兩種檢測(cè)尼帕病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的比較與效果驗(yàn)證

肖舒奇，師永霞，夏 菡，危宏平，袁志明，3，黃 弋，3

尼帕病毒(Nipah virus, NiV)是一種高致病性的人獸共患病毒，屬于副黏膜病毒科(Paramyxoviridae)亨尼帕病毒屬(Henipavirus)。該病毒于1998年在馬來西亞的森美蘭州雙溪尼帕新城被首次發(fā)現(xiàn)，并于1999年在一家養(yǎng)豬場(chǎng)第1次引發(fā)疫情，造成大量生豬死亡。隨后，在孟加拉國(guó)、印度、新加坡、柬埔寨等國(guó)家出現(xiàn)了多次尼帕病毒引發(fā)的疫情，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的影響[1]。尼帕病毒主要的自然宿主是狐蝠科的果蝠，可以感染豬、牛、馬、山羊、貓、狗等多種動(dòng)物，其中在豬中具有高度傳染性，還可通過動(dòng)物或者被污染的食物直接傳播給人類，也可以直接人傳人[2-6]。人類感染尼帕病毒后，會(huì)出現(xiàn)急性呼吸道感染和致命性腦炎，也會(huì)有無癥狀感染者，病死率為40%～75%。在2018年5月的印度喀拉拉邦地區(qū)暴發(fā)的疫情病死率高達(dá)91%[7]。由于該病毒宿主廣泛，發(fā)病率和致死率高，目前沒有針對(duì)其感染的有效疫苗或藥物[8]，被列為生物危害四級(jí)病原(Risk group 4)。

目前，我國(guó)沒有出現(xiàn)尼帕病毒感染的病例，但考慮到尼帕病毒的自然宿主果蝠在我國(guó)的華南地區(qū)和東南部沿海島嶼也有分布，且和人畜的活動(dòng)范圍有廣泛的重疊，加上周邊國(guó)家地區(qū)的疫情狀況及頻繁的國(guó)際貿(mào)易來往，我國(guó)廣西、廣東、云南和海南等地存在尼帕病毒流行的風(fēng)險(xiǎn)[9-11]。因此，我國(guó)需要建立病毒的分離鑒定、核酸檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)等多種診斷方法，完善尼帕病毒監(jiān)測(cè)、預(yù)警和預(yù)報(bào)體系，降低尼帕病毒在我國(guó)流行的風(fēng)險(xiǎn)，保障人和動(dòng)物的生命安全，維護(hù)社會(huì)公共衛(wèi)生安全。

尼帕病毒是一種不分節(jié)段的單股負(fù)鏈的RNA病毒， 有囊膜和刺突， 病毒顆粒直徑為40 nm至600 nm。其基因組全長(zhǎng)約18.2 kb，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、糖蛋白(G)和大蛋白(L)[12-14]。NP在病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及病毒組裝發(fā)揮重要作用[15]，其基因序列保守，編碼區(qū)核苷酸同源性高于其他基因，本研究中比較和驗(yàn)證的方法均是以NP為目標(biāo)基因建立的核酸檢測(cè)方法。

尼帕病毒是生物危害四級(jí)(Risk group 4)病原，此前由于缺乏尼帕病毒來源，核酸檢測(cè)方法的驗(yàn)證通常只能使用質(zhì)粒、假病毒或者體外轉(zhuǎn)錄模板RNA作為模擬樣本，而本研究是國(guó)內(nèi)首次利用尼帕病毒樣品對(duì)兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TaqMan real-time RT-PCR)檢測(cè)方法進(jìn)行比較和驗(yàn)證，為實(shí)時(shí)熒光定量PCR核酸檢測(cè)方法的有效性提供了進(jìn)一步評(píng)估驗(yàn)證，為建立良好、有效和穩(wěn)定的診斷方法提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

表1 兩種尼帕病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法引物、探針序列Tab.1 TaqMan real-time RT-PCR primers and probes

1.2 體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品制備 選取合適的酶切位點(diǎn)，對(duì)含有尼帕病毒NP基因的質(zhì)粒(pGH-NiV-NP，奧科鼎盛(武漢)生物科技有限公司)進(jìn)行線性化。然后以純化的線性化質(zhì)粒DNA為模板 (E.Z.N.A.TMCycle-Pure Kit, Omega)，使用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7 (Promega)試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄[18]。轉(zhuǎn)錄后用DNase I (1U/μL, Beyotime)消化，并確認(rèn)無殘留DNA。待DNA完全被消化完之后，使用E.Z.N.A.TMMicroElute RNA Clean-up Kit (Omega)對(duì)RNA進(jìn)行純化處理，最后將得到的RNA標(biāo)準(zhǔn)品分裝保存在-80 ℃冰箱。

