HPLC 法快速測(cè)定油茶籽粕中的茶皂素

聶麗珍 黃淑琪 楊靜＊

（1.衡陽市市場(chǎng)監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南衡陽 421200；2.南華大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南衡陽 421200）

茶皂素（tea saponin），又名茶皂苷，是一種性能優(yōu)良的天然非離子型表面活性劑，可配置無公害洗滌劑、各類工業(yè)乳化劑、無公害殺蟲劑，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤等多種生物活性而被廣泛應(yīng)用于日用化工、建筑材料、食品和漁業(yè)養(yǎng)殖等不同生產(chǎn)領(lǐng)域[1-5]，其市場(chǎng)發(fā)展前景巨大。

油茶籽粕是油茶籽餅經(jīng)浸出油脂并除去溶劑后剩余的物料[6]，含有茶皂素、茶多糖、茶蛋白、生物堿等多種有效組分，其中，油茶籽粕中茶皂素的含量高于其他組分[7]。近年來，國家對(duì)油茶產(chǎn)業(yè)的重視程度越來越高，中央已經(jīng)將油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與國家糧油安全、生態(tài)安全聯(lián)系在一起。我國油茶林種植面積也呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢(shì)，因此，從油茶籽粕提取茶皂素，可提高茶油加工附加值，具有較好的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用前景。然而，我國每年有很大部分油茶餅粕被當(dāng)做燃料或廢物直接丟棄，造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)[8]。茶皂素中茶皂苷含量的高低又是衡量皂素產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，因此茶皂素的定量分析是研究皂素提取純化及其應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)，目前檢測(cè)茶皂素的方法主要有重量法[9-10]、比色法[11]、光譜法[12]、高效液相色譜法[13-15]等。國內(nèi)茶皂素的研究熱點(diǎn)主要是以茶皂素為乳化劑制備山茶油、甜橙油等納米乳液以及用響應(yīng)面法優(yōu)化茶皂素提取工藝；國際上茶皂素的研究熱點(diǎn)主要集中在茶皂苷單體的提取以及體外抗氧化活性研究[16]，而對(duì)茶皂素液相色譜定量檢測(cè)分析報(bào)道較少。

由于SN/T 1852—2006《出口茶皂素皂苷含量的測(cè)定》已作廢，目前沒有新的國家標(biāo)準(zhǔn)替代并提出油茶產(chǎn)品中茶皂素的檢測(cè)方法，因此本研究根據(jù)國標(biāo)GB/T 35131-2017《油茶籽餅、粕》中的要求，建立一種快速、簡單、穩(wěn)定測(cè)定油茶籽粕中粗茶皂素含量的檢驗(yàn)方法，進(jìn)一步將該方法應(yīng)用到茶皂素中皂苷含量的測(cè)定，以及油茶籽餅、粕中茶皂素的測(cè)定，為制訂行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品（上海如吉生物科技，含量95%）；實(shí)驗(yàn)室自制脫脂茶粕；甲醇（色譜純，德國默克股份有限公司）；無水乙醇（分析純AR，湖南匯虹試劑有限公司）；乙腈（色譜純，德國默克股份有限公司；磷酸（優(yōu)級(jí)純GR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純水（湖南中沃水務(wù)環(huán)?？萍加邢薰境兯到y(tǒng)制備）。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030C 3D 島津高效液相色譜儀（日本島津公司）；PDA 二極管陣列檢測(cè)器（190 nm～650 nm，254 nm 為監(jiān)控波長）；博納艾杰爾Venusil C18 Plus 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；METLER 分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DH500-8S 電熱恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；DZKW-S-4 電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療器械有限公司）；GM-0.5A 隔膜真空泵（津騰）；超聲波清潔儀（天津科貝爾公司）；XH-D 渦旋混勻器（上海汗諾儀器有限公司）

