組氨酸二肽及其功能性研究進(jìn)展

王西汐，李雯暉，張健，李赫*，陳存社，劉新旗

（1.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，國(guó)家大豆加工產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，北京 100048）

組氨酸二肽是一類水溶性二肽，廣泛存在于多種脊椎動(dòng)物的骨骼肌和腦組織中，主要包括肌肽、鵝肌肽、鯨肌肽、高肌肽等。其中肌肽在生物體內(nèi)分布最廣、含量最大，俄國(guó)科學(xué)家Gulewitsch等[1]在李比希氏牛肉提取液中分離發(fā)現(xiàn)，后被分析證實(shí)肌肽的結(jié)構(gòu)為β-丙氨酰-L-組氨酸，是由β-丙氨酸和L-組氨酸通過肌肽合成酶合成的。純肌肽為白色針狀結(jié)晶體，熔點(diǎn)為246℃～250℃（分解），旋光度+24.1°（1.5%，水中）[2]。肌肽的甲基化衍生物鵝肌肽（β-丙氨酰-1-甲基-L-組氨酸）于1929年被Ackermann等[3]分離出。隨后，肌肽的另一個(gè)甲基化衍生物鯨肌肽，也稱蛇肌肽（β-丙氨酰-3-甲基-L-組氨酸）[4]以及高肌肽（γ-氨基丁酰基-L-組氨酸）也被發(fā)現(xiàn)。組氨酸二肽具有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，都具有較強(qiáng)的抗氧化性，在食品工業(yè)中可作為天然的抗氧化劑，具有保健作用。

1 組氨酸二肽的分布

組氨酸二肽主要存在于脊椎動(dòng)物的骨骼肌中，大腦、心臟、肝臟、腎臟等組織中也含有一定量的組氨酸二肽，在某些動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)和嗅覺感受器中也有發(fā)現(xiàn)。組氨酸二肽的含量與動(dòng)物的種類、性別、年齡和肌肉部位等因素相關(guān)。

1.1 動(dòng)物種類

幾種常見動(dòng)物中組氨酸二肽含量由高到低排序禽類包括鳥類為火雞＞雞＞馬＞豬＞兔＞牛[5]。對(duì)于陸地哺乳動(dòng)物（牛、豬、馬、狗等）其肌肉中肌肽含量高于鵝肌肽含量，人類僅含有肌肽。禽類中鵝肌肽含量高于肌肽含量。鯨肌肽是蛇和海洋哺乳動(dòng)物（如鯨、海豚）中存在的唯一一種組氨酸二肽。某些魚類（如鰹魚、鮪魚、海鰻）中也含有豐富的鵝肌肽和肌肽，且鵝肌肽含量高于肌肽含量。不同物種的組氨酸二肽含量和比例不同，故可通過測(cè)定組氨酸二肽的含量和不同二肽間的比例來鑒定肉制品的原料肉[6]。

1.2 性別及年齡

母雞的胸肉和腿肉中肌肽含量顯著高于公雞，而鵝肌肽含量在母雞和公雞間無(wú)顯著差異[7]。雄性成年小鼠骨骼肌中組氨酸二肽含量顯著高于雌性成年小鼠，在成年前，雄性小鼠骨骼肌中肌肽和鵝肌肽含量都隨日齡的增加而增長(zhǎng)，但雌性小鼠的肌肽無(wú)明顯提高，鵝肌肽含量增加了2倍～3倍[8]。

1.3 肌肉部位

組氨酸二肽在白肌纖維中的含量比紅肌纖維高，在禽類胸肉中的含量比腿肉高[9]，在豬的腿肉中含量比肩胛肉高[10]，鰹魚的背腹肉中含量比暗色肉和頭部肉高[11]。

2 組氨酸二肽的生理功能

組氨酸二肽的生理功能如圖1所示，組氨酸二肽具有多種生理功能，主要涉及抗氧化、抗衰老、神經(jīng)保護(hù)、治療糖尿病、肝保護(hù)、降尿酸等功能。

圖1 組氨酸二肽的生理功能Fig.1 Physiological function of histidine dipeptide

2.1 抗氧化

組氨酸二肽具有的抗氧化性主要基于其結(jié)構(gòu)中的咪唑環(huán)。咪唑環(huán)上的活潑氫易以氫離子形式離去，且同時(shí)具有酸性和堿性，還具有金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。組氨酸二肽的抗氧化機(jī)理也反映了咪唑環(huán)的性質(zhì)。

