衣原體mRNA疫苗的研發(fā)對策與展望

金盈圻，王宗保，王 川

1 衣原體與mRNA疫苗

衣原體是一類具獨特雙相發(fā)育周期的多宿主革蘭陰性胞內(nèi)寄生病原體，感染人類和動物后可引發(fā)相關(guān)感染性疾病及并發(fā)癥，如:沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis, Ct) 感染眼部粘膜可誘發(fā)眼部疾病，感染生殖道可誘發(fā)盆腔炎、不孕癥和異位妊娠等嚴(yán)重后遺癥[1]；肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae, Cpn)感染不僅可誘發(fā)呼吸道疾病，是全球約10%的社區(qū)獲得性肺炎發(fā)生的主要原因，也與反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、哮喘以及動脈粥樣硬化等許多慢性疾病密切相關(guān)[2]；鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci, Cps)可引起全身性人獸共患感染性疾病——鸚鵡熱[3-5]，人感染能引起肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、敗血性休克、腦膜炎、顱神經(jīng)麻痹、心肌炎、心包炎等，鳥類及哺乳動物感染可引起呼吸窘迫、妊娠動物流產(chǎn)以及死產(chǎn)等[6]。衣原體感染常呈現(xiàn)輕微癥狀甚至無癥狀，抗生素治療后常出現(xiàn)感染反復(fù)持續(xù)、遷延難愈現(xiàn)象，不僅對人類公共衛(wèi)生造成威脅，家禽業(yè)、畜牧業(yè)等相關(guān)行業(yè)也遭受巨大經(jīng)濟損失。因此，研發(fā)安全高效的衣原體疫苗以有效預(yù)防衣原體感染性疾病的流行與暴發(fā)十分必要。

mRNA疫苗作為近年疫苗領(lǐng)域的研究熱點，早在20世紀(jì)90年代初就有相關(guān)研究，但由于mRNA可被核糖核酸酶降解，穩(wěn)定性較差，mRNA疫苗在最初階段并未得到廣泛使用[7]。經(jīng)過近幾十年的研究，mRNA疫苗目前已被廣泛用于預(yù)防傳染病以及防治癌癥，在抗病毒、抗傳染性疾病病原體方面也取得了長足進步。研究表明mRNA疫苗可在動物及人類感染中誘導(dǎo)產(chǎn)生安全且持久的免疫應(yīng)答[8]。與滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗及DNA疫苗相比，mRNA疫苗在安全性、免疫性、靈活性等方面更具優(yōu)勢[8-13](表1)：①mRNA在細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄，通過正常的細胞代謝過程降解，可避免因感染及插入誘變等因素引起的潛在基因整合風(fēng)險；②部分mRNA本身具有佐劑特性，可促進免疫系統(tǒng)對特定抗原的免疫應(yīng)答；③mRNA疫苗經(jīng)酶促體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生產(chǎn)，無細胞擴增依賴性，具有快速、低成本以及可大量生產(chǎn)潛力；④mRNA疫苗可通過激活MHCI和MHCⅡ 兩種途徑來誘導(dǎo)CD4+T以及CD8+T細胞應(yīng)答，而CD4+T細胞免疫應(yīng)答與抗衣原體感染密切相關(guān)。因此，研發(fā)衣原體mRNA疫苗以控制衣原體感染具有極大可行性。

表1 衣原體不同疫苗類型比較Tab.1 Comparison of representative chlamydial vaccines

2 衣原體mRNA疫苗設(shè)計

mRNA疫苗的核心原理是將編碼蛋白抗原的mRNA序列遞送到宿主細胞中，并通過宿主細胞的表達系統(tǒng)合成相應(yīng)蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該蛋白的免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的[23-25](圖1A)。選擇理想的候選抗原是mRNA疫苗設(shè)計研發(fā)的關(guān)鍵之一，因此，在設(shè)計衣原體mRNA疫苗時需保證mRNA編碼的目標(biāo)抗原蛋白具有較強的免疫原性及安全性。衣原體疫苗候選抗原包括質(zhì)粒蛋白、主要外膜蛋白、多形態(tài)膜蛋白、熱休克蛋白、蛋白酶樣活性因子等[26](表2)。目前，正在研究的mRNA疫苗主要分為兩類：傳統(tǒng)的非擴增mRNA疫苗以及自擴增mRNA疫苗[8]。mRNA疫苗包括帽子結(jié)構(gòu)、3′非翻譯區(qū)和5′非翻譯區(qū)、編碼抗原蛋白的開放閱讀框以及 Poly(A)尾結(jié)構(gòu)等必要序列結(jié)構(gòu)[27-28](圖1A)。與傳統(tǒng)的非擴增mRNA疫苗的快速表達相比，自擴增mRNA疫苗接種后會在稍長的時間里產(chǎn)生更高的抗原表達水平，并在體內(nèi)持續(xù)數(shù)天，此外，自擴增mRNA疫苗還可在劑量較低時提供與非擴增mRNA疫苗等效的免疫保護[29]。