1.3 病毒滴度測(cè)定 尼帕病毒(Bangladesh)由武漢國(guó)家生物安全(四級(jí))實(shí)驗(yàn)室提供。取100 μL病毒進(jìn)行梯度稀釋(10-1～10-9)，加入前1 d鋪好Vero E6細(xì)胞的96孔板，每孔100 μL病毒稀釋液，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后，棄上清，每孔加入100 μL新鮮的含2% FBS (Gibco)的DMEM (Gibco)培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d后可觀察細(xì)胞病變，記錄結(jié)果。

克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV)、登革病毒(Dengue virus, DENV)、日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、 云南版納病毒(Banna virus, BAV)、艾比湖病毒(Ebinur Lake Virus, EBIV)、寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、西藏環(huán)狀病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)均由國(guó)家病毒資源庫(kù)提供。使用TRIzol LS(Invitrogen)試劑對(duì)上述病毒的細(xì)胞感染上清樣本進(jìn)行滅活并提取相應(yīng)的病毒RNA作為特異性分析的對(duì)照樣品。提取的RNA均保存于-80 ℃冰箱。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TaqMan real-time RT-PCR) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit (Vazyme)試劑盒，依據(jù)使用說明書配制反應(yīng)體系。每一個(gè)反應(yīng)體系包含10 μL 2×One Step Q Probe Mix 緩沖液，1 μL One Step Q Probe Enzyme Mix酶混合物，0.4 μL 上游引物 (10 μmol/L)，0.4 μL 下游引物 (10 μmol/L)，0.2 μL TaqMan 探針 (10 μmol/L)，6 μL RNase-free dd H2O和 2 μL RNA，總體積為20 μL。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96, Bio-Rad)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：50 ℃ 15 min, 95 ℃ 30 s，然后按95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在60 ℃采集熒光信號(hào)。

1.6 以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將濃度為0.38 ng/μL體外轉(zhuǎn)錄的RNA標(biāo)準(zhǔn)品按10倍梯度稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8)，使用RNase-free dd H2O稀釋，且作為陰性對(duì)照，用建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的體系和反應(yīng)條件確定兩種檢測(cè)方法的靈敏度，每種濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品平行做3個(gè)復(fù)孔，并分別重復(fù)檢測(cè)3次，繪制以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 以病毒RNA為模板的特異性和靈敏度分析 使用NiV-NP-Q和NiV-NP-UD兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法同時(shí)檢測(cè)NiV、DENV、JEV、BAV、EBIV、ZIKV、TIBOV、EBOV、CCHFV病毒的核酸，RNase-free dd H2O作為陰性對(duì)照，每種樣品重復(fù)3次。此外，使用兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別對(duì)梯度稀釋的尼帕病毒細(xì)胞感染上清樣本(101～107TCID50/mL)進(jìn)行檢測(cè)，以Log TCID50/mL為x軸、Ct值為y軸，繪制以已知滴度病毒RNA為模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 兩種檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，以體外轉(zhuǎn)錄RNA模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)(log RNA copies)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，NiV-NP-Q檢測(cè)方法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.427 9x+41.631,R2=1，NiV-NP-UD檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.336 1x+41.246,R2=1，均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，并且兩種方法的檢測(cè)靈敏度均為10 copies/μL。圖2為擴(kuò)增曲線。每種濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果一致，變異系數(shù)均小于5%，顯示兩種檢測(cè)方法都有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.2 特異性分析 從NiV、DENV、JEV、BAV、EBIV、ZIKV、TIBOV、EBOV和CCHFV病毒感染細(xì)胞上清中提取病毒核酸，所得核酸濃度分別為97.9 ng/μL (NiV)、2.5 ng/μL (DENV)、38.1 ng/μL (JEV)、4.0 ng/μL (BAV)、17.4 ng/μL (EBIV)、6.8 ng/μL (ZIKV)、11.5 ng/μL (TIBOV)、17.2 ng/μL (EBOV)和208.8 ng/μL (CCHFV)。用NiV-NP-Q和NiV-NP-UD兩種方法分別對(duì)上述病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。由圖可見只有NiV的檢測(cè)結(jié)果是陽性，其余均為陰性，說明2種方法對(duì)以上8種病毒沒有交叉擴(kuò)增，均具有較好的特異性。

圖1 兩種尼帕病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法靈敏度分析Fig.1 Sensitivity of two TaqMan real-time RT-PCR methods. Standard curves for NiV-NP-Q (a) and NiV-NP-UD (b) were constructed with seven 1∶10 dilutions ranging from 107 copies/μL to 101 copies/μL of in vitro transcribed RNA

