2019-2020年湖北部分地區(qū)G9P[8]型人輪狀病毒基因特征

楊立君，陳 月，米文琴，唐一通，范久波，王 媛，廖詩英，陳煥春，何啟蓋，江云波

輪狀病毒(Rotavirus, RV)可導(dǎo)致5歲以下兒童和嬰幼兒感染急性胃腸炎，也可以感染豬、牛、犬貓等多種幼齡哺乳動物，引起腹瀉，是一種重要的人獸共患病原體。兒童患病時如果病情處理不當(dāng)，可能會導(dǎo)致嚴(yán)重脫水，最終引起死亡[1]；動物感染輪狀病毒會引起腹瀉，影響生產(chǎn)率乃至經(jīng)濟(jì)發(fā)展[2]。迄今為止，RV已經(jīng)從人類以及多種非人類的哺乳動物和鳥類中分離出。

RV屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)的輪狀病毒屬(Rotavirus)，根據(jù)VP6蛋白的抗原差異，可分為9個種(群)，分別命名為A、B、C、D、E、F、G、H和I，可能還有第10種J[3]。其中，A群輪狀病毒(RVA)是引起人及多種動物急性腹瀉的主要病原體。

RV基因組由分段的雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)共11個基因片段組成，包括6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4、VP6和VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP6)。除第11個片段編碼2個蛋白質(zhì)(NSP5和NSP6)外，其余所有片段均編碼1個病毒蛋白。外部衣殼蛋白VP4和VP7在病毒復(fù)制和誘導(dǎo)保護(hù)性免疫中具有重要作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，且在復(fù)制早期調(diào)節(jié)吸附和侵入。RV由胰蛋白酶切割VP4蛋白為VP5和VP8而激活，與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合，可直接穿過細(xì)胞膜或被囊泡包裹進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。不同RV毒株同源基因片段的非編碼區(qū)(untranslated regions, UTR)高度保守，包含基因特異性保守序列[4-5]。

輪狀病毒分類委員會提出了一種基于11個RVA基因組片段中編碼區(qū)核苷酸序列同源性臨界值的百分比的新輪狀病毒分類方案。Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx，x代表該命名下RV所相應(yīng)的基因型，對應(yīng)VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5/6的順序[6]。迄今為止，已從人類和動物中鑒定出RVA至少27種G、37種P、16種I、9種R、9種C、8種M、16種A、9種N、12種T、15種E和11種H基因型[6]。人輪狀病毒通常主要分為3種基因型毒株：1)類Wa株流行株，基因型為I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1，VP7和VP4基因型組合為G1P[8]、G3P[8]、G4P[8]和G9P[8]；2)類DS-1株流行株，基因型為G2-P[4]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2；3)類AU-1株流行株，基因型為G3-P[9]-I3-R3-C3-M3-A3-N3-T3-E3-H3[7]。

近年來，對人群中輪狀病毒進(jìn)行監(jiān)測的多個研究發(fā)現(xiàn)動物源輪狀病毒的基因型，且序列之間顯示出緊密的同源性，說明RV存在種間傳播，動物源輪狀病毒可跨種傳播感染人類[8-10]。本研究于2019-2020年間，收集湖北部分地區(qū)腹瀉病人的糞便相關(guān)樣品，開展RV的檢測及其病原的分離鑒定，同時進(jìn)行全基因組序列的測定，分析其11個基因片段的基因型，構(gòu)建各基因片段的進(jìn)化樹，研究其各基因片段的遺傳進(jìn)化關(guān)系，以期揭示湖北地區(qū)RVA毒株的臨床感染及其遺傳變異信息。為進(jìn)一步診斷和防控輪狀病毒的感染奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床材料 2019-2020年在湖北省武漢市和襄陽市采集腹瀉病人糞便樣品，分別采集腹瀉兒童樣品256份，成人腹瀉病人樣品63份，共319份。