理想的mRNA候選疫苗應(yīng)該能在減少副作用的同時將mRNA 分子的表達潛力和mRNA疫苗的免疫保護作用最大化。而mRNA的穩(wěn)定性和成功翻譯對于mRNA疫苗發(fā)揮良好效力至關(guān)重要。有研究表明，可以通過序列優(yōu)化和修飾核苷來增強mRNA的穩(wěn)定性，并提高其翻譯效率，從而增強mRNA疫苗的效力[8]。除了mRNA自身穩(wěn)定性問題，還有諸多因素會對mRNA疫苗接種的效用產(chǎn)生重要影響。我們將分別從衣原體mRNA疫苗設(shè)計的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié):目標(biāo)抗原的選擇、抗原遞送策略、佐劑的選擇以及免疫途徑幾個方面來總結(jié)合理設(shè)計衣原體mRNA疫苗的研發(fā)對策(圖1B)。

A：mRNA疫苗原理圖；B：衣原體mRNA疫苗設(shè)計流程 a: 非自擴增 mRNA 疫苗的必要結(jié)構(gòu): m7G-ppp-N結(jié)構(gòu)又稱為甲基鳥苷帽子結(jié)構(gòu)(N：任何核苷酸)；5′UTR 為5′非翻譯區(qū)；3′UTR 為3′非翻譯區(qū)；編碼目標(biāo)抗原(gene of interest，GOI)的開放閱讀框; A (n)為聚腺苷酸化尾巴。b: 基于正鏈 RNA 病毒的自擴增mRNA疫苗的必要結(jié)構(gòu): m7G-ppp-N結(jié)構(gòu)又稱為甲基鳥苷帽子結(jié)構(gòu)(N：任何核苷酸)；5′UTR 為5′非翻譯區(qū)；3′UTR 為3′非翻譯區(qū)；編碼目標(biāo)抗原(GOI)的開放閱讀框;編碼病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的開放閱讀框(non-structural genes, nsPs)；sg Prom(subgenomic promoter)為亞基因組啟動子；A (n)為聚腺苷酸化尾巴。圖1 衣原體mRNA疫苗設(shè)計[8,30]Fig.1 Design of a chlamydial mRNA vaccine

2.1 衣原體目標(biāo)抗原的選擇

2.1.1 主要外膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP) MOMP約占衣原體外膜蛋白成分的60%,是衣原體疫苗研究最為廣泛的候選抗原。衣原體可以在宿主細胞內(nèi)生存和復(fù)制，并可逃避宿主免疫應(yīng)答，因此，理想的衣原體疫苗應(yīng)可同時誘導(dǎo)T、B細胞應(yīng)答[31]，有研究表明針對MOMP的T、B細胞表位的單克隆抗體在體外能有效預(yù)防衣原體感染[31-33]。 但MOMP不能誘導(dǎo)交叉血清保護以及外源性表達MOMP不具天然構(gòu)象等問題，導(dǎo)致MOMP使用受限[32]。然而，近來有研究發(fā)現(xiàn)，由多個血清型MOMP的可變域4(VD4)組成的一種亞單位疫苗Hirep1，解決了天然MOMP和重組MOMP引起的一些問題，并促進了中和抗體的產(chǎn)生[34]。使用以重組MOMP、Th1和Th2佐劑配制的亞單位疫苗免疫小鼠，可誘導(dǎo)抗鼠生殖道衣原體感染的長期免疫保護[35]。但基于MOMP構(gòu)建的衣原體mRNA疫苗是否能解決重組MOMP的天然構(gòu)象問題，增強交叉免疫保護仍有待確證。