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶皂素粗提物的制備及茶皂素樣品待測(cè)液的配制

采用有機(jī)溶劑提取法，選用乙醇-水作為提取試劑；精密稱取已烘干至恒重的脫脂茶粕粉2 g 于三角燒瓶中，加入80%乙醇20 mL，水浴鍋中80℃回流提取2 h，趁熱將三角燒瓶中的提取液過濾至50 mL 容量瓶中，濾渣再用80%乙醇洗滌一次，合并濾液，80%乙醇定容至刻度，混勻，精密移取上清液2.00 mL 至10 mL 容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，混勻，即為茶皂素樣品提取液，取適量上清液過0.22 μm 有機(jī)濾膜，供高效液相色譜測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品0.616 0 g 于50 mL 容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，再用甲醇定容至刻度，配制成12.32 mg/mL的茶皂素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精密移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用甲醇稀釋成0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、5.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3.3 色譜條件

Venusil C18 Plus 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇:水（90:10），采用等度洗脫；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：348 nm。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將1.3.2 小節(jié)中配置好的6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（STD 0.05、STD 0.1、STD 0.25、STD 0.5、STD 1.0、STD 5.0）按上述色譜條件上機(jī)分析，測(cè)定相應(yīng)濃度下的峰面積。然后按照峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

2.1.1 波長的選擇

同一茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在其它色譜條件相同的情況下，觀察二極管陣列檢測(cè)器（PDA）在190 nm 至800 nm 之間掃描的波長處掃描出來的光譜視圖，如圖1 所示，掃描出的光譜視圖出現(xiàn)了3 個(gè)吸收峰，分別是206 nm、265 nm、348 nm。其中，茶皂素峰在206 nm 波長處有吸收峰，但存在與溶劑甲醇峰相近難以分開，在265 nm 波長的吸收峰尖銳、靈敏度高，但標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜峰存在拖尾，在348 nm 波長的吸收峰與265 nm波長處的吸收峰相比稍寬，但標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜峰未存在拖尾且峰型尖銳對(duì)稱。故選檢測(cè)波長為348 nm。

圖1 茶皂素190 nm～800 nm 波長段光譜圖

2.1.2 流動(dòng)相、流動(dòng)相比例和流速的選擇

試驗(yàn)分別采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈甲醇（v:v=1:1）-水及乙腈-0.1% 磷酸水不同比例作為流動(dòng)相對(duì)茶皂素進(jìn)行分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水、乙腈甲醇-水及乙腈-0.1%磷酸水不論是梯度洗脫還是等度洗脫時(shí)，分離效果均不理想；而當(dāng)采用甲醇-水體系作為流動(dòng)相時(shí)，獲得的圖譜峰型尖銳對(duì)稱、分離效果最佳。在此流動(dòng)相下，更改流動(dòng)相比例，依次用30%、40%、50%、75%、80%、90%、100%的甲醇進(jìn)行分析，結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相比例為100%甲醇時(shí)，茶皂素的峰型尖銳對(duì)稱，與雜峰的分離度好。保留時(shí)間適中，因此最佳洗脫條件，流動(dòng)相選用100%甲醇。在同一色譜條件下，再依次將流速調(diào)為1.0 mL·min-1、0.9 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.7 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.5 mL·min-1進(jìn)行分析試驗(yàn)。結(jié)果表明：當(dāng)流速采用0.50 mL/min 時(shí)，茶皂素的出峰時(shí)間在5.359 min，峰型對(duì)稱，柱效高，消耗的流動(dòng)相少。色譜圖如圖2 所示，所以最佳洗脫條件，流動(dòng)相流速選用0.50 mL/min。

圖2 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

將配置好的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液分別進(jìn)樣10 μL，得出對(duì)應(yīng)濃度下的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，根據(jù)濃度與峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度與峰面積數(shù)據(jù)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3 所示?；貧w方程為Y=412 947×X-3 633.95（Y 表示峰面積，X 表示質(zhì)量濃度），線性回歸系數(shù)r=0.999 94。擬合度R2=0.999 98 結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度在0.05 mg/mL 至5.0 mg/mL 范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.3 茶皂素含量的測(cè)定

