氧化石墨烯和過渡金屬碳/氮化合物固定化酶

毛夢(mèng)雷，孫丹陽，孟子暉，劉文芳

（北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京 102488）

酶作為一種重要的生物催化劑，所催化的反應(yīng)具有條件溫和、高效性、專一性等優(yōu)點(diǎn)。但同時(shí)，游離酶穩(wěn)定性較差，無法長(zhǎng)期維持其催化活性，使得酶催化反應(yīng)工業(yè)化受限。固定化酶是通過物理或化學(xué)作用將酶固定在載體材料上的一種技術(shù)。通常，固定化酶的穩(wěn)定性較游離酶高，易于分離和重復(fù)利用，可降低生產(chǎn)成本。固定化載體和固定化方法是固定化酶技術(shù)的兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。通常，固定化方法視載體而定，包括包埋法、物理吸附法、共價(jià)連接法、交聯(lián)法等。載體的結(jié)構(gòu)、物理和化學(xué)性質(zhì)、表面官能團(tuán)的種類及數(shù)量都會(huì)影響酶的固定化。傳統(tǒng)的固定化載體包括海藻酸鈉、幾丁質(zhì)、殼聚糖、甲殼素、纖維素、淀粉等天然有機(jī)材料，聚氨酯、大孔樹脂等合成有機(jī)材料，硅膠、硅藻土、玻璃、二氧化硅、氧化鋁、介孔二氧化硅、介孔分子篩等無機(jī)材料，磁性高分子微球等復(fù)合材料。天然有機(jī)材料機(jī)械強(qiáng)度低、容易生物降解、壽命短、來源受產(chǎn)地限制；合成有機(jī)材料傳質(zhì)性能差、固定化酶的活性和穩(wěn)定性不高、操作步驟復(fù)雜、難度大。傳統(tǒng)無機(jī)材料具有結(jié)構(gòu)不易調(diào)整、表面官能團(tuán)匱乏等缺點(diǎn)。復(fù)合材料制備過程復(fù)雜，工藝要求高，成本高。因此，固定化酶技術(shù)仍面臨巨大挑戰(zhàn)。相較于傳統(tǒng)固定化酶載體，二維納米材料機(jī)械強(qiáng)度高、不會(huì)被生物降解、比表面積高、表面官能團(tuán)豐富、易與酶形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。二維納米材料的出現(xiàn)為固定化酶的進(jìn)一步發(fā)展帶來了曙光。

2004 年，石墨烯問世后，叩響了二維納米材料的大門。二維納米材料是指具有片狀結(jié)構(gòu)以及高度各向異性和化學(xué)功能的一類超薄納米材料。由于具有高的縱橫比、量子尺寸效應(yīng)和平面構(gòu)象，二維材料具有許多獨(dú)特的性能。例如，電子傳輸可限定在二維結(jié)構(gòu)內(nèi)；超薄的原子厚度和強(qiáng)的面內(nèi)化學(xué)鍵賦予材料高的機(jī)械強(qiáng)度、柔韌性和光學(xué)透明性；大的水平尺寸賦予材料超高的比表面積；材料表面大量的原子使得易于表面工程化，通過活性位點(diǎn)的構(gòu)建來增強(qiáng)材料自身的性能等。二維納米材料具有優(yōu)異的電學(xué)、光學(xué)、磁學(xué)、力學(xué)和化學(xué)性能，已廣泛應(yīng)用于電池、超級(jí)電容器、儲(chǔ)能、催化、吸附分離、傳感和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

到目前為止，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)百種二維材料，如石墨烯、硅烯、鍺烯、錫烯、硼烯、磷烯、砷烯、銻烯、鉍烯、鉿烯、氧化石墨烯（GO）、金屬氧化物、過渡金屬硫化物（TMDs）、過渡金屬氧化物（TMOs）、六方氮化硼（h-BN）、石墨相氮化碳（g-CN）、過渡金屬碳/氮化合物（MXenes）、層狀雙氫氧化物（LDHs）、二維金屬有機(jī)框架（MOFs）、二維共價(jià)有機(jī)框架（COFs）、金屬磷三鹵代物、雜化鈣鈦礦等。其中，GO作為開發(fā)較早的經(jīng)典二維材料，將其用于固定化酶的報(bào)道較多，而MXenes 作為新型二維材料的典型代表，近年來也受到越來越多的關(guān)注。從固定化酶的應(yīng)用角度來看，二者均具有高比表面積、大量的活性位點(diǎn)、良好的親水性以及生物相容性，是固定化酶的優(yōu)異載體。因此，本文選取這兩種材料，分別介紹它們的制備方法和結(jié)構(gòu)、物理和化學(xué)性質(zhì)，綜述近年來它們?cè)诠潭ɑ割I(lǐng)域的應(yīng)用研究，并進(jìn)行比較，最后指出存在的問題，對(duì)未來的發(fā)展方向提出展望。

