青花菜、番茄與辣椒根腫菌侵染過程研究

謝 琪 劉玉梅 韓風慶 莊 木 李占省

（中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京 100081）

根腫病是一種土傳病害，對世界范圍內(nèi)的十字花科作物危害嚴重，該病可由蕓薹根腫菌（）侵染植株根系引發(fā)，根腫菌在土壤中可存活數(shù)年，傳播方式呈現(xiàn)多樣化。近些年，我國青花菜（L.var.）栽培面積逐年增加（李占省 等，2021），根腫病也開始在部分地區(qū)發(fā)生且呈擴大趨勢，目前已在浙江、云南、湖北、河南、重慶等地發(fā)生。根腫病會造成青花菜商品性降低，甚至難以形成正常花球，影響產(chǎn)量和質(zhì)量，嚴重時造成絕收。

十字花科根腫病的防治方法有物理防治（撒石灰、石灰氮等）和化學防治（氟啶胺）等，但最根本的方法是選育抗性品種（Webster &Dixon，1991；Wallenhammar et al.，2008）。目前，根腫菌在土壤中侵染十字花科作物的生活史已很清楚（楊曉琴，2015）。十字花科根腫病鑒定方法主要分為兩類，一是建立在病圃基礎(chǔ)上的鑒定技術(shù)，二是離體接種鑒定。兩種方法鑒定周期均較長，管理風險大，耗費大量的人力與物力，故探索和建立十字花科根腫病快速鑒定方法將極大地提高鑒定效率（Deora et al.，2012）。

根腫菌生理小種的鑒定方法主要有兩種：Williams 鑒定系統(tǒng)和歐洲根腫病ECD 鑒定系統(tǒng)（Williams，1966；Buczackl et al.，1975）。Williams 鑒定系統(tǒng)具有寄主少、簡單易操作等優(yōu)點，在國際上被廣泛使用。然而，Williams 鑒定系統(tǒng)只能鑒別出13 個生理小種，且當多個生理小種混雜時，采用Williams 鑒定系統(tǒng)并不能夠準確地將優(yōu)勢小種鑒別出來，所以該方法存在一定的局限性（Feng et al.，2016；白宇鵬，2019）。ECD 鑒定系統(tǒng)具有較好的實用性，準確度較高，且能夠更加細致地劃分生理小種，但ECD 鑒定系統(tǒng)寄主較多，存在難收集、工作量較大和操作程序較為復雜的問題（丁云花 等，2013；朱翠娟，2016）。原玉香等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，在對同一地區(qū)的2 份菌株進行鑒定時，采用Williams 鑒定系統(tǒng)和ECD 鑒定系統(tǒng)鑒定的結(jié)果不一致，表明兩種鑒定系統(tǒng)對同一地區(qū)生理小種的鑒定結(jié)果存在差異。近些年，水培接種法作為一種快速鑒定根腫病抗性的技術(shù)逐漸顯現(xiàn)其優(yōu)越性，具有操作簡單、方便快捷等優(yōu)點，通過離體接種和染色觀察（杜艷 等，2016），可以從細胞學水平上快速鑒定十字花科作物根腫病抗性，應(yīng)用前景廣闊。

相比十字花科作物，根腫病不會對茄果類作物造成危害，探尋及利用該抗性機理選育抗根腫病的十字花科作物新品種具有極其重要的意義和科學價值。因此，揭示并闡明十字花科和茄果類作物在根腫菌侵染過程及其防御能力上的差異，將為創(chuàng)制十字花科抗根腫病種質(zhì)資源提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2019 年7—9 月在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所進行，種子均為商品種，青花菜品種為中青10 號和中青16 號，番茄（）品種為中雜302，辣椒（L.）品種為中椒115，均由本所自主育成。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子預(yù)處理 2019 年7 月將青花菜、番茄和辣椒種子撒播在浸濕的濾紙上，將濾紙放入培養(yǎng)皿中催芽，6 d 后將幼苗移到15 mL 的離心管中，每管加入14 mL 蒸餾水，只放入1 株幼苗用泡沫篩固定，離心管用錫箔紙包裹進行遮光處理，根腫菌侵染過程在水培溶液中進行（圖1）。

