增強(qiáng)油桐對(duì)茄枯萎病病菌(Fusariumoxysporum)的抗性。ERF1的過表達(dá)增強(qiáng)擬南芥對(duì)壞死性病原體的抗性，如灰霉菌(B.cinerea)、茄枯萎病病菌[11]?；贏P2/ERF超級(jí)家族在調(diào)節(jié)植物抗病防御過程中的重要作用，已在大豆[12]、蘋果[13]、水稻[14]、木薯[15]、棉花[16]、柑橘[17]、本氏煙草[18]、棗[19]等多種植物中進(jìn)行了研究。目前，關(guān)于甘薯中AP2/ERF基因的研究較少。甘薯AP2/ERF基因IbRAP2-12可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性和耐旱性的作用[20]。甘薯響應(yīng)蔓割病菌侵染轉(zhuǎn)錄組分析后發(fā)現(xiàn)甘薯中大量與乙烯相關(guān)基因被上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，且上調(diào)表達(dá)的基因多于下調(diào)表達(dá)[21]。在干旱、鹽脅迫和ABA處理后，甘薯IbERF3基因在根和葉片中表達(dá)量都顯著上升[22]。IbERF71可與IbMYB340以及IbbHLH2組成復(fù)合體與IbANS1啟動(dòng)子結(jié)合來共同調(diào)節(jié)花青素的生物合成[23]。

目前有關(guān)ERF轉(zhuǎn)錄因子在甘薯抗蔓割病研究中還未見報(bào)道。研究以高抗蔓割病甘薯品種‘鄂薯11’為試驗(yàn)材料，克隆獲得1個(gè)編碼乙烯應(yīng)答的基因IbERF071，并利用生物信息學(xué)方法，分析其蛋白理化性質(zhì)、預(yù)測蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)、比較氨基酸同源性和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并利用RT-PCR分析IbERF071基因在鐮刀菌枯萎病病菌(Fusariumoxysporumf.batatas)、茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯利(ETH)處理下不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步探索甘薯IbERF071基因在植物抗病中的功能提供科學(xué)依據(jù)，為甘薯抗蔓割病品種篩選和育種提供新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為高抗蔓割病甘薯品種‘鄂薯11’，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所自主選育。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌處理

將鐮刀菌枯萎病病菌接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，置于28℃、200r/min的搖床上避光震蕩一周左右，將菌液孢子濃度調(diào)至1×107孢子/mL備用。在田間剪取主莖頂部16cm莖段，選取長勢一致的健康植株，用裝有無菌水的三角瓶(100mL)培養(yǎng)1d，然后轉(zhuǎn)入鐮刀菌枯萎病菌液中持續(xù)侵染，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(28℃，光周期：16h光照，8h黑暗)，處理0、2、4、12、24、48、72h后取甘薯苗的莖部(4cm)，液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.2.2 激素處理

在田間剪取長勢一致、健康薯苗主莖頂部約16cm莖段，置于1/2霍格蘭營養(yǎng)液中生長1周，選取生長狀態(tài)一致的健康植株，然后分別浸入含有0.1mmol/L茉莉酸甲酯和0.05mmol/L乙烯利的1/2霍格蘭溶液中。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(28℃，光周期：16h光照，8h黑暗)，處理0、2、4、12、24、48、72h后取甘薯苗的莖部(4cm)，液氮速凍后保存至-80℃超低溫冰箱備用。

1.2.3 總RNA提取和IbERF071基因克隆

以‘鄂薯11’為材料，使用天漠生物的小量總RNA提取試劑盒提取總RNA，用TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)試劑盒(全式金，中國)合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。在甘薯栽培種六倍體基因組數(shù)據(jù)庫(https://ipomoea-genome.org/)中blast獲得該基因的編碼區(qū)(CDS)序列。利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)該序列的特異性引物，正向引物序列為5′-ATGTGTGGGGGTGCAATCCT-3′，反向引物序列為5′-TTAGGCACAGCTGGGATTGA-3′。利用PCR擴(kuò)增試劑盒TaKaRa La Taq?(TaKaRa，日本)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系總體積50μL，包含cDNA模板2μL、2.5mol/L dNTPs 8μL、LATaq聚合酶0.5μL、10×buffer(Mg2+)5μL、10μmol/L正向引物1.0μL、10μmol/L反向引物1.0μL和蒸餾水32.5μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、55℃退火1min、72℃延伸1.5min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖電泳分離，用DNA回收試劑盒EasyPure?Quick Gel Extraction Kit(全式金，中國)將目的片段回收、純化；利用pMDTM19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa，日本)試劑盒進(jìn)行載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)(全式金，中國)，陽性克隆篩選，送至奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司(武漢)進(jìn)行測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI的BLASTx(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)功能，檢索與IbERF071基因編碼的氨基酸序列的同源序列，利用DNAMAN 6.0軟件對(duì)同源氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)；使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建同源序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(neighbor-joining，bootstrap值為1000)；在ExPASy程序(https://web.expasy.org/protparam/)分析IbERF071基因編碼的氨基酸序列的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；用SMART程序(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測IbERF071基因編碼的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域；用SOPMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL程序(https://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測IbERF071蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；用TMpred程序(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預(yù)測IbERF071蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)使用Cell-PLoc 2.0程序(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)預(yù)測該蛋白的亞細(xì)胞定位。用Plant CARE程序(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動(dòng)子順式作用元件，并利用GSDS 2.0在線工具(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪圖。