1 氧化石墨烯

1.1 GO的制備方法和結(jié)構(gòu)

氧化石墨烯（GO）是以C、H、O 為主要元素組成的二維材料，由石墨烯經(jīng)化學(xué)氧化再剝離制得?；瘜W(xué)氧化法主要有Brodie法、Staudenmaier法、Hofmann 法、Hummers 法和Tour 法。這五種方法制得的GO的各元素含量、比表面積、層間距和層數(shù)列于表1。Brodie 法制得的GO中O元素所占百分?jǐn)?shù)最高，但是氧化劑中的發(fā)煙硝酸具有強(qiáng)腐蝕性，危險(xiǎn)且耗時(shí)長(zhǎng)，因此該法很少被利用。Tour法制得的GO的比表面積、層間距較大和剝離層數(shù)較少，并且安全快速，因而廣受歡迎。Brodie 法、Staudenmaier法和Hofmann法制得的GO中羥基含量更高，熱穩(wěn)定性高，官能團(tuán)在表面分布均勻。Hummers 法制得的GO 含有較多的酮基和羧基，導(dǎo)致石墨烯骨架的缺陷、空穴、碳碳鍵網(wǎng)絡(luò)的整體破壞等，因此官能團(tuán)在表面分布不均勻，并且酮基和羧基易分解，穩(wěn)定性較差。Tour 法改進(jìn)了Hummers法，去除了硝酸鈉，增加了高錳酸鉀的用量，添加了硫酸/磷酸混合物，極大地提高了氧化效率，因此表面的含氧官能團(tuán)含量更高，更易剝離?？傊煌难趸椒ㄖ频玫腉O 在組成、結(jié)構(gòu)、性能等方面具有明顯差異。

表1 各種氧化方法制得的GO的元素含量、比表面積、層間距和層數(shù)[28]

通常認(rèn)為GO中C有sp、sp兩種雜化方式，其中C==C 雙鍵以sp雜化方式存在，C—O—C 以sp雜化方式存在。由于GO具有非化學(xué)計(jì)量組成、多變和無序的含氧官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，人們提出了多種結(jié)構(gòu)模型，包括Hofmann 模型、Ruess 模型、Scholz-Boehm 模型、Nakajima-Matsuo 模型、Lerf-Klinowski 模型、Dekany 模型、Ajayan 模型等（圖1）。但這幾種模型也飽受爭(zhēng)議，仍需進(jìn)一步探索。

圖1 GO的結(jié)構(gòu)模型[27]

1.2 GO的物理和化學(xué)性質(zhì)

GO 具有高比表面積以及優(yōu)異的電子、光學(xué)、機(jī)械、熱穩(wěn)定性和鐵磁性等物理性質(zhì)。GO 表面豐富的含氧官能團(tuán)使其完美的晶格結(jié)構(gòu)被破壞，以致sp碳網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中π-π 電子遷移受阻。這種結(jié)構(gòu)缺陷及其原子結(jié)構(gòu)決定了GO的導(dǎo)電性質(zhì)，可通過控制GO 的氧化還原程度來調(diào)控其導(dǎo)電性。GO具有良好的電催化和高電容性。此外，通過電子、光子激發(fā)和化學(xué)修飾可以調(diào)控GO材料的發(fā)光性質(zhì)。GO 材料中致密的π-π 堆積使其表現(xiàn)出優(yōu)異的力學(xué)性能。GO 優(yōu)異的物理性質(zhì)使其在電池、催化、細(xì)胞成像、熒光傳感、生物醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域應(yīng)用廣受歡迎。

GO具有豐富的含氧官能團(tuán)，如羥基、環(huán)氧基、羧基、羰基、酚基、醚基、內(nèi)酯基、醌基等，其中環(huán)氧基、羥基位于面內(nèi)，少量羧基、羰基、酚基、醚基、內(nèi)酯基、醌基位于納米片邊緣。GO的含氧官能團(tuán)可與多種化學(xué)物質(zhì)通過共價(jià)鍵相連接，還可通過范德瓦爾斯鍵、氫鍵、π-π 作用、π-陽離子作用、疏水作用和靜電作用等吸附到GO材料的表面，有利于GO的共價(jià)和非共價(jià)功能化，從而拓寬GO 的應(yīng)用。此外，由于納米片容易聚集，在GO片層間引入表面活性劑、功能化聚合物、富含芳香族的分子和離子液體等穩(wěn)定劑，既可以克服納米片間的范德瓦爾斯作用，又可避免納米片堆疊。

1.3 GO固定化酶

GO 不僅具有高比表面積和優(yōu)異的熱穩(wěn)定性、機(jī)械穩(wěn)定性，還具有優(yōu)異的親水性、生物相容性、易功能化等特點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于傳感、固定化酶及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。固定化酶的途徑通常有兩種：一是共價(jià)結(jié)合法，即利用GO表面官能團(tuán)，通過共價(jià)作用將酶結(jié)合到GO材料表面；二是物理吸附法，一方面由于GO表面大量的含氧官能團(tuán)使其表面帶負(fù)電，可通過靜電吸附作用固定帶正電荷的酶，另一方面也可通過氫鍵、疏水作用、π-π 作用等固定化酶。