1.2 試劑及細(xì)胞 Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒為艾科瑞生物公司產(chǎn)品；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；平末端克隆載體pEASY-blunt購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司；T4連接酶、dNTPs、Loading Buffer、DNA Marker、黏性末端載體pMD18-T購自寶生物工程(大連)有限公司；酵母浸出物和胰蛋白胨購自O(shè)XOID公司；Q5高保真酶購自為美國紐英倫生物(NEB)產(chǎn)品；KOD-Plus-Neo高保真酶購自東洋紡(上海)生物科學(xué)有限公司；2×Taq Plus Master Mix酶為南京諾維贊生物科技有限公司產(chǎn)品；西班牙瓊脂糖(biowest agarose)購自GENE TECH公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購于北京天根生物科技公司。

MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、不含EDTA胰酶、HEPES、胰蛋白酶及青鏈霉素雙抗購自GIBCO公司；MA104細(xì)胞購自武漢CCTCC細(xì)胞庫。

40%多聚甲醛溶液、0.1% Triton-X-100溶液購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司(Sigma-Aldrich)；牛血清白蛋白(第五組份)(BSA)購自北京博奧拓達(dá)生物公司；抗輪狀病毒VP6蛋白的單克隆抗體(2B4)購自Santa Cruz公司；Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗鼠熒光二抗和DAPI(4′,6′-diamidino-2-Phenylindole)為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。

1.3 輪狀病毒的檢測 取臨床糞便樣品0.2 g，加入800 μL PBS溶液，制成25%的懸液后進(jìn)行渦旋處理，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，放入離心機(jī)中，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取200 μL上清，利用Trizol試劑進(jìn)行病毒RNA提取，其余上清放入-80 ℃冰箱保存待用。根據(jù)艾科瑞生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書推薦體系和程序進(jìn)行病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄。利用特異性引物VP6-F和VP6-R(見表1)擴(kuò)增輪狀病毒的VP6基因，判定樣品的輪狀病毒感染的陰陽性。擴(kuò)增片段大小為1 356 bp。PCR反應(yīng)體系(25.0 μL)為：2×Taq Master Mix 12.5 μL、上游引物VP6-F 1 μL、下游引物VP6-R 1 μL、cDNA模板1 μL，H2O加至終體積25.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 15 s，49 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min 25 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小。隨后，用瓊脂糖膠DNA 回收試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，連接到pMD18-T載體送擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.4 輪狀病毒的分離培養(yǎng) 將-80 ℃凍存的陽性樣品的上清液通過0.22 μm濾膜過濾，收集病毒濾液。濾液中加入含終濃度為 10 μg/mL的胰蛋白酶，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中激活1 h，獲得激活的輪狀病毒液。

取已長成致密單層的MA-104細(xì)胞，棄液后用PBS洗細(xì)胞3次，加入激活的輪狀病毒液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每隔0.5 h輕晃病毒液，使病毒均勻、充分地吸附到細(xì)胞上。3 h后吸棄病毒液，用PBS洗細(xì)胞3次，加入含有終濃度為5 μg/mL胰蛋白酶的無血清的MEM維持液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。待接毒的細(xì)胞完全病變后直接置于-80 ℃，凍融3次后，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清(病毒液)分裝后保存于-80 ℃冰箱中，用于下一次接毒。陽性樣品均盲傳至第10代。

1.5 輪狀病毒的間接免疫熒光鑒定 按1.3中的方法檢測盲傳分離的病毒。參照文獻(xiàn)方法[11]進(jìn)行RVA間接免疫熒光鑒定。簡要步驟如下：將生長旺盛的MA104細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至80%左右時，接種激活的病毒液，同時設(shè)未接毒對照。待細(xì)胞80%病變后，吸棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS漂洗2次，每次5 min，4%多聚甲醛室溫固定15 min后吸棄，隨即用預(yù)冷的PBS漂洗3次，每次5 min。用含0.1% Triton-100的PBS室溫穿孔處理15 min后吸棄，再用預(yù)冷的PBS漂洗3次，5% BSA室溫封閉1 h，預(yù)冷的PBST漂洗3次，加入輪狀病毒單抗(2B4)，37 ℃ 作用1 h，預(yù)冷的PBS漂洗3次后，加入羊抗鼠熒光二抗(1∶500稀釋)，37 ℃避光反應(yīng)45 min，預(yù)冷的PBST漂洗3次，加入DAPI染色液，室溫避光作用7 min后，預(yù)冷的PBST漂洗3次，隨后，再用預(yù)冷的PBS漂洗3次，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 全基因組的克隆及序列測定 利用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