2.1.1 清除自由基

組氨酸二肽可作為氫供體捕捉羥基自由基、超氧陰離子自由基等，通過清除自由基抑制活性氧的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激造成的損傷[12]。肌肽和鵝肌肽可通過清除羥基自由基有效抑制內(nèi)源性神經(jīng)毒素1-甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉（salsolinol，Sal）/鐵蛋白系統(tǒng)介導(dǎo)的DNA鏈斷裂[13]。

2.1.2 金屬離子螯合作用

組氨酸二肽含有較多金屬結(jié)合位點(diǎn)，包括咪唑基上的兩個(gè)N原子、氨基、羧基和肽鍵，能夠結(jié)合Cu2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Co2+等金屬離子形成絡(luò)合物。體內(nèi)的 Cu2+等金屬離子會(huì)造成脂質(zhì)氧化，過多的Fe2+會(huì)導(dǎo)致活性氧增加，引起過氧化反應(yīng)，組氨酸二肽與這些金屬離子螯合可減少由金屬離子引起的脂肪氧化反應(yīng)。肌肽還可與非血紅素鐵、血紅蛋白鐵、肌紅蛋白鐵等結(jié)合，減少細(xì)胞膜損傷，因此可用作肉類及其制品的抗氧化劑，保持肉類制品的品質(zhì)并延緩色澤變化[14-16]。

利用組氨酸二肽的金屬離子螯合能力可開發(fā)其在工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療等領(lǐng)域的應(yīng)用。利用固定有Cu2+的化學(xué)修飾葡聚糖或樹脂絡(luò)合組氨酸二肽，可在混合溶液中選擇性回收組氨酸二肽[17-18]。組氨酸二肽與金屬離子結(jié)合后還能促進(jìn)金屬離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)以及發(fā)揮生理功能，如肌肽螯合Zn2+可有效治療放射性食管炎[19]。

2.1.3 緩沖生理pH值

肌肽的解離常數(shù)pK值為6.9，鵝肌肽的pK值為7.1，組氨酸二肽的pK值使其非常適合作為骨骼肌細(xì)胞中的pH值緩沖劑，組氨酸二肽的緩沖能力在pH值為6.5～7.5之間較高，在5℃～40℃范圍內(nèi)受溫度影響較小。當(dāng)動(dòng)物進(jìn)行無(wú)氧運(yùn)動(dòng)時(shí)，依靠糖酵解提供能量會(huì)產(chǎn)生大量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和乳酸，使肌肉中H+急劇增加，組氨酸二肽的生理緩沖功能可抑制pH值下降，維持肌肉內(nèi)部的酸堿平衡。對(duì)不同物種的研究表明，依賴無(wú)氧形式產(chǎn)生能量的物種中組氨酸二肽的含量很高，并且快收縮無(wú)氧酵解型纖維比例較高的肌肉中組氨酸二肽含量也較高[20]。

2.2 抗衰老

組氨酸二肽通過恢復(fù)衰老細(xì)胞活力、抑制端?？s短、抗氧化、清除羰基、抑制糖酵解、上調(diào)線粒體活性等機(jī)制起到抗衰老的作用[21]。研究表明，老年人每日補(bǔ)充鵝肌肽和肌肽可對(duì)其記憶力、認(rèn)知功能和身體活動(dòng)機(jī)能產(chǎn)生有益影響[22-23]。補(bǔ)充肌肽可減少老年大鼠血清和肝臟中的糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物，減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的衰老[24]。肌肽可通過降低皮質(zhì)酮的循環(huán)水平和激活PI3K/Akt信號(hào)促進(jìn)衰老皮膚傷口的愈合，提高皮膚中膠原蛋白的含量，預(yù)防皮膚衰老[25]。

2.3 神經(jīng)保護(hù)作用

組氨酸二肽可減少神經(jīng)元細(xì)胞死亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用，可預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病[26]。肌肽可抑制蛋白質(zhì)的交聯(lián)和β-淀粉樣蛋白的聚集，還可抑制自由基的產(chǎn)生，降低一氧化氮和丙烯醛的毒性，具有抗炎活性，因此可以預(yù)防和治療阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病[27-28]。帕金森病也是一種主要的神經(jīng)退行性疾病，會(huì)造成運(yùn)動(dòng)障礙和α-突觸核蛋白沉積導(dǎo)致的嗅覺功能障礙，攝入肌肽治療可增強(qiáng)帕金森患者線粒體功能，對(duì)帕金森病的癥狀有顯著緩解作用[29-30]。