1.3.1 共價(jià)結(jié)合法

首先，由于GO 表面富含羥基，因此，可以先通過硅烷化在載體表面引入氨基，再通過戊二醛（GA）固定化酶。Hosseini Salekdeh 等首先用改進(jìn)的Hofmann 法制備GO，再引入Fe、Fe以磁性化；接著，用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）改性以引入氨基，再用GA活化；最后，通過共價(jià)鍵將模型酶PersiManXyn1 固定在改性的GO 材料上。酶被固定后，其構(gòu)象、剛度、活性位點(diǎn)改變使得其動(dòng)力學(xué)參數(shù)和均增大。固定化酶比活為1141.1U/mg，約為游離酶的1.333 倍。在50℃時(shí)，游離酶的活性最大，在20～70℃范圍內(nèi)，至少能保持最大活性的40%；固定化酶在50℃時(shí)的活性最大并且與游離酶差不多，在90℃時(shí)，活性仍為固定化酶活性最大值的35%以上。儲(chǔ)存4周后，游離酶基本失活，固定化酶的活性仍能保持初始值的54%。將固定化PersiManXyn1 用于催化還原亞甲基藍(lán)，循環(huán)利用15 次后，還原活性仍可達(dá)初始固定酶活力的94%以上。Kashefi 等采用類似方法固定漆酶，負(fù)載量達(dá)156.5μg/mg，固定化效率為64.6%。用于處理偶氮染料廢水，在6 次循環(huán)催化脫色后，脫色率仍達(dá)固定化酶初始效果的70%以上。在硅烷化改性前用表面活性劑修飾載體可以有效提高脂肪酶的活性。王艷娥等首先采用化學(xué)共沉積法制備磁性氧化石墨烯（MGO），再用Span系列表面活性劑功能化MGO，接著用APTES改性以引入氨基，再通過GA固定化褶皺假絲酵母脂肪酶（CRL）。經(jīng)表面活性劑修飾后，MGO 表面由親水性轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)疏水性，利用共價(jià)固定和疏水性界面活化同時(shí)作用，酶活性提高，固定化酶比活為32.5U/mg，固定化酶活回收率高達(dá)116.5%。在50℃時(shí)，游離酶和固定化酶的半衰期分別為3.8h 和10h。在儲(chǔ)存5 天后，游離酶活性約為初始酶活的30%，固定化酶活力幾乎無變化。在6次循環(huán)水解反應(yīng)后，固定化酶仍能保持首次使用時(shí)活性的73.6%。

其次，利用載體表面的羧基和酰胺化反應(yīng)來固定化酶也是一條常用路線。如果直接用GO表面的羧基與酶分子的氨基反應(yīng)，羧基的反應(yīng)活性不足，導(dǎo)致酶易從載體上脫落。通常采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和-羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化GO表面的羧基。Xie等首先用改良的Hofmann 法制備GO；接著，在堿性條件下將Fe、Fe通過化學(xué)共沉積法包裹進(jìn)GO中，制備MGO；然后，在EDC 和NHS 存在下固定化脂肪酶，見圖2。固定化酶效率和酶活回收率分別為85.5%和64.9%。在pH=7.0、30℃時(shí)，游離酶和固定化酶的活性最高。固定化酶熱穩(wěn)定性更好，在80℃時(shí)，游離酶幾乎無活性，固定化酶活性約為其在30℃時(shí)活性的50%。在40℃時(shí)，固定化酶可以高效催化大豆油與甲醇的酯交換反應(yīng)生成生物柴油，產(chǎn)率為92.8%，且循環(huán)使用5 次后，其活性基本不變。朱珣之等采用水熱沉積法制備含有—OH和—COOH 的MGO，再用交聯(lián)劑（,-亞甲基雙丙烯酰胺、三聚氰酰氯或戊二醛）固定果膠酶。其中，利用戊二醛固定的果膠酶活性最高，催化氧化還原糖量達(dá)約0.34mg/mL。戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)8%時(shí)，固定化效果最好，負(fù)載量達(dá)1453mg/g。超過50℃時(shí)，固定化酶仍可保持其在20℃時(shí)活力的40%以上。循環(huán)使用5次后，仍可達(dá)初始固定酶活力的58%。MGO 具有磁性，幾乎可以完全回收利用。

圖2 GO/Fe3O4納米復(fù)合材料的制備及其固定化脂肪酶的示意圖

再者，除了羥基和羧基之外，GO 表面還含有活潑的環(huán)氧基團(tuán)，在室溫下即可與脂肪族伯胺反應(yīng)。Monajati等采用天冬氨酸（Asp）功能化GO，使環(huán)氧開環(huán)的同時(shí)引入羧基和亞氨基，然后用羰基二咪唑（CDI）活化羧基固定天冬氨酸酶，見圖3。Asp對(duì)GO的預(yù)改性優(yōu)化了載體的分散性和穩(wěn)定性，同時(shí)，表面鈍化避免了酶在載體表面直接吸附，有利于保持酶活。在20℃、40℃和60℃時(shí)儲(chǔ)存24h后，酶活性分別為最初活性的100%、90.5%和40.6%。在8 次反應(yīng)循環(huán)后，固定化酶活性為初始酶活的42%，比游離酶高13%。

圖3 L-天冬酰胺酶在GO-天冬氨酸納米復(fù)合材料上的共價(jià)固定化示意圖[48]