KOD-Plus-Neo酶的PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為：H2O 32 μL、10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL、1×2 mmol/L dNTPs 5 μL、25 mmol/L MgSO43 μL、上游引物(10 μmol/L each)1.5 μL、下游引物(10 μmol/L each)1.5 μL、相應(yīng)模板(cDNA)1 μL和KOD-Plus-Neo 1 μL。KOD-Plus-Neo酶的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min后進(jìn)入循環(huán)；94 ℃變性15 s，退火溫度根據(jù)各片段引物的Tm值決定，退火時間30 s，68 ℃延伸，其延伸時間根據(jù)片段長短決定，進(jìn)行45個循環(huán)。

Q5高保真DNA聚合酶的PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為H2O 32 μL、5×ReactionBuffer 10 μL、10 nmol/L dNTPs 1 μL、上游引物(10 μmol/L each) 2.5 μL、下游引物(10 μmol/L each) 2.5 μL、相應(yīng)模板(cDNA)1 μL和Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL。Q5高保真DNA聚合酶的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性30 s后進(jìn)入循環(huán)；98 ℃變性15 s，退火溫度根據(jù)各片段引物的Tm值決定，退火時間30 s，72 ℃延伸，其延伸時間根據(jù)片段長短決定，進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 ℃終延伸 5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，回收后連接到平末端載體pEASY-blunt后進(jìn)行克隆測序。對擴(kuò)增的各片段送擎科生物公司進(jìn)行序列測定。

1.7 基因組遺傳進(jìn)化分析 序列分析使用DNASTAR軟件中的Seqman程序，將序列拼接完整，采用BLAST和在線分型工具Rota C V2.0進(jìn)行在線分子定型，運(yùn)行MEGA X軟件利用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹各分枝置信度采用重抽樣法(Bootstrap)進(jìn)行自舉檢驗(yàn)，檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)置為1 000次。

2 結(jié) 果

2.1 湖北部分地區(qū)RV流行情況 本研究于2019-2020年期間，從湖北省武漢市和襄陽市采集腹瀉病人臨床糞便樣品共計(jì)319份。病人主要表現(xiàn)黃色水樣腹瀉。通過RT-PCR檢測，RV樣品陽性共69份，總陽性率為21.63%。其中兒童256份有60份陽性，陽性率23.44%。成人63份樣品中有9份為陽性，陽性率為14.29%。

2.2 RV的分離與鑒定 RT-PCR檢測輪狀病毒陽性的臨床糞便樣品，接種于MA-104細(xì)胞上進(jìn)行RV分離，盲傳至第6代后，有11份陽性樣品開始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)，連續(xù)傳代至第10代，細(xì)胞病變呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，并在培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)明顯病變。正常MA-104細(xì)胞形態(tài)清晰，生長良好(圖1)，病毒感染后，MA-104細(xì)胞出現(xiàn)脫落、皺縮、拉網(wǎng)等現(xiàn)象，脫落的細(xì)胞聚集成團(tuán)塊，如圖1B。將從糞檢樣品中分離得到的11株HRV毒株分別命名為RVA/Human/CHN/HB-1/2019、RVA/Human/CHN/HB-18/2019、RVA/Human/CHN/HB-19/2019、RVA/Human/CHN/HB-20/2019、RVA/Human/CHN/HB-22/2019、RVA/Human/CHN/HB-27/2019、RVA/Human/CHN/HB-28/2019、RVA/Human/CHN/HB-33/2019、RVA/Human/CHN/HB-43/2019、RVA/Human/CHN/HB-45/2019和RVA/Human/CHN/HB-109/2019。

對臨床陽性樣品在MA104細(xì)胞上的第10代培養(yǎng)毒進(jìn)行RT-PCR檢測(圖略)，測序結(jié)果經(jīng)Blast比對，其基因序列與人源RV的VP6序列100%相同，表明所有分離株確實(shí)為人輪狀病毒。

A：未接毒正常細(xì)胞對照；B：感染RV后的致病變細(xì)胞圖1 RV感染MA104細(xì)胞病變圖(400×)Fig.1 Cytopathology effects of MA104 cells infected with RV