精密稱取脫脂茶粕2 g，平行5 份，按本文分析方法進(jìn)行提取稀釋及上機(jī)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算粗提物中茶皂素含量。粗提物中茶皂素含量計(jì)算公式如下：

式中：c為提取液中茶皂素濃度（單位：mg/mL），v為樣品定容的體積（單位：mL），f為稀釋倍數(shù)，m為脫脂茶粕的質(zhì)量（單位：g）。

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取已知茶皂素含量的脫脂茶粕粉3 份（每份2 g 左右），按照低、中、高三個(gè)水平分別加入12.32 mg/mL 的茶皂素標(biāo)準(zhǔn)使用液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，按照1.3.1 小節(jié)處理，每份樣品進(jìn)行6 次平行測(cè)定，考查方法的回收率及儀器精密度。結(jié)果如表1 所示，回收率范圍為90.2%～95.8%，說明本方法準(zhǔn)確性良好。另在做樣品處理的同時(shí)取兩個(gè)空三角瓶，一份按空白樣處理，另一份加適量濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液做空白加標(biāo)回收試驗(yàn)，如圖4 至圖7 所示，可以看出空白樣品加標(biāo)圖與樣品加標(biāo)圖譜相比較，空白加標(biāo)色譜圖基線更平穩(wěn)，樣品加標(biāo)圖譜色譜峰稍許拖尾，基線些許波動(dòng)，這可能是由于基質(zhì)效應(yīng)及雜質(zhì)干擾導(dǎo)致。

表1 茶皂素加標(biāo)回收率

圖4 茶皂素樣品色譜峰

圖5 樣品空白色譜圖

圖6 空白加標(biāo)色譜圖

圖7 樣品加標(biāo)色譜圖

2.5 精密度及檢出限

取同一樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，所得峰面積的RSD 為0.433%，表明本方法精密度良好。選擇一系列較低濃度的茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)分析，測(cè)試檢出限與定量限，以3倍的信噪比（S/N=3）計(jì)算方法的檢出限為0.027 mg/kg，以10 倍的信噪比（S/N=10）計(jì)算方法的定量限為0.090 mg/kg。

2.6 樣品檢測(cè)

應(yīng)用本文方法對(duì)衡陽市不同地區(qū)收集的6 份樣品脫脂處理后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2 所示。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

從表2 中可以看出脫脂茶粕粉中的茶皂素含量差異較大，究其原因，可能是因?yàn)榈赜蚝推贩N差異，也有可能是因?yàn)楸疚乃崛〉牟柙硭睾繛榇植柙硭睾?，未進(jìn)行純化，雜質(zhì)對(duì)結(jié)果造成一定干擾，但此方法可以快速測(cè)定茶粕粉中粗茶皂素含量，能夠滿足對(duì)茶皂素日常檢測(cè)的要求。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明：以80%乙醇為提取溶劑，經(jīng)加熱回流提取樣品，流動(dòng)相稀釋樣品，以純甲醇為流動(dòng)相對(duì)茶粕中的茶皂素進(jìn)行液相色譜分析，得到茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出粗提物中茶皂素樣品的濃度，再通過含量計(jì)算公式得出粗茶皂素含量，該方法相關(guān)系數(shù)為（R）=0.999 942 9，檢出限為0.027 mg/kg，定量限為0.090 mg/kg。樣品測(cè)試的精密度RSD 為0.433%，加標(biāo)回收率為90.2%～95.8%。綜上所述，用高效液相色譜法檢測(cè)粗提物中茶皂素不僅可以快速得到檢測(cè)結(jié)果，而且前處理簡單，實(shí)用性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，能夠滿足在實(shí)際工作中對(duì)茶皂素的檢測(cè)需要，值得廣泛推廣。