1.3.2 物理吸附法

利用GO 表面帶負(fù)電的特點(diǎn)，可通過靜電吸附作用將帶正電荷的酶固定到GO材料上。此外，氫鍵的形成也有利于增強(qiáng)固定。辣根過氧化物酶（HRP）的等電點(diǎn)pI=7.2，Zhang 等認(rèn)為，在pH 4.8～7.2范圍內(nèi)時(shí)，帶正電的HRP與帶負(fù)電的GO通過靜電作用相結(jié)合；在pH 4.8～8.8范圍內(nèi)時(shí)，HRP的氨基酸殘基與GO表面的含氧官能團(tuán)之間以氫鍵相連接。因此，在pH=7 時(shí)，HRP 與GO 之間以多種力相連接，強(qiáng)化了酶的固定，酶負(fù)載量達(dá)100μg/mg。與HRP 類似，溶菌酶（pI=10.3）也可通過靜電作用、氫鍵等與載體結(jié)合，由于等電點(diǎn)較高，正電性較強(qiáng)，在pH=7 時(shí)，溶菌酶負(fù)載量高達(dá)700μg/mg。Besharati Vineh 等用HO還原GO，然后用HNNHCO修飾以引入氨基，再通過靜電、氫鍵等物理吸附作用固定HRP。還可只利用GO表面的疏水作用固定化酶，Mathesh 等用L-抗血酸還原GO，使GO 的芳香性部分還原，增強(qiáng)材料疏水性，再固定脂肪酶。

為了改善酶的穩(wěn)定性，也有人采用先包覆再吸附的方法固定化酶。Chen 等首先在-烯酰氧基琥珀酰亞胺（NAS）單體存在下采用原位自由基聚合法在有機(jī)磷水解酶（OPH）表面構(gòu)建含氨基聚合物殼層， 以形成帶正電荷的OPH 納米球（NOPH10）；然后，NOPH10 通過靜電作用吸附到帶負(fù)電荷的GO 表面，見圖4。在納米球制備過程中，OPH 的構(gòu)象發(fā)生變化，酶內(nèi)部疏水基活性增強(qiáng)，疏水作用為OPH固定的主要驅(qū)動(dòng)力。NOPH10聚合層中的—NH和GO 材料中的—OH 相互作用，使得催化效率提高，且可以適應(yīng)緩沖環(huán)境中pH 的變化，為酶提供相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境。NOPH10的殼層可以穩(wěn)定OPH 的構(gòu)象，保護(hù)酶結(jié)構(gòu)免受熱效應(yīng)的影響，故熱穩(wěn)定性大大提高。NOPH10@GO 在5次循環(huán)冷凍-解凍后仍可保持原活性的約75%，并且重復(fù)使用10 次后仍可保持原活性的90%以上?？蛇M(jìn)一步制成生物傳感器，檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥。

圖4 新型生物無機(jī)催化界面的構(gòu)建[51]

將GO 固定化酶的文獻(xiàn)匯總后列于表2。通過比較發(fā)現(xiàn)， 采用相同的路線固定模型酶PersiManXyn1和漆酶，前者的可重復(fù)利用性更高。因酶種類不同及反應(yīng)條件的差異，固定化脂肪酶的活力、穩(wěn)定性、可重復(fù)利用性較模型酶PersiManXyn1 差，但是可重復(fù)利用性略高于漆酶。GO經(jīng)Span系列表面活性劑和APTES硅烷偶聯(lián)劑改性后再固定脂肪酶，有利于酶活性的提高，比不使用表面活性劑的固定化酶高31%。經(jīng)Asp 修飾的GO 較改性之前含有更多的—COOH，因此，固定化天冬酰胺酶的效率高達(dá)100%。

表2 GO固定化酶的文獻(xiàn)匯總

除了GO 外，石墨烯和石墨炔也有少量報(bào)道。Seelajoen 等在EDC、NHS存在下，利用酰胺化反應(yīng)將甲醛脫氫酶（FaldDH）、 甲酸脫氫酶（FateDH）、乙醇脫氫酶（ADH）固定到羧基修飾的石墨烯表面。Wang 等通過非特異性吸附將柚皮苷酶固定到十二烷基硫酸鈉（SDS）修飾的石墨烯微反應(yīng)器上進(jìn)行生物催化。在50℃、pH=7 條件下，酶負(fù)載量達(dá)4mg/mg。經(jīng)SDS 表面活性劑修飾后，載體的分散性能得到改善，固定化酶與底物接觸更完全，轉(zhuǎn)化率比修飾前高60.66%；在10 次酶解反應(yīng)循環(huán)后，可保持固定化酶初始活性的85.5%。Liu 等將葡萄糖氧化酶（GOx）吸附在Fe修飾的石墨二炔（GDY）上，用于檢測(cè)血糖，在20～40℃時(shí)的活性可達(dá)pH=4.5、35℃時(shí)固定化酶最高活性的90%以上?？偟膩碚f，GO 是石墨烯的氧化衍生形式，二者結(jié)構(gòu)相似，但是GO表面含有更為豐富的官能團(tuán)，表面規(guī)整性、親水性、穩(wěn)定性等更加優(yōu)異。石墨炔與石墨烯是同素異形體，是一種具有sp 和sp雜化鍵的新型材料，含有丁二炔和苯環(huán)等特有結(jié)構(gòu)，目前研究還較少。

2 MXenes

2.1 MXenes的制備方法和結(jié)構(gòu)

MXenes 是一類新型碳/氮化物二維納米層狀材料，一般是利用化學(xué)刻蝕的手段通過選擇性刻蝕掉前體MAX 相中的A 原子層（A 主要為Ⅲ或Ⅳ族元素，如Al、Si、Sn 等）而得到，其通式可表示為MXT，其中M 代表早期過渡族金屬，X 代表碳和/或氮，T代表在刻蝕過程中產(chǎn)生的附著在其表面的官能團(tuán)（—OH、—F、==O、—O等）。有時(shí)也直接寫作MX，具有MX、MX、MX等六方晶格結(jié)構(gòu)，見圖5。由于多層MXenes經(jīng)超聲或者機(jī)械剝離后獲得的單層MXene 形貌與石墨烯（Graphene）類似，故被命名為MXene。自從2011 年第一種MXene 材料被發(fā)現(xiàn)以來，近年來發(fā)展迅速，已有超過70 個(gè)品種。MXenes 片層的厚度、表面過渡金屬和官能團(tuán)的多樣性，賦予了其優(yōu)異的光、電、磁、電化學(xué)性質(zhì)和親水性等，可用于光學(xué)、半導(dǎo)體、電池、電容器、催化、傳感、吸附分離、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