組氨酸二肽的神經(jīng)保護(hù)作用可減少腦部缺血及出血性損傷，可預(yù)防和治療腦卒中。肌肽的神經(jīng)保護(hù)作用可減輕腦出血后的腦水腫、血腦屏障破壞、氧化應(yīng)激以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡[31]，可改善缺血缺氧性腦損傷患者的腦功能，減輕腦損傷[32]。

2.4 治療糖尿病

肌肽可通過調(diào)節(jié)葡萄糖代謝通路上的酶，包括抑制葡萄糖-6-磷酸脫氫酶表達(dá)，增加糖原合酶、葡萄糖激酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的表達(dá)，起到降低血糖的作用[33]，還可降低血清甘油三酯和糖基化終產(chǎn)物含量[34]。肌肽可通過增加紅細(xì)胞的變形能力來改善微血管循環(huán)障礙，可減少脂質(zhì)過氧化來保護(hù)細(xì)胞和組織免受損傷，增加一氧化氮水平從而改善血管內(nèi)皮的功能紊亂。因此，肌肽在糖尿病治療中可有效阻止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[35]。肌肽可通過抗氧化應(yīng)激、抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化、改善糖脂代謝以及抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性等機(jī)制[36]，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程抑制腎小球膜細(xì)胞增殖，預(yù)防和治療糖尿病腎??；肌肽還能加速糖尿病患者傷口愈合[37]，改善患者的學(xué)習(xí)和認(rèn)知障礙[38]。

2.5 肝保護(hù)作用

肌肽治療可抑制由四氯化碳導(dǎo)致的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性升高和肝臟中丙二醛水平升高，減少肝臟脂質(zhì)過氧化，可改善與保護(hù)四氯化碳引起的肝損傷[39-40]。肌肽還可減輕肝硬化患者的肝損傷，并預(yù)防肝硬化和肝功能衰竭導(dǎo)致的高氨血癥等并發(fā)癥[41]。

2.6 降尿酸作用

攝入鵝肌肽可降低血尿酸含量，提高尿酸清除率，緩解高尿酸血癥[42]。鵝肌肽可使次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和乳酸脫氫酶的表達(dá)增加，從而抑制尿酸的合成。鵝肌肽可被完整吸收進(jìn)人體血液，在進(jìn)入尿液中可穩(wěn)定尿液的pH值，提高尿酸的溶解度并加速排出[43]。

2.7 治療眼病

組氨酸二肽可治療白內(nèi)障等由于氧化損傷造成的眼科疾病。組氨酸二肽眼部給藥可減少老年白內(nèi)障患者晶狀體的渾濁區(qū)域，提高晶狀體的清晰度以改善視力[44]。肌肽可抑制由視神經(jīng)壓迫造成的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡，從而預(yù)防和治療青光眼等視神經(jīng)病變[45]。

2.8 其他

除上述生理功能外，組氨酸二肽還具有抗抑郁[46]、抗癌癥[47-49]、抗炎[50]、抗疲勞[51]、脾保護(hù)作用[52]和腎保護(hù)作用[53]等生理功能。

3 組氨酸二肽的提取

動(dòng)物體內(nèi)的肌肽是通過存在于骨骼肌和大腦中的肌肽合成酶利用β-丙氨酸和L-組氨酸合成的，體外獲取組氨酸二肽主要有3種方法：化學(xué)合成、細(xì)胞培養(yǎng)[54]、動(dòng)物肌肉中提取。目前，采用化學(xué)合成法工業(yè)化生產(chǎn)的組氨酸二肽已被廣泛應(yīng)用于其生理活性的研究，但在化學(xué)合成組氨酸二肽時(shí)會(huì)產(chǎn)生一種強(qiáng)還原劑——肼，會(huì)影響脂質(zhì)氧化及其產(chǎn)物的檢測(cè)，因此采用化學(xué)合成的組氨酸二肽需經(jīng)過純化，并重新評(píng)估其生理活性。此外，化學(xué)合成組氨酸二肽需消耗大量化學(xué)試劑，易造成環(huán)境污染，產(chǎn)品中也存在有害物質(zhì)殘留的隱患，且對(duì)設(shè)備要求較高，操作較繁瑣。因此，從天然動(dòng)物組織中提取組氨酸二肽以及對(duì)其生理功能性的評(píng)估是目前的主要研究方向。