2.1.2 質(zhì)粒糖蛋白3(Plasmid glycoprotein 3, Pgp3) 大多數(shù)衣原體均攜帶一個約7.5 kb的質(zhì)粒，編碼8個開放閱讀框(open reading frames, ORFs)。其中，ORF5編碼的質(zhì)粒蛋白Pgp3既可定位于衣原體外膜復(fù)合物，又能被分泌到宿主細胞的胞質(zhì)，與宿主細胞相互作用，刺激宿主細胞產(chǎn)生體液免疫和黏膜免疫應(yīng)答。此外，Pgp3中間結(jié)構(gòu)域肽段可誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答產(chǎn)生中和抗體，C端結(jié)構(gòu)域肽段可通過與宿主TNFR1相互作用誘導(dǎo)輸卵管炎癥產(chǎn)生來促進衣原體清除[36-37]。也有研究表明重組Pgp3能經(jīng)TLR2或者TLR4分別激活THP-1細胞和巨噬細胞誘導(dǎo)MAPK途徑介導(dǎo)的促炎癥因子產(chǎn)生[38]。此外，有研究表明小鼠接種重組Pgp3后可誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答[37]。小鼠接種以寡聚核苷酸CpG為佐劑的Cm Pgp3能誘導(dǎo)針對生殖道感染的免疫保護[39]。然而，Pgp3在衣原體感染以及誘發(fā)疾病過程中的作用機制尚未完全清楚。雖Pgp3為衣原體的重要毒力因子，但人抗體對識別Pgp3具有高度構(gòu)象依賴性，mRNA疫苗能否解決外源性重組Pgp3與天然Pgp3間存在的蛋白質(zhì)構(gòu)象差異問題仍有待研究。

2.1.3 多形態(tài)膜蛋白(Polymorphic membrane proteins, Pmps) Pmps是一類位于衣原體外膜表面的蛋白，具有分子轉(zhuǎn)運、黏附等相關(guān)功能，能被抗原提呈細胞識別和降解，加工并提呈給CD4+T細胞的外膜蛋白，能誘導(dǎo)宿主細胞免疫應(yīng)答，包括通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB產(chǎn)生IL-8、IL-6和MCP-1(monocyte chemoattractant protein 1)，其在衣原體感染過程中發(fā)揮重要作用[40]。有研究表明，PmpB、C、D和I能引起宿主較強的體液免疫應(yīng)答；體外研究表明PmpD抗體能中和大多數(shù)血清型Ct，而PmpA、E在血清中的識別最低。此外，PmpE、H僅誘導(dǎo)CD4+T細胞產(chǎn)生較低水平的IFN-γ，因此不太適合衣原體亞單位疫苗研究[41-43]。有研究表明火雞接種基于Cps PmpD的重組皰疹病毒疫苗后顯示出PmpD特異性抗體增強，以及誘導(dǎo)的CD4+T細胞免疫應(yīng)答水平顯著升高[44]。因此在衣原體疫苗研究上，相比于其它Pmps，因能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生及血清交叉保護效果，PmpD可能更具優(yōu)勢。

2.1.4 其它潛在抗原候選者 除上述候選抗原外(表2)，還有其它潛在候選抗原：Ct分泌的衣原體蛋白酶樣活性因子(Chlamydial proteasome-like factor，CPAF)已被證明可通過靶向宿主先天免疫效應(yīng)分子來促進Ct在小鼠下生殖道定植，而單獨使用重組CPAF或與其他抗原結(jié)合進行免疫，可以在各種小鼠品系和豚鼠中產(chǎn)生顯著的抗感染免疫保護作用[48]。衣原體熱休克蛋白也已被用作多種試驗的抗原靶標(biāo)，并已顯示可誘導(dǎo)強烈的炎癥反應(yīng)[26]，衣原體糖原磷酸化酶、核糖核苷還原酶和巨噬細胞感染性增強因子的誘導(dǎo)保護作用等還有待進一步評估[48]。