圖5 MAX相及相應(yīng)的MXenes的框架[55]

MXenes 主要采用刻蝕法制備，包括氫氟酸（HF）刻蝕、改性酸刻蝕、熔融氟鹽刻蝕、無氟刻蝕、氯氣刻蝕。在制備過程中，根據(jù)反應(yīng)條件的不同，MXenes 片層表面會(huì)形成不同的終端官能團(tuán)。表3 總結(jié)了常見的刻蝕方法所采用的試劑、所得材料表面主要的官能團(tuán)以及各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

表3 MXenes的幾種刻蝕方法[57,61-67]

HF刻蝕適用范圍廣，但HF酸性較強(qiáng)，刻蝕過程繁瑣且危險(xiǎn)，高濃度的HF、較長(zhǎng)的刻蝕時(shí)間、較高的反應(yīng)溫度都會(huì)導(dǎo)致材料表面缺陷，產(chǎn)率降低。相對(duì)來說，改性酸法條件更溫和一些，包括稀鹽酸和單氟化鹽溶液、二氟化鹽溶液。人們將稀鹽酸和LiF、NaF、KF、FeF等氟化鹽相結(jié)合進(jìn)行刻蝕，操作安全性得以改善，且制備步驟簡(jiǎn)便，陽離子插入層間使得制得的MXenes 具有更薄的層片 結(jié) 構(gòu)、更 大 的 層 間 距。NHHF、NaHF、KHF等二氟化鹽相較于稀鹽酸和單氟化鹽組合更安全，制得的MXenes 晶格結(jié)構(gòu)更完整。采用LiF、NaF、KF等熔融氟化鹽使MAX高溫分解制得MXenes 也是一條途徑，優(yōu)點(diǎn)是可以避免有的MXenes 材料（如TiN）在HF 中溶解，但是這樣制得的MXenes的結(jié)晶度較差。

以上幾種方法都采用含氟化合物，由于這類刻蝕劑具有腐蝕性和毒性，對(duì)人體以及環(huán)境具有較大危害，因此無氟刻蝕相對(duì)更安全、經(jīng)濟(jì)。Yang等開發(fā)了一種無氟電化學(xué)刻蝕方法，以NHCl和四甲基氫氧化銨（TMAOH）為電解質(zhì)，利用Al與Cl間的強(qiáng)化學(xué)鍵刻蝕掉TiAlC中的Al，NH還可以插入層間，層間距從17?增至21?，操作安全，反應(yīng)溫和，但制得的MXenes 為緊密堆積結(jié)構(gòu)，不同于以往的類手風(fēng)琴狀。還可用NaOH 刻蝕，但缺點(diǎn)是TiC骨架也會(huì)被腐蝕，這個(gè)過程雖然無氟，但是高溫高壓的反應(yīng)條件也比較危險(xiǎn)，另外，因刻蝕劑中無氟，所以材料表面也無—F 官能團(tuán)。氯氣刻蝕是另一種無氟刻蝕法，但M和A原子有可能會(huì)被完全刻蝕掉，生成孔隙豐富的碳化物衍生炭，因此，需要保持合適的反應(yīng)溫度以及刻蝕劑的活性以達(dá)到選擇性刻蝕以及保持MX層的二維性質(zhì)的目的。此外，氯氣本身是劇毒氣體，操作過程也存在危險(xiǎn)性。

因?qū)娱g較強(qiáng)的物理作用力，MXenes 呈層狀堆疊態(tài)，為獲得更好的性能和充分發(fā)揮其作為二維材料的優(yōu)勢(shì)，人們通常對(duì)其進(jìn)行插層。常見的插層策略有常規(guī)法、自上而下、自下而上等（圖6）。其中，常規(guī)法是指客體僅通過擴(kuò)散或擴(kuò)散與離子交換、分子間力、酸堿反應(yīng)、電化學(xué)和氧化還原反應(yīng)相結(jié)合或壓力、熱和機(jī)械誘導(dǎo)等外部因素促進(jìn)擴(kuò)散直接嵌入層狀主體[圖6(a)]；自上而下是指以剝離的二維材料為前體自上而下組裝嵌入客體，包括層層自組裝、一步共組裝[圖6(b)]；自下而上是指以分子或離子為前體物自下而上組裝嵌入客體，包括原位一鍋合成法[圖6(c)]。插層劑包括各種離子如Li、Na、K、Ca、Mg、Al、In、HO、Be、NH、H、Cl，有機(jī)溶劑如乙醇、二甲基亞砜，聚合物如聚乙烯醇、聚吡咯、超高分子量聚乙烯、聚二甲基硅氧烷等，無機(jī)非金屬如碳納米管、還原氧化石墨烯、類石墨相氮化碳，金屬氧/硫化物如SbO、CoO、SnO、CdS、MoS等。