圖1 青花菜、番茄與辣椒水培試驗

1.2.2 根腫菌分子輔助鑒定 供試根腫菌菌株來自河南新野青花菜、大白菜腫塊，由河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所魏小春老師提供并已鑒定為生理小種4 號，將根腫病腫塊洗凈風干后超低溫（-80 ℃）保存?zhèn)溆?。采用CTAB 法提取腫塊DNA（李占省，2012）。

根據(jù)已報道的根腫菌生理小種特異引物（表1）進行PCR 擴增和鑒定（Zheng et al.，2018）。PCR 反應(yīng)體系：5.0 μL 的2×Plus Master Mix，2.0 μL 的ddHO，2.0 μL DNA，正反引物各0.5 μL，總體積10.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72 ℃后延伸5 min，10 ℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，每孔點入5 μL PCR 產(chǎn)物，在150 V 恒壓下電泳25 min，后置于自動凝膠成像系統(tǒng)中成像觀察。

表1 根腫菌生理小種特異引物信息

1.2.3 根腫菌菌液制備 將-80 ℃冰箱中的根腫病腫塊在室溫下解凍，稱取10.0 g，用刀片將根腫病腫塊切成小片后放入研磨機，加入1.0 L 蒸餾水機械研碎成漿液，時間為3 min。將磨好的漿液用8 層尼龍網(wǎng)布過濾，以500 r·min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，最后，用血球計數(shù)板和光學顯微鏡將孢子濃度稀釋至4 × 10個·mL，4 ℃保存?zhèn)溆茫▓D2）。

圖2 根腫菌菌液制備流程

1.2.4 根腫菌侵染 移至離心管的中青16 號、中青10 號、中椒115 和中雜302 幼苗水培3 d 后，在離心管中加入2 mL 孢子濃度為4 × 10個·mL的根腫菌菌液，侵染處理過程參考張小麗（2014）的方法并進行調(diào)整。將接種后的水培苗放入人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：16 h 光照，25 ℃；8 h黑暗，20 ℃；相對濕度75%。

1.2.5 鏡檢觀察 在接種后7、12、14 d，利用顯微鏡對供試對象根細胞進行觀察，確定初級、次級侵染時期根腫菌侵染過程。首先，用蒸餾水清洗試驗材料根上的附著孢子，然后將根切成1～2 cm 長的小段，用FAA 固定24 h，同時用熒光桃紅染液染色15 min，染好的根部組織置于載玻片上用清水沖洗掉多余染液，最后進行鏡檢觀察，分別統(tǒng)計侵染和未侵染的根毛數(shù)，計算根毛侵染率。每時間點選取3 個單株分別觀察和拍照。

根毛侵染率=（被侵染的根毛數(shù)/觀察的總根毛數(shù)）× 100%

2 結(jié)果與分析

2.1 生理小種的分子輔助鑒定

根據(jù)已報道的根腫菌生理小種特異引物對河南新野菌株進行PCR 擴增，結(jié)果表明，6 對特異引物Novel342-2、Novel407-2、PBRA_007750-2、PBRA_008439-1、PBRA_009348-1 和Actin1 均能擴增出目標條帶（圖3）。通過Novel342-2、PBRA_009348-1 和Novel407-2 PCR 擴增結(jié)果可以確定4 號、7 號和9 號生理小種的存在情況，若特異引物Novel342-2 能擴增出特異產(chǎn)物，則可以鑒定存在根腫菌4 號生理小種；若特異引物Novel342-2 或Novel407-2 不能擴增出特異產(chǎn)物，則可以鑒定存在根腫菌7 號生理小種；若特異引物PBRA_009348-1 能擴增出特異產(chǎn)物，且Novel342-2 或Novel407-2 不能擴增出目標產(chǎn)物，則可以鑒定存在根腫菌9 號生理小種。本試驗中，特異引 物Novel342-2、PBRA_009348-1和Novel407-2 均能擴增出特異片段，故可以確定該菌株存在4 號生理小種，不存在7 號和9號生理小種。通過特異引物PBRA_007750-2、PBRA_009348-1 和PBRA_008439-1 的PCR 擴增結(jié)果可以判斷11 號生理小種的存在情況，若特異引物PBRA_009348-1 未擴增出特異產(chǎn)物而PBRA_007750-2 或PBRA_008439-1 可以擴增出特異產(chǎn)物，則可以推斷存在根腫菌11 號生理小種，但本試驗中，特異引物PBRA_009348-1 能擴增出特異產(chǎn)物，可推斷該供試菌株中不存在11 號生理小種。綜上所述，推斷該根腫菌只存在4 號生理小種（表2），這與河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所原玉香等（2017）的報道結(jié)果一致。