2.2 抗原的遞送策略 由于將mRNA順利遞送至宿主細胞是mRNA 疫苗發(fā)揮效力的前提和基礎(chǔ)，mRNA的配制和遞送策略與抗原的表達、提呈和免疫刺激有關(guān)[24]，所以選擇合適的抗原遞送方式對于設(shè)計理想的衣原體mRNA疫苗十分重要?？傮w而言，mRNA遞送系統(tǒng)目前可大致分為脂類或類脂類遞送系統(tǒng)和聚合物遞送系統(tǒng)兩大類。目前，脂質(zhì)納米顆粒(lipid-derived nanoparticles, LNP)是mRNA疫苗遞送策略方面的研究熱點，LNP遞送不僅可以使mRNA避免于核酸酶降解而增強其穩(wěn)定性，還可以促進細胞有效攝取，從而促進mRNA成功遞送至細胞質(zhì)作用位點[49-50]。陽離子脂質(zhì)納米顆?？梢酝ㄟ^靜電吸附作用，以及與細胞膜融合特性，可將mRNA遞送到細胞質(zhì)中，其良好的生物相容性和易于擴大生產(chǎn)優(yōu)勢，使得陽離子脂質(zhì)納米顆粒成為較為理想的、有希望的mRNA遞送系統(tǒng)之一[51-52]。此外，一類富含精氨酸的陽離子肽魚精蛋白被廣泛用作癌癥和病毒mRNA疫苗的遞送系統(tǒng)[8]。有研究報道由聚乳酸和陽離子穿透肽作為mRNA冷凝劑組成的納米復(fù)合物可以被樹突狀細胞吸收，并且誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的高效表達和強烈的先天免疫應(yīng)答[53]。

表2 衣原體疫苗常見候選抗原對比Tab.2 Comparison of antigens for anti-chlamydial vaccines

2.3 佐劑的選擇 佐劑是一類可以與抗原結(jié)合并增強免疫反應(yīng)的分子，是增強疫苗免疫效力的關(guān)鍵成分之一[53]。在Ct疫苗的首次臨床試驗結(jié)果中，分別以CAF01(Cationic Adjuvant Formulation 01)脂質(zhì)體和氫氧化鋁作為佐劑，與衣原體優(yōu)勢候選抗原CTH522一起進行接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種疫苗制劑安全性和耐受性均良好，均能誘導(dǎo)抗CTH522 IgG血清抗體產(chǎn)生，但是與含有氫氧化鋁的制劑相比，以脂質(zhì)體為佐劑的疫苗制劑具有更好的免疫原性[54]。CAF01脂質(zhì)體有可能成為衣原體疫苗的候選佐劑。目前，mRNA疫苗中具有佐劑活性的分子主要分為4類[55-58]：①體外轉(zhuǎn)錄的mRNA，mRNA為佐劑時具有免疫刺激性，它能誘導(dǎo)多種細胞進行TNF-α和IFN-α的分泌[59]；②直接作用的佐劑，如TLR/NOD受體激動劑、炎癥小體激動劑等；③mRNA編碼的免疫刺激分子，如CD40L、CD70、活性TLR4等；④RNA與特異性試劑(脂類試劑、魚精蛋白等)的復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)，MF59佐劑(一種水包油乳劑佐劑)與陽離子納米乳劑配制的自我復(fù)制RNA疫苗顯示出更高的免疫原性和效力[11, 22]。除此之外，還有研究發(fā)現(xiàn)選用TriMix(分別編碼CD40L、CD70、活性TLR4的mRNA混合物)為佐劑的mRNA疫苗，可以增強mRNA的免疫原性，且與DC細胞成熟度、細胞毒性T淋巴細胞應(yīng)答增加有關(guān)[60]。佐劑的使用對mRNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的強度以及廣度產(chǎn)生重要影響，佐劑的多樣性為衣原體mRNA疫苗的佐劑選擇方面提供了多種可能性(表3)，也帶來了許多機遇和挑戰(zhàn)。

2.4 免疫途徑 選擇合適的mRNA疫苗免疫途徑對抗原的表達以及免疫反應(yīng)的效力十分重要[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過粘膜途徑遞送疫苗可以使抗原與粘膜相關(guān)的淋巴樣組織(MALT)相互作用，從而誘導(dǎo)粘膜免疫和全身免疫應(yīng)答[66]。作為粘膜給藥途徑之一，鼻內(nèi)接種mRNA疫苗可提供針對大流行疾病的即時免疫保護[67]。由于衣原體是粘膜相關(guān)病原體，所以，可以產(chǎn)生有效粘膜反應(yīng)的免疫策略是衣原體疫苗研發(fā)的熱點，有研究表明Ct疫苗通過鼻內(nèi)或舌下給藥可在生殖道上誘導(dǎo)強大的粘膜免疫力，雖然粘膜免疫可能是在生殖道建立免疫的最直接方法，但粘膜免疫仍然面臨上皮屏障以及抗原降解等問題[68-69]。有研究表明，用紫外線滅活的Ct經(jīng)黏膜免疫(子宮內(nèi)或鼻內(nèi)接種)后，可形成保護性CD4+Th1細胞，而Th1型細胞因子在抗衣原體感染及清除衣原體中發(fā)揮重要作用。另外，粘膜免疫的保護作用取決于組織常駐記憶T細胞和循環(huán)記憶T細胞這兩種記憶T細胞亞群的協(xié)同作用，其中，組織駐留記憶T細胞能夠即刻識別通過局部組織進入的病原體，并誘導(dǎo)強大的局部免疫反應(yīng)來限