圖6 MXenes的幾種插層策略[68]

陽離子插層采用常規(guī)法即可實(shí)現(xiàn)。利用MXenes 表面含有負(fù)電官能團(tuán)的特點(diǎn)，插入陽離子后，層間正電荷增多，靜電互斥作用增強(qiáng)，層間距增大。在眾多陽離子中，插入Al后層間距最大，其次是Be，HO、In、Ca居中，Mg最小，這是因?yàn)锳l原子半徑小，結(jié)合水能力較強(qiáng)。同理，Mg比K結(jié)合水能力強(qiáng)，因此插入Mg后層間距較大。金屬陽離子還可以和水分子結(jié)合共同插入層間，進(jìn)一步增大層間距。有機(jī)溶劑與水分子的結(jié)合能力較離子弱，因此，插入后的層間距相比離子插層的要小。Lyu 等利用乙醇中的羥基和二甲基亞砜中氧硫鍵與MXenes 表面的—OH、—F、—O 等形成氫鍵插入層間，層間距從9.26? 分別增至10.04? 和10.16?，二甲基亞砜的分子量比乙醇大，結(jié)構(gòu)比乙醇復(fù)雜，因此導(dǎo)致更大的層間距。MXenes 用不同陽離子以及溶劑插層后的層間距列于表4。

表4 插層前后MXenes的層間距

利用插層劑與MXenes表面的—OH、—F、—O等形成氫鍵的常規(guī)插層策略可以實(shí)現(xiàn)聚合物的插層。聚乙烯醇（PVA）中含有大量羥基，可以與—OH、—F、—O 等形成氫鍵，MXenes 薄膜厚度增大，拉伸強(qiáng)度得到了改善，電容量略微降低。插入聚吡咯（PPy）可使材料導(dǎo)電性能顯著提高。Yan 等先用陽離子聚合物聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA）修飾還原氧化石墨烯，再通過層層自組裝插層，當(dāng)還原氧化石墨烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)5%時(shí)，MXenes 片層厚度由1.31nm 增至1.50nm。Su 等在稀鹽酸水溶液中超聲g-CN使其質(zhì)子化，再利用TiC帶負(fù)電的特性，通過層層自組裝實(shí)現(xiàn)了g-CN插層。Li等通過原位一鍋合成策略將碳納米管插入雙氫氧化物（LDH）/TiCT層間，用于制備超級(jí)電容器。Zhao等通過交替過濾層層沉積實(shí)現(xiàn)了碳納米管插層，MXenes 的電化學(xué)性能顯著提高。金屬氧/硫化物的插層通常采用常規(guī)策略。Sb通過離子交換以及與MXenes 表面的負(fù)電官能團(tuán)相互吸引實(shí)現(xiàn)預(yù)插層，隨后在堿性條件下水解得SbO，從而實(shí)現(xiàn)SbO插層。在濃NaOH 的條件下，Co與OH反應(yīng)生成帶正電的α-Co(OH)，隨后通過靜電吸附插入層間，經(jīng)退火發(fā)生氧化還原反應(yīng)得CoO，達(dá)到了CoO插層的目的，MXenes的電磁微波吸收效率顯著提高。Ding 等利 用SnO與MXenes 納米片間形成Sn—O—Ti 鍵，可以實(shí)現(xiàn)SnO插層，顯著改善MXenes 的電化學(xué)性能。Ran等首先利用Cd與MXenes 表面的—O 靜電吸附，再通過S 與Cd配位，實(shí)現(xiàn)CdS 插層，可見光催化活性顯著提高。也可采用類似方法實(shí)現(xiàn)MoS插層，改善MXenes的電化學(xué)性能。

總的來說，通過插層可以增大MXenes層間距，弱化層間作用力，防止堆垛，同時(shí)改善材料的物理和化學(xué)性質(zhì)。

2.2 MXenes的物理和化學(xué)性質(zhì)

MXenes 優(yōu)異的物理性質(zhì)賦予了其良好的光、電等性能。MXenes 材料因其表面官能團(tuán)不同而功函數(shù)不同，在MXenes 表面引入不同的官能團(tuán)，可以制備性能良好的電子注入器、二極管等電子器件。根據(jù)密度泛函理論計(jì)算可知，吸附在端氧原子上的氫原子的吉布斯自由能接近0eV，氧/羥基端的氧原子達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，并且MXenes 為金屬材料有利于電荷轉(zhuǎn)移，這使得MXenes 有望成為一種穩(wěn)定的、高活性的非貴金屬催化劑。在朝向真空面的上方區(qū)域中，各原子以近乎自由電子狀態(tài)（NFE）出現(xiàn)，且通常以高于費(fèi)米能級(jí)的能量呈現(xiàn)。NFE態(tài)相對(duì)于費(fèi)米能級(jí)的位置可通過表面電荷和外加電場(chǎng)來調(diào)節(jié)，這會(huì)產(chǎn)生偶極矩，引發(fā)電子轉(zhuǎn)移，賦予其電學(xué)特性。MXenes 材料的表面電荷隨表面官能團(tuán)的改變而改變，因此，表面功能化的MXenes可以作為性能優(yōu)異的半導(dǎo)體。