MA-104細(xì)胞接毒24 h后經(jīng)過固定、透化、封閉，以及一抗和熒光二抗的特異性反應(yīng)作用后，在熒光顯微鏡下可觀察到病毒感染細(xì)胞出現(xiàn)特異性綠色熒光反應(yīng)。感染24 h后的熒光如圖2A所示。感染48 h后的熒光如圖2B所示。圖2B清楚地顯示了被病毒感染的細(xì)胞的特異性熒光染色，且48 h的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于24 h的熒光，表明RVA可以在MA-104細(xì)胞中穩(wěn)定地增殖。未接毒的MA-104細(xì)胞未見染色熒光(圖2C)。間接免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平證實(shí)，分離的病毒為輪狀病毒。并且通過不同感染時間的特異性熒光表明分離的輪狀病毒在MA-104細(xì)胞中具有較好的增殖能力。

A：病毒感染后24 h； B：病毒感染后48 h； C：未接毒細(xì)胞對照圖2 輪狀病毒的間接免疫熒光鑒定(400×)Fig.2 Rotavirus identification by indirect immunofluorescence

2.3 全基因組序列測定及基因型別分析 對11株HRV分離株進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，進(jìn)行序列測定。使用DNAStar的SeqMan軟件拼接11個基因片段的分段測序結(jié)果，獲得11株分離株的所有11個分節(jié)段的全基因組序列。所有分離株的11個基因片段序列均已上傳至GenBank。

序列分析結(jié)果顯示，3株RVA/Human/CHN/HB-19/2019、RVA/Human/CHN/HB-20/2019和RVA/Human/CHN/HB-43/2019分離株明顯屬于類Wa株輪狀病毒株?；蛐蜑镚9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1，而8株分離株NSP4基因序列分析歸屬為類DS-1株基因型毒株，但其他節(jié)段仍然為類Wa株基因型?；蛐蜑镚9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E2-H1。序列分析顯示其具有Wa株與DS-1株交叉重組的基因特征。

2.4 衣殼蛋白基因序列的遺傳進(jìn)化分析 利用BLAST軟件對分離株各序列比對選擇相應(yīng)毒株以及GenBank中不同譜系中的代表毒株分別進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

VP7全長序列長度1 061 bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)(Coding sequence, CDS)長度 981 bp，編碼326個氨基酸。11株分離株的VP7核苷酸序列均處于譜系Ⅲ中，聚在一個相對獨(dú)立的分支，序列之間核苷酸序列相似性介于98.7%～99.6%。與武漢的人源RVA/Human-wt/CHN/L2448/2019/G9P[8]毒株同源性最高，全基因序列相似性為99.53%，與中國其他的G9型RV毒株處在相對不同的進(jìn)化分支(圖3A)。

VP4全長序列長度2 359 bp，CDS長度2 337 bp，編碼778個氨基酸，均為P[8]型，序列之間核苷酸序列相似性為99.7%～99.8%。遺傳進(jìn)化表明分離株的 VP4基因序列均處于譜系III中，并且與中國P[8]型RV毒株處于相同的進(jìn)化分支，與武漢的人源RVA/Human-wt/CHN/L2448/2019/G9P[8]毒株同源性最高，相似性為99.7%(圖3B)。

VP6基因是輪狀病毒群特異性抗原，在A群輪狀病毒中相對保守。11株分離株的VP6全長序列長1 356 bp，CDS長1 194 bp，編碼397個氨基酸，均為I1型，遺傳進(jìn)化顯示VP6基因聚在I1型人源RV毒株之中，與武漢的RVA/Human-wt/CHN/L2448/2019/G9P[8]株親緣關(guān)系最近，相似性為99.85%(圖3C)。

2.5 NSP4基因序列的遺傳進(jìn)化分析 遺傳進(jìn)化分析顯示，3株輪狀病毒株的NSP4基因?yàn)镋1基因型，8株輪狀病毒株的NSP4基因?yàn)镋2基因型(圖4)。8株毒株在 Wa-like的基因型中具有 DS-1-like的NSP4 E2基因型特征，是一種具有明顯基因重組特征的新型輪狀病毒毒株，其比例占到了72.7%(8/11)。表明該型病毒株已成為新的國內(nèi)流行毒株。其與來自日本分離株Tokyo18-38同源性最高99.73%，與武漢的L2448/2019株同源性99.33%。