由于組氨酸二肽是一類水溶性的二肽，因此可采用水提取法對(duì)肉類中的組氨酸二肽進(jìn)行提取。將肌肉組織樣品絞碎后加入一定比例的去離子水，進(jìn)行勻漿處理，離心，將上清液通過Whatman 4號(hào)濾紙過濾，將濾液在沸水浴中加熱10 min后冰浴冷卻，離心去除蛋白質(zhì)沉淀，上清液通過Whatman 4號(hào)濾紙過濾后進(jìn)行超濾，濾液冷凍干燥即得到組氨酸二肽提取物[55]。為提高組氨酸二肽的得率，采用酶解法提取可顯著提高肉類中肌肽的得率[56]。

4 組氨酸二肽的分離檢測(cè)

4.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是近年來檢測(cè)組氨酸二肽使用最廣泛的方法，該法可快速、靈敏檢測(cè)樣品中的目標(biāo)物，準(zhǔn)確度高。由于不同組氨酸二肽間的結(jié)構(gòu)相似，差異較小，所以眾多學(xué)者開發(fā)了不同的HPLC檢測(cè)方法。

由于組氨酸二肽的紫外吸收和疏水性較弱，檢測(cè)靈敏度較低，可采用柱前或柱后衍生提高HPLC的檢測(cè)效果。朱俊穎等[57]使用ODS-C18色譜柱采用OPA柱前衍生法對(duì)動(dòng)物肌肉中肌肽和鵝肌肽進(jìn)行了測(cè)定。Aristoy等[58]采用陽(yáng)離子交換HPLC結(jié)合OPA柱后衍生法測(cè)定了動(dòng)物飼料和肌肉組織中肌肽、鵝肌肽和鯨肌肽的含量。

在液相色譜后串聯(lián)質(zhì)譜可更加準(zhǔn)確地鑒定組氨酸二肽化合物。Pucciarini等[59]使用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)分離檢測(cè)組氨酸二肽混合樣品中的肌肽、鵝肌肽、鯨肌肽，準(zhǔn)確性和精密度高，且不需柱前衍生。Maciá等[60]使用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法檢測(cè)了雞湯中的肌肽和鵝肌肽，分析時(shí)間短且可檢測(cè)含鹽樣品。王雨晴等[61]采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法可對(duì)動(dòng)物源食物提取物中的肌肽和鵝肌肽進(jìn)行同時(shí)快速檢測(cè)。Uenoyama等[62]開發(fā)了一種使用液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對(duì)肉類樣品中的肌肽、鵝肌肽、鯨肌肽3種組氨酸二肽進(jìn)行定量的方法。

4.2 離子色譜法

離子色譜-電化學(xué)檢測(cè)法是一種高效分離的檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子、糖類、醛醇類、氨基酸和含硫化合物等的檢測(cè)。朱作藝等[63]采用離子色譜-積分脈沖安培法測(cè)定肉類樣品中肌肽、鵝肌肽和高肌肽，3種化合物可在短時(shí)間內(nèi)完全分離且靈敏度高。

4.3 毛細(xì)管電泳法

在一定的電壓下，利用解離樣品中各組分在毛細(xì)管中的淌度不同，可對(duì)組氨酸二肽進(jìn)行分離和檢測(cè)。Jozanovi等[64]開發(fā)了一種微芯片毛細(xì)管電泳-非接觸電導(dǎo)法，可良好分離定量家禽肌肉中的肌肽和鵝肌肽。Zinellu等[65]采用場(chǎng)放大樣品進(jìn)樣毛細(xì)管電泳紫外檢測(cè)法分離和檢測(cè)了肌肽、鵝肌肽、高肌肽，已應(yīng)用于動(dòng)物組織和人腦脊髓液的分析。

5 結(jié)語(yǔ)

動(dòng)物體內(nèi)天然存在的組氨酸二肽由于具備多種生理活性，越來越受到重視并吸引了眾多學(xué)者的研究。不同組氨酸二肽間的差異很小，改進(jìn)的高效液相色譜法、離子色譜法和毛細(xì)管電泳法可對(duì)它們進(jìn)行良好的分離檢測(cè)。組氨酸二肽具有的抗氧化功能使其近年來被廣泛應(yīng)用，在食品行業(yè)作為天然安全的抗氧化劑，在化妝品行業(yè)作為一種抗衰老成分添加至美容護(hù)膚產(chǎn)品，組氨酸二肽具備的多種其他生理功能近年來也逐漸引起了醫(yī)藥界的重視，但其對(duì)許多疾病的治療作用機(jī)制仍未被闡明，而且可能還有生物學(xué)活性未被發(fā)現(xiàn)，仍有待進(jìn)一步的探究。