MXenes 表面豐富的官能團(tuán)賦予了其優(yōu)異的化學(xué)性質(zhì)。通常刻蝕掉MAX 中結(jié)合力較弱的A 原子后，暴露的M 原子會(huì)變得很活潑，很容易結(jié)合帶負(fù)電的氟、氧、氫等配體。因此，MXenes 表面帶有豐富的親水性官能團(tuán)，如—F、—OH、—COOH、—O、==O等，可以與水分子形成氫鍵，形成穩(wěn)定的分散體。除此之外，MXenes 的表面終端官能團(tuán)還包括—H、—P、—Si、—CHO 等，大多取決于合成條件，如刻蝕和插層條件、M元素的種類組成、后合成和儲(chǔ)存條件等。表面官能團(tuán)會(huì)影響MXenes 材料的表面化學(xué)性質(zhì)，例如，與—H 或—OH 封端的MXenes 相比，—O 封端的MXenes 往往具有更大的電池容量。MXenes 在濕度較大的空氣中可能會(huì)降解。但是，其表面的Ti原子與水或氧反應(yīng)形成致密的TiO鈍化層后，化學(xué)性質(zhì)變得穩(wěn)定，且陽極極化使這種程度增強(qiáng)。在HF溶液中，Ti原子也會(huì)鈍化。

2.3 MXenes固定化酶

Mxenes 具有較大的比表面積且表面具有豐富的親水性官能團(tuán)，為酶的固定化提供了良好的生物相容性微環(huán)境。

與GO 類似的是，MXenes 表面含有豐富的羥基，可以先硅烷化，在載體表面引入氨基，再通過GA固定化酶。Ding等首先用LiF/HCl的混合物刻蝕掉TiAlC中的Al，制得TiCT，再用APTES 改性TiCT，以在納米片表面引入氨基，然后用GA共價(jià)連接CRL（圖7），負(fù)載率達(dá)58.4mg/g。在近紅外輻射下，TiCT優(yōu)異的光熱效應(yīng)使得酶周圍局部受熱，酶活性增強(qiáng)，連續(xù)照射30min，酶比活由無紅外輻射時(shí)的20.12U/mg 增加到30.18U/mg，提高了近50%。70℃時(shí)，固定化脂肪酶的活性為50℃時(shí)活性的93%，比游離酶高21%。相同溫度和酸堿度下，固定化酶活性比游離酶高。這是由于酶與TiCT之間是通過共價(jià)鍵連接，限制了酶的構(gòu)象變化，因此酶的穩(wěn)定性提高。在5次循環(huán)利用后，固定化酶仍能保持約初始活性的55%。

圖7 固定化脂肪酶的過程及共價(jià)固定脂肪酶的機(jī)理示意圖[90]

利用MXenes 表面帶負(fù)電的特征可以通過靜電作用固定酶。Rozmystowska-Wojciechowskaa 等探究了溶菌酶與MXenes 相互作用時(shí)，材料表面化學(xué)性質(zhì)和酸堿度對(duì)溶菌酶的影響。該研究用HF 刻蝕TiAlC和TiAlC，制得TiC和TiC，由于起始電位為負(fù)，可以吸附帶正電荷的溶菌酶分子。其中，TiC比TiC 具有更高的比表面積，值也更高，從而可吸附更多的酶，但在堿性環(huán)境下，溶菌酶從MXenes表面釋放。

目前，MXenes 固定化酶的一個(gè)主要應(yīng)用是制作電化學(xué)傳感器。利用其表面的負(fù)電性，可通過與殼聚糖溶液混合后滴加到拋光的玻碳電極（GCE）上以形成薄膜，再將酶涂敷到電極表面，制得生物傳感器。Zhou等用該法固定了乙酰膽堿酯酶，用于檢測(cè)馬拉硫磷，在pH=8、酶負(fù)載量為0.12U、TiCT濃度為0.5mg/mL、抑制時(shí)間為10min 時(shí)，傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異的檢測(cè)性能，線性范圍為1×10～1×10mol/L，檢測(cè)限為0.3×10mol/L。Ma等先制得G（石墨烯）/TiC/TiC，再將帶正電的HRP吸附在G/TiC/TiC上，再與殼聚糖溶液混合后滴加到GCE上（圖8）。G/TiC/TiC具有垂直結(jié)構(gòu)，為酶固定提供了較大比表面積；表面含有的—OH、—F基團(tuán)易與水形成氫鍵，增強(qiáng)了其親水性。在pH=6時(shí)，因氨基等質(zhì)子化，酶復(fù)合物表現(xiàn)出優(yōu)異的導(dǎo)電性，該電化學(xué)傳感器具有較寬的線性范圍（5～1650μmol/L），檢測(cè)限為0.74μmol/L，操作穩(wěn)定，可用于干貝和牛奶等食物中HO的檢測(cè)。Wu 等采用類似方法固定酪氨酸酶，制備了可用于檢測(cè)苯酚的傳感器。靈敏度為414.4mA·L/mol，檢測(cè)限為12nmol/L，線性范圍為0.05～15.5μmol/L。

圖8 辣根過氧化物酶@MXene/殼聚糖/玻碳電極制備示意圖和H2O2傳感原理[91]

將MXenes 固定化酶的文獻(xiàn)匯總后見表5?？梢钥闯?，除了利用材料表面的羥基改性再共價(jià)固定之外，更多的是采用靜電吸附固定化，目前主要用于傳感器。