表3 mRNA疫苗常用佐劑Tab.3 Adjuvants for mRNA vaccines

制感染的擴散[70-72]。由此可見，黏膜免疫途徑可成為衣原體等黏膜相關(guān)病原體mRNA疫苗重要的有效疫苗接種途徑。除此之外，目前mRNA疫苗接種的途徑還包括[67, 73-74]:皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)以及靜脈內(nèi)給藥等方式(表4)。其中，皮內(nèi)、皮下以及肌內(nèi)注射是抗感染性疾病mRNA疫苗的主要免疫途徑，而靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)給藥常在需要抗原全身表達時選用，主要發(fā)揮治療作用[8]。有研究表明，與皮內(nèi)注射相比，皮下注射允許更大的注射量，但皮下區(qū)的吸收速率很慢，可能會導(dǎo)致mRNA疫苗意外降解[75]。而相比于皮內(nèi)、皮下注射，肌內(nèi)注射引起的局部副作用更小，所以，肌肉注射是佐劑疫苗使用廣泛的給藥途徑[76]。

表4 mRNA疫苗主要免疫途徑[24, 66]Tab.4 Major immunization routes of mRNA vaccines

3 展 望

研發(fā)安全有效的疫苗以預(yù)防衣原體感染是促進人類衛(wèi)生和畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要手段之一。雖然目前尚無衣原體mRNA疫苗相關(guān)文獻報道，但有研究表明通過使用體外構(gòu)建的結(jié)核分枝桿菌Ag85B-mRNA疫苗免疫小鼠，可誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，并刺激機體產(chǎn)生高水平IFN-γ[18]。IFN-γ是宿主抗結(jié)核分枝桿菌及衣原體在內(nèi)的胞內(nèi)病原體感染的重要細胞因子。此外，COVID-19 mRNA疫苗BNT162b1可誘導(dǎo)宿主Th1型細胞免疫應(yīng)答，而Th1型免疫應(yīng)答在宿主清除衣原體感染過程中起關(guān)鍵作用[32, 77]?；趍RNA疫苗在抗傳染性疾病方面的應(yīng)用，證明mRNA疫苗在抗衣原體感染方面具有一定潛在應(yīng)用價值，但衣原體mRNA疫苗是否可以獲得成功仍存在一定的風(fēng)險。不同衣原體菌株之間的毒力特性不一、感染途徑多樣、感染劑量不等以及宿主的免疫反應(yīng)程度不同等眾多方面的差異，可能會導(dǎo)致宿主發(fā)生疾病的形式、進程以及嚴(yán)重程度也會有所不同。此外，由于衣原體感染后能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答，這種特異性細胞免疫和體液免疫在機體清除衣原體過程中起一定作用，但同時也有可能會因此產(chǎn)生免疫病理損傷，而免疫病理損傷又有可能會促進衣原體感染引起的炎性損傷，所以，在設(shè)計預(yù)防性而非治療性的理想抗衣原體感染mRNA疫苗時，需要對疫苗誘導(dǎo)的機體免疫應(yīng)答程度做謹(jǐn)慎合理的把控，使得疫苗誘導(dǎo)合理適宜的保護性免疫應(yīng)答，從而保證疫苗具有高效的預(yù)防性同時也具備良好的安全性。在衣原體mRNA疫苗設(shè)計過程中，目標(biāo)抗原的選擇、抗原遞送方式、佐劑的使用以及免疫策略選擇等環(huán)節(jié)均可能對mRNA的表達以及mRNA疫苗的免疫保護效力產(chǎn)生重要影響。所以，設(shè)計安全且有效的抗衣原體感染mRNA疫苗還面臨許多風(fēng)險和挑戰(zhàn)，有待學(xué)者們繼續(xù)進行探索研究。

利益沖突：無

引用本文格式：金盈圻，王宗保，王川. 衣原體mRNA疫苗的研發(fā)對策與展望[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(4)：349-358. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.032