圖3 根腫菌生理小種PCR 擴增產(chǎn)物

表2 根腫菌生理小種標記鑒定條件及結(jié)果

2.2 青花菜、番茄和辣椒根腫菌侵染過程觀察比較

水培青花菜根腫菌侵染過程顯示，青花菜根部用熒光桃紅染液染色后，被根腫菌侵染的根毛呈紅色，未被侵染的根毛為無色。圖4-a 顯示，在接種后7 d，青花菜根毛細胞內(nèi)有大量分生孢子侵入，表明根腫菌已侵染根毛，此時中青16 號的根毛侵染率為46.62%（圖5）。在青花菜根腫菌侵染過程中，中青16 號比中青10 號生長勢強，接種后，中青16 號能維持較長一段時間的正常生長，而中青10 號在接種后死亡速度較快，故未能進行觀察。圖4-a Ⅳ中可以觀察到有部分孢子從根毛已進入到根部皮層細胞內(nèi)，圖4-a Ⅵ表明根腫菌已明顯侵染根部皮層細胞，根部皮層細胞內(nèi)有大量的孢子囊形成。隨著侵染時間的延長，接種后12 d 比7 d 時的根毛侵染率明顯提高25.38%。到接種后14 d 時，根毛侵染率上升減緩，比接種后12 d 時提高了11.40%，根毛侵染率達到83.40%。由此可見，在接種后7～14 d 根腫菌能夠快速侵染青花菜，且在不同基因型間存在侵染速率上的差異。本試驗中，中青16 號相比中青10 號在接種后能夠延長生存時間，滯緩根腫菌侵染速率，但在接種后14 d 時，中青16 號根部皮層細胞內(nèi)仍形成大量的孢子囊。

番茄品種中雜302 水培接種根腫菌侵染過程顯示（圖4-b），在接種后7 d 時根腫菌開始侵染根毛，此時根毛侵染率較高，為32.80%（圖5），但比青花菜中青16 號的根毛侵染率低。接種后12 d 時仍有部分番茄根毛被根腫菌侵染，相比接種后7 d 的根毛侵染率提高不到10%，部分根腫菌孢子已進入根部皮層細胞，但明顯低于中青16 號的侵染率。接種后14 d 時番茄根毛發(fā)生明顯扭曲，根部皮層細胞可明顯觀察到侵入的根腫菌分生孢子，此時根毛侵染率為48.21%。從根腫菌的侵染過程來看，番茄品種中雜302 與青花菜品種中青16 號的侵染途徑近似：根腫菌先侵染根毛區(qū)，再逐漸侵染根部皮層，但在接種后7～14 d 中雜302 的根毛侵染率明顯低于同時期的中青16 號；相比青花菜，番茄皮層細胞內(nèi)僅能形成少量的分生孢子，不能形成孢子囊。

圖4 根腫菌侵染中青16 號、中雜302 及中椒115 的根部染色觀察

從辣椒品種中椒115 水培接種根腫菌侵染結(jié)果可以看出（圖4-c），中椒115 根腫菌孢子進入根毛量最少，接種后7 d 時根毛細胞極少被根腫菌孢子侵染，根毛侵染率只有10.56%（圖5）。接種后12 d 時根腫菌已侵染根部皮層細胞，但只有極少數(shù)分生孢子，沒有形成孢子囊，根毛侵染率較低，為12.6%。接種后14 d 時根毛侵染率只上升不到2%。相比中青16 號和中雜302，中椒115 根毛侵染率最低，程度最輕。