1.2.5 RT-PCR擴(kuò)增

利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)IbERF071基因的熒光定量特異性引物，正向引物IbERF071-F序列為5′-TACCGCCTCCAACTGCTCC-3′，反向引物IbERF071-R序列為5′-TCCCCCAAGGTCGCTGC-3′；以β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，正向引物序列為5′-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3′，反向引物序列為5′-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3′。參照PerfectStart?Green qPCR SuperMix試劑盒(全式金，中國)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品3次重復(fù)。利用BIO-RAD CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)體系總體積為10μL，包含cDNA模板1μL、PerfectStart?Tip Green qPCR SuperMix 5μL、10μmol/L正向引物0.4μL、10μmol/L反向引物0.4μL和Nuclease-free water 3.2μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性30s；94℃變性5s、58℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法[24]計(jì)算各樣品中基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 IbERF071基因的克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1IbERF071基因的克隆

以‘鄂薯11’cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條CDS序列為864bp的目的片段(見圖1)，片段長度與預(yù)期結(jié)果一致，在NCBI在線數(shù)據(jù)庫中對(duì)測序序列進(jìn)行blastp，其與ERF071基因同源性最高，這與NR數(shù)據(jù)庫注釋信息吻合，因此將其命名為IbERF071。IbERF071基因共編碼287個(gè)氨基酸；在其氨基酸序列的第79至第142位包含1個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域和第205至第254位包含1個(gè)卷曲螺旋，說明IbERF071轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF超級(jí)家族。

注： M—DNA maker; 1—IbERF071。 圖1 甘薯IbERF071基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 Fig.1 Results of PCR amplification of IbERF071 gene from sweet potato

2.1.2 氨基酸序列多重比對(duì)和同源性分析

多重比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(見圖2)表明，甘薯IbERF071基因與牽牛(Ipomoeanil)的氨基酸序列聚為一支、相似度高達(dá)89%以上，親緣關(guān)系最近；而與其他物種，如芝麻(Sesamumindicum)、原野菟絲子(Cuscutacampestris)、煙草(Nicotianatabacum)、燈籠椒(Capsiumbaccatum)、油橄欖(Oleaeuropaea)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、甜瓜(Cucumismel)、番茄(Solanumlycopersicum)和陸地棉(Gossypiumhirsutum)等，它們的ERF蛋白的氨基酸序列明顯分離，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。同時(shí)，甘薯IbERF071基因與擬南芥ERF家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果(見圖3)顯示：IbERF071基因在進(jìn)化關(guān)系上與AtERF1G基因(AT1G72360.1)接近。

注：IbERF—甘薯;InERF—牽牛(XP_019163870);CcERF—原野菟絲子(VFQ59607);NaERF—煙草(XP_019247451);OeERF—油橄欖(XP_022891565);SiERF—芝麻(XP_011079624);StERF—馬鈴薯(NP_001275232);CbERF—燈籠椒(PHT38746);CmERF—甜瓜(NP_001306244);GhERF—陸地棉(XP_040958415.1);SlERF—番茄(AAO34704)。圖2 甘薯IbERF071基因氨基酸序列的多重比對(duì)及同源性分析Fig.2 Multiple alignment and homology analysis of the amino acid sequence of sweet potato IbERF071 gene

圖3 甘薯IbERF071基因與擬南芥AtERFs的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of sweet potato IbERF071 gene and Arabidopsis AtERFs