圖3 結(jié)構(gòu)蛋白VP7、VP4、VP6基因進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of structural proteins VP7, VP4 and VP6

圖4 非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4基因進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the nsp4 gene

3 討 論

RV感染是引起全世界5歲以下兒童胃腸炎的主要原因之一。與許多細(xì)菌性腸胃炎病原體不同，RV在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家都存在，且改善社會經(jīng)濟(jì)條件并不能減少RV的感染[12]。

1994-2013年，在中國關(guān)于RV的流行病學(xué)和臨床研究中最常報(bào)道就是G1/G3/G9P[8]和G2P[4]基因型[13-15]。自2012年以來在武漢G9P[8]已成為兒童和成人中RV最常見的基因型組合，并且一直占主導(dǎo)地位[13]。Yoshiki等2020年報(bào)道了發(fā)現(xiàn)日本一種新型的NSP4重配的G9P[8]-E2輪狀病毒株[15]，進(jìn)一步研究分析認(rèn)為其重配的祖先毒株是G9P[8]型和G2P[4]型毒株的E2基因型NSP4基因重配而產(chǎn)生的新型輪狀病毒株[16]。而同時期中國也分別不同地區(qū)監(jiān)測報(bào)道了G9P[8]-E2毒株JZ1812、JZ1811、JZ1903毒株和L2448、E5867、Z2768毒株[17]的流行感染。本研究發(fā)現(xiàn)流行于中國湖北地區(qū)的G9P[8]-E2型毒株，與國內(nèi)報(bào)道的流行毒株及日本發(fā)現(xiàn)的以及國內(nèi)流行的G9P[8]-E2重配毒株高度相似，屬于同型流行毒株。該型毒株可能會進(jìn)一步發(fā)展為輪狀病毒新的流行優(yōu)勢基因型毒株。

通過RV的全基因組測序表明，本研究中RVA/Human/CHN/HB-1/2019、RVA/Human/CHN/HB-18/2019、RVA/Human/CHN/HB-22/2019、RVA/Human/CHN/HB-27/2019、RVA/Human/CHN/HB-28/2019、RVA/Human/CHN/HB-33/2019、RVA/Human/CHN/HB-45/2019和RVA/Human/CHN/HB-109/2019共8株G9P[8]-E2毒株與武漢的G9P[8]型L2448毒株基因核苷酸序列相似性最高，并與北京的G9P[8] BJ-Q-194毒株、成都的 G9P[8] SC6毒株、江蘇的G9P[8] JS2016毒株、錦州的G9P[8] JZ1812毒株和昆明的G9P[8] km15093毒株基因核苷酸序列相似。且值得注意的是，這些G9P[8]毒株均在Wa-like的RV基因型中具有DS-1-like的NSP4基因的E2基因型。除NSP4基因E1和E2型的差異外，這11株G9P[8]毒株的其余基因序列均具有較高的相似性。文獻(xiàn)報(bào)道，湖北近年來均檢測到此新型G9P[8]-E2型毒株，表明該型RV已在武漢及湖北范圍內(nèi)廣泛傳播。NSP4蛋白在誘導(dǎo)感染動物腹瀉中扮演著類似腸毒素功能的獨(dú)特致病作用，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道研究顯示[13]，在武漢流行的RV毒株有G9P[8]和G2P[4]型，而G2P[4]型RV的NSP4基因?yàn)镋2型，日本報(bào)道發(fā)現(xiàn)的G9P[8]-E2毒株即是可能由G9P[8]毒株與G2P[4]毒株發(fā)生基因重組重配而形成的新型毒株[13]，而湖北地區(qū)近年流行的也主要是G9P[8]和G2P[4]型[13]。本研究分離的G9P[8]-E2病毒株是否由本地毒株重組形成，或者由其他地區(qū)流行傳入，亦或是由日本等周邊國家流行傳入，還需要進(jìn)一步流行病學(xué)和病原學(xué)分析研究才能確證。但明顯G9P[8]-E2病毒株已成為輪狀病毒流行地區(qū)的優(yōu)勢基因型毒株。

利益沖突：無

引用本文格式：楊立君，陳月，米文琴，等. 2019-2020年湖北部分地區(qū)G9P[8]型人輪狀病毒基因特征[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(4)：359-365. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.040