圖5 不同品種在不同時期的根毛侵染率

3 結(jié)論與討論

近年來，十字花科作物受根腫病影響和危害越來越大，備受國內(nèi)外關(guān)注。青花菜在國內(nèi)外廣泛種植，2019 年我國種植面積約8.67 萬hm（李占省 等，2019）。目前，根腫病已嚴重危害青花菜主產(chǎn)區(qū)的栽培，如浙江臺州、云南通海、河南新野等地，危害面積逐年增加。

為了更好地挖掘和創(chuàng)制青花菜抗根腫病資源，本試驗以抗根腫病的茄果類蔬菜作物番茄和辣椒為對照，以感病青花菜作為目標研究對象，通過水培法觀察根腫菌侵染茄果類和十字花科類作物根部細胞的過程，來揭示對照組和感病組在根腫菌侵染過程中的差異變化，為十字花科選育抗根腫病資源提供一種新思路。本試驗為了準確鑒定根腫菌生理小種的種類，結(jié)合國內(nèi)外報道，特選用根腫菌生理小種特異分子標記進行鑒定，與原玉香等（2017）報道的河南新野菌株為4 號生理小種的研究結(jié)果一致，表明分子鑒定可作為一種輔助手段實現(xiàn)根腫菌生理小種的快速鑒定。

不同青花菜基因型間以及不同科屬作物間根腫菌的侵染過程均存在顯著差異，但相同的是番茄、辣椒與青花菜一樣，在水培條件下都能夠被根腫菌侵染，且其侵染過程與十字花科作物青花菜相似，都是從進入根毛開始，再侵染根部皮層細胞，形成分生孢子或孢子囊，但在根腫菌侵染率方面，三者存在明顯差異：青花菜上根腫菌的根毛侵染率明顯高于番茄和辣椒。從觀察結(jié)果來看，雖然后期中青16 號、中雜302 和中椒115 的根毛侵染率均有所增加，但番茄和辣椒明顯低于青花菜，與接種后12 d相比，接種后14 d時番茄根毛侵染率提高了6.41%，辣椒根毛侵染率提高了1.80%，而青花菜根毛侵染率提高了11.40%；從進入根毛的根腫菌孢子數(shù)量來看，中青16 號也明顯多于中雜302 和中椒115。綜上所述，青花菜與番茄、辣椒在根腫菌侵染率方面存在明顯差異，青花菜根腫菌侵染速率和侵染率最高，其次是番茄，辣椒最低，且番茄、辣椒根部皮層細胞不能形成孢子囊。

本試驗中，番茄和辣椒根際分泌物可能發(fā)揮了根腫菌防御作用，但在水中根際分泌物可能有別于土壤（Gossen et al.，2019），水中番茄和辣椒的根際分泌物會被稀釋，因此根腫菌能夠侵染根毛和皮層。土壤栽培環(huán)境下根腫病并不會對番茄和辣椒造成危害，從而驗證了茄果類蔬菜根際分泌物的重要性，暗示了可以通過在土壤中增施茄果類蔬菜根際分泌物的方式來預(yù)防和降低十字花科蔬菜根腫病的危害，這將是一種更加綠色、環(huán)保和高效的方法（張婷玉 等，2014；韓旭 等，2015；楊丹丹 等，2018；Fu et al.，2019）。此外，高附加值的十字花科作物或許可以通過嫁接茄果類作物優(yōu)良砧木來預(yù)防根腫病的發(fā)生。本試驗結(jié)果為以上兩種方法提供了一定的科學依據(jù)和技術(shù)支撐，為選育十字花科高抗和免疫根腫病材料提供了新思路。目前，國內(nèi)外報道的十字花科蔬菜抗根腫病基因主要來自蕪菁、蘿卜和大白菜（Suwabe et al.，2003，2006；Zhang et al.，2015），其中蕪菁報道最多，發(fā)現(xiàn)了11 個主效基因或QTL（Piao et al.，2004），茄果類蔬菜尚未見抗根腫病基因的相關(guān)報道，其免疫機理有待深入研究與利用。