2.1.3 IbERF071蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測和理化性質(zhì)分析結(jié)果(見圖4)顯示，IbERF071蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪系數(shù)和總親水性平均系數(shù)分別為48.26、47.35和-1.003，分子質(zhì)量為32215.31ku，等電點(diǎn)為5.12，表明IbERF071蛋白是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件為隨機(jī)卷曲和α螺旋，IbERF071蛋白含有61.67%的隨機(jī)卷曲、26.83%的α螺旋、8.01%的延伸鏈和3.48%的β轉(zhuǎn)角，它們間次分散在整個(gè)蛋白質(zhì)序列中；在該蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，22%的氨基酸殘基結(jié)構(gòu)置信度達(dá)到64.06%；亞細(xì)胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果表明，IbERF071蛋白定位在細(xì)胞核中，沒有跨膜蛋白且不存在跨膜螺旋區(qū)，表明IbERF071蛋白不能進(jìn)行跨膜運(yùn)輸。

圖4 甘薯IbERF071蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.4 Prediction result of structure of IbERF071 protein from sweet potato

2.1.4IbERF071基因啟動(dòng)子區(qū)的功能分析

利用甘薯栽培種六倍體基因組數(shù)據(jù)庫(https://ipomoea-genome.org/)的序列信息，獲得IbERF071基因5′端上游2000bp啟動(dòng)子序列，分析結(jié)果表明(圖5)，IbERF071基因啟動(dòng)子序列包含多種與抗逆相關(guān)的順式作用元件：①典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件CAAT-box和TATA-box；②光響應(yīng)元件G-box、TCCC-motif、Box 4、ATC-motif、ATCT-motif、ACE、AT1-motif和Chs-unit 1m1；③脅迫響應(yīng)元件MYB、AAGAA-motif、W box和MYB-like sequence；④茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif；⑤低溫響應(yīng)元件MYC；⑥干旱誘導(dǎo)元件ERE；⑦脫落酸效應(yīng)元件ABRE；⑧植物防御響應(yīng)元件as-1；⑨水楊酸響應(yīng)元件TCA element;⑩創(chuàng)傷響應(yīng)元件WUN-motif;MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS和缺氧特異性誘導(dǎo)中的類增強(qiáng)因子(ARE)等30種順式作用元件。

圖5 在甘薯IbERF071基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件的分布順序Fig.5 The distribution order of regulatory element in promoter region of IbERF071 gene from sweet potato

2.2 甘薯IbERF071基因的表達(dá)特異性分析

2.2.1IbERF071基因表達(dá)的組織特異性

供試甘薯品種‘鄂薯11’的根、莖、葉中IbERF071基因的相對(duì)表達(dá)量如圖6所示。結(jié)果顯示，IbERF071基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，其根中表達(dá)量最高，且在根中表達(dá)量顯著(P<0.05)高于莖、葉，說明IbERF071基因在植物抗病防御過程中具有組織特異性。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖7、圖8同。圖6 甘薯不同組織中IbERF071基因表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of IbERF071 gene in different tissues of sweet potato

2.2.2 蔓割病菌侵染對(duì)IbERF071基因表達(dá)的影響

利用RT-PCR技術(shù)，檢測‘鄂薯11’接種蔓割病菌后IbERF071基因相對(duì)表達(dá)量的變化。結(jié)果(見圖7)表明，在蔓割病原菌侵染下，IbERF071基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照(處理0h)都顯著增加且2h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，為對(duì)照(處理0h)的2.78倍；2～24hIbERF071基因的表達(dá)量較脅迫2h后顯著降低；隨后表達(dá)量在24～72h時(shí)逐漸穩(wěn)定且無顯著差異。結(jié)果表明，IbERF071基因的表達(dá)量受到蔓割病菌的侵染影響且在脅迫早期進(jìn)行響應(yīng)，推測在甘薯響應(yīng)蔓割病菌脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)過程中，IbERF071基因在脅迫早期起著重要作用，可作為后續(xù)功能分析的候選基因。

圖7 蔓割病原菌侵染下不同脅迫時(shí)間IbERF071的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 The relative expression level of IbERF071Fusarium oxysporum f.batatas

2.2.3 植物激素MeJA和ETH誘導(dǎo)IbERF071基因表達(dá)

JA和ET信號(hào)途徑是植物重要的抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑。將16cm的甘薯莖部水培7d后，分別用0.1mmol/L MeJA以及0.05mmol/L ETH進(jìn)行處理。在0、2、4、12、24、48、72h進(jìn)行取樣并檢測莖中IbERF071的相對(duì)表達(dá)量(結(jié)果見圖8)。ETH處理48h時(shí)IbERF071表達(dá)量達(dá)到最高，為處理前的5.43倍，而后72h顯著下降，處理12h時(shí)的表達(dá)量顯著低于其他處理。MeJA處理12h到24h表達(dá)量顯著提高，并在72h達(dá)最大值，為處理前的6.59倍，其中2、4、48h處理無明顯差異。