表5 MXenes固定化酶的文獻(xiàn)匯總

3 GO和MXenes的比較

GO 和MXenes 的比較列于表6。GO 由石墨烯經(jīng)化學(xué)氧化再剝離制得，過程中涉及強(qiáng)氧化劑；MXenes主要由MAX經(jīng)刻蝕制得，需要用到強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿。二者的制備過程均存在一定的危險(xiǎn)性，且不同的氧化或者刻蝕方法制得的材料在組成、結(jié)構(gòu)、性能等方面存在一定差異。GO 主要由C、H、O等非金屬元素組成，以共價(jià)鍵相連接，牢固，酸堿穩(wěn)定性較好；MXenes 表面含有過渡金屬元素，易被氧化致使其結(jié)構(gòu)被破壞，穩(wěn)定性較差。GO的結(jié)構(gòu)高度無序，具有多種結(jié)構(gòu)模型；MXenes 具有MX、MX、MX等六方晶格結(jié)構(gòu)。二者均具有高比表面積，為酶的固定化提供了較大的空間，但從文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)來看，MXenes可以獲得比GO更高的比表面積，且層間距更大、層數(shù)更多。

表6 GO和MXenes的比較

GO 和MXenes 表面官能團(tuán)略有區(qū)別。通常，GO 面內(nèi)有—OH、環(huán)氧基，邊緣有—COOH、羰基、酚基、醚鍵、內(nèi)酯基、醌基等官能團(tuán)，其中，可用于固定化酶的官能團(tuán)主要有—OH和—COOH，其次是環(huán)氧基。MXenes 表面有—OH、—F、—COOH、—O、==O、—Cl 等官能團(tuán)，可用于固定化酶的官能團(tuán)主要有—OH 和—COOH。相比較而言，GO 表面的可反應(yīng)官能團(tuán)種類更多，應(yīng)用也更為廣泛。GO和MXenes的共同點(diǎn)是表面均帶有大量負(fù)電荷，可以通過靜電作用吸附固定帶正電荷的酶，且二者表面官能團(tuán)均可以與水形成氫鍵，親水性較好，為酶固定化提供了良好的生物相容性微環(huán)境，因此固定化酶活性較高。

通過化學(xué)結(jié)合法和物理吸附作用，在GO 表面固定的酶有模型酶PersiManXyn1、漆酶、CRL、脂肪酶、天冬氨酸酶、HRP、溶菌酶、OPH 等，催化的反應(yīng)類型有還原、酯化、水解反應(yīng)；以MXenes 為載體的酶有CRL、溶菌酶、乙酰膽堿酯酶、HRP、酪氨酸酶等，催化的反應(yīng)類型有還原和水解反應(yīng)，更多用來作為生物傳感器。此外，MXenes 具有優(yōu)異的光熱效應(yīng)，可以通過近紅外輻射使酶周圍局部受熱，活性增強(qiáng)。

有意思的是，在單獨(dú)使用MXene或GO時(shí)，層間的π-π作用和范德華力作用致使納米片間堆疊。但是，兩者混合后，排斥作用卻會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生三維孔道。由于GO 的柔韌性更好，使形成的孔道更豐富；隨GO添加量的增大，孔道趨向于無序化，且尺寸變大，酶易擴(kuò)散進(jìn)孔道內(nèi)。Gu等將TiCT與GO的混合液滴加到GCE上成膜，在孔道內(nèi)固定化GOx，制備了葡萄糖傳感器。

4 結(jié)語與展望

二維納米材料具有優(yōu)異的電學(xué)、光學(xué)、磁學(xué)、力學(xué)和化學(xué)性能，已廣泛應(yīng)用于電池、超級(jí)電容器、儲(chǔ)能、催化、吸附分離、傳感和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。本文總結(jié)并比較了經(jīng)典二維材料GO和新型二維材料MXenes 的制備方法和結(jié)構(gòu)、物理和化學(xué)性質(zhì)以及它們?cè)诠潭ɑ割I(lǐng)域的應(yīng)用。GO和MXenes具有豐富的表面官能團(tuán)、良好的親水性以及生物相容性等特點(diǎn)以及二維材料所特有的高比表面積，為固定化酶提供了優(yōu)越的條件。由于研究較早以及具有更多的可反應(yīng)官能團(tuán)，GO 在固定化酶領(lǐng)域應(yīng)用更多。MXenes 材料誕生相對(duì)較晚，固定化酶的研究還不是很多，然而其在生物傳感器方面的應(yīng)用正受到越來越多的關(guān)注，這類材料品種繁多，近年來發(fā)展迅速，是非常具有潛力的一種新型材料。通過調(diào)節(jié)MXenes 片層的厚度、表面過渡金屬和官能團(tuán)的種類以及插層策略，未來在固定化酶領(lǐng)域大有可為。

但是，這兩種材料作為二維納米材料的典型代表，也存在一些問題。首先，材料的制備過程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，產(chǎn)率較低，且操作過程具有一定危險(xiǎn)性；其次，由于層間相對(duì)較強(qiáng)的物理作用力，納米片容易聚集，影響其使用性能；再者，由于回收過程中的損失，固定化酶的循環(huán)利用次數(shù)大多有限。今后的發(fā)展方向還是要開發(fā)更為簡(jiǎn)單易行和安全的材料制備方法，探索更為有效的插層和剝離手段以及改善固定化酶的回收策略，進(jìn)一步推進(jìn)二維納米材料在固定化酶領(lǐng)域的應(yīng)用。