圖8 IbERF071在激素MeJA和ETH處理后在莖中的表達(dá)模式Fig.8 The expression mode of IbERF071 in stem induced by hormones MeJA and ETH

3 討論與結(jié)論

甘薯蔓割病是中國南方薯區(qū)發(fā)生廣、危害重的真菌性維管束枯萎病，危害部位最初發(fā)生在莖基部，隨后地下部蔓莖縱裂，直至枯萎而死；一般減產(chǎn)10%～20%，重者達(dá)50%以上[3]。為了找到甘薯生產(chǎn)上蔓割病發(fā)生最根本、經(jīng)濟(jì)有效的解決方法，挖掘抗病基因、培育甘薯抗病品種是當(dāng)前最重要的任務(wù)之一。

已有研究表明，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物抵抗非生物逆境和生物逆境的過程中都發(fā)揮著重要作用[25-28]。ERF家族成員恰好處在植物防御相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的交叉點(diǎn)，通過對(duì)下游靶基因的調(diào)控發(fā)揮在植物逆境脅迫響應(yīng)的作用，但ERF家族成員在植物響應(yīng)不同逆境脅迫中的功能不盡相同[29]。該研究從高抗蔓割病甘薯品種‘鄂薯11’中克隆獲得的IbERF071基因，通過生物信息學(xué)分析，表明該基因CDS序列為864bp，編碼287個(gè)氨基酸，包含1個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域和1個(gè)卷曲螺旋，無跨膜區(qū)這與ERF056相似[30]。基于ERF基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中同屬種類物種聚在一起，且與牽牛的ERF基因編碼的氨基酸序列相似度達(dá)到89%以上。IbERF071蛋白序列與擬南芥AtERF家族成員進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示IbERF1071與AtERF071進(jìn)化關(guān)系較近，表明在進(jìn)化過程中親緣關(guān)系最近，氨基酸序列越相似，可能具有相似的功能。通過二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該基因含有61.67%的隨機(jī)卷曲、26.83%的α螺旋、8.01%的延伸鏈和3.48%的β轉(zhuǎn)角，這一比例與橡膠草(Taraxacumkok-saghyz)[31]ERF蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性相似，表明不同物種來源的ERF蛋白在二級(jí)結(jié)構(gòu)上也具有一定的保守性；在IbERF071基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)激素應(yīng)答和逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)的元件，這表明IbERF071基因可能參與甘薯防御病原體方面發(fā)揮重要作用。

植物在受到外界細(xì)菌、真菌、病毒等病原菌侵染時(shí)，涉及一系列應(yīng)答基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，受多種因素的誘導(dǎo)使植物產(chǎn)生抗性，如乙烯(ET)、茉莉酸(JA)、鹽堿、澇漬、低溫、病原菌侵染等[32-35]。研究發(fā)現(xiàn)，IbERF071基因在‘鄂薯11’的根、莖、葉中均可表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量存在明顯差異，說明IbERF071基因的表達(dá)具有組織特異性，這可能與甘薯不同部位響應(yīng)植物激素的誘導(dǎo)表達(dá)特異性有關(guān)。番茄4周幼齡葉片接種灰霉菌后，SlERF.A1基因表達(dá)在接種后48h出現(xiàn)最大值，表達(dá)量約為對(duì)照組的8倍[36]?！跏?1’在接種蔓割病菌后不同脅迫時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量也存在差異，0～2hIbERF071基因的表達(dá)量與對(duì)照組(處理0h)相比顯著增加，且2h時(shí)達(dá)到最高，為對(duì)照的2.78倍，表明IbERF071基因的表達(dá)量受蔓割病菌的誘導(dǎo)且在脅迫早期進(jìn)行響應(yīng)。JA和ET信號(hào)途徑是調(diào)控植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)的主要途徑，甘薯蔓割病抗性受JA信號(hào)途徑的正向調(diào)控[37]。JA和ET信號(hào)途徑均能快速激活乙烯反應(yīng)基因AtERF1的表達(dá)，并在該途徑交叉點(diǎn)的下游起作用[38]。熒光定量分析結(jié)果表明IbERF071基因受蔓割病病原菌、MeJA和ETH激素誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步推測甘薯IbERF071在甘薯抗蔓割病菌中的功能與JA/ET介導(dǎo)的激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的聯(lián)系較為密切，是JA/ET抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要轉(zhuǎn)錄因子。今后將利用超表達(dá)、基因沉默、基因敲除等分子技術(shù)對(duì)IbERF071基因進(jìn)行深入研究，探討該基因在甘薯抗蔓割病方面的分子防御功能。