圖2 兩種尼帕病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)體外轉(zhuǎn)錄RNA模板的擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves of nine 1∶10 dilutions ranging from 107 copies/μL to 10-1 copies/μL for in vitro transcribed RNA for NiV-NP-Q (a) and NiV-NP-UD (b)

圖3 兩種尼帕病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法特異性分析Fig.3 Specificity of two TaqMan real-time RT-PCR methods: (a) NiV-NP-Q, (b) NiV-NP-UD

2.3 兩種尼帕病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的驗(yàn)證 從10倍梯度稀釋的尼帕病毒感染細(xì)胞上清(107～101TCID50/mL)樣本中提取了病毒RNA，以該RNA為模板對(duì)兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果如圖4所示。以Log TCID50/mL為x軸、Ct值為y軸，分別獲得兩種方法相對(duì)應(yīng)的線性方程，結(jié)果顯示兩者之間具有較好的線性關(guān)系，且兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)限均可達(dá)10 TCID50/mL，具有較高的靈敏度。

圖4 兩種尼帕病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的驗(yàn)證及其以病毒RNA為模板的靈敏度分析Fig.4 Sensitivity of two TaqMan real-time RT-PCR methods. Standard curves for NiV-NP-Q (a) and NiV-NP-UD (b) were constructed with seven 1∶10 dilutions of viral RNA extracted from virus infected cell supernatants, ranging from 107 TCID50/mL to 101 TCID50/mL

3 討 論

尼帕病毒被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為對(duì)人類最危險(xiǎn)的病毒之一，由于其宿主范圍廣泛，傳播性強(qiáng)，感染后病死率高，研發(fā)其診斷、預(yù)防和治療方法刻不容緩[19-20]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好、效率高等優(yōu)點(diǎn)，在診斷方面發(fā)揮重要作用。

目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了一些尼帕病毒的定量PCR檢測(cè)方法，與這些方法相比，本研究中的方法具備更好或相當(dāng)?shù)撵`敏度和特異性。王浩等[11]同樣以N基因作為靶基因，建立TaqMan qRT-PCR方法，通過檢測(cè)RNA標(biāo)準(zhǔn)品得到的靈敏度為100 copies/μL，與之相比，本研究中的兩種方法具有更高的靈敏度。Jensen等[21]以F和G之間非編碼區(qū)基因?yàn)榘袠?biāo)建立qRT-PCR檢測(cè)方法，分別檢測(cè)了尼帕病毒的兩種毒株Malaysia和Bangladesh，以病毒細(xì)胞感染樣本為模板，其檢測(cè)得到的靈敏度均為10 pfu/mL，計(jì)算出相對(duì)應(yīng)的病毒RNA拷貝數(shù)為104copies/mL，結(jié)果與本研究相似，只是由于可使用的尼帕病毒毒株有限，本研究只針對(duì)Bangladesh毒株進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證。Guillaume等[12]以尼帕病毒的N基因?yàn)榘袠?biāo)建立了TaqMan探針RT-PCR法，對(duì)病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度約為1 pfu/mL，由于使用了不同的滴度單位，無法與本研究中涉及的兩種方法進(jìn)行直接的比較，我們今后可采取同樣的條件優(yōu)化該方法并進(jìn)行比較，為NiV的檢測(cè)方法提供更多參考。Feldman等[22]建立了TaqMan探針、SYBR Green和巢式3種RT-PCR檢測(cè)方法，認(rèn)為SYBR Green RT-PCR方法成本較低，對(duì)于調(diào)查大量潛在的未知亨尼帕病毒更經(jīng)濟(jì)實(shí)用，TaqMan探針檢測(cè)法更加靈敏，但價(jià)格較昂貴，用于定量檢測(cè)已知亨尼帕病毒更為準(zhǔn)確，我們的研究結(jié)果也顯示出TaqMan探針法具備靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)。

由于此前缺乏病毒來源，前期國(guó)內(nèi)研究人員建立的一些尼帕病毒的定量PCR檢測(cè)方法[10-11,17]僅僅使用DNA質(zhì)?；蛘唧w外轉(zhuǎn)錄RNA作為陽性模板，對(duì)檢測(cè)方法的評(píng)估具有一定的局限性。而本研究首次在國(guó)內(nèi)利用尼帕病毒感染上清樣本為檢測(cè)對(duì)象，同時(shí)設(shè)置了埃博拉病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、乙型腦炎病毒等病毒的感染上清樣本作為對(duì)照，對(duì)已建立的兩種方法進(jìn)行了特異性和靈敏度的驗(yàn)證，可以更為全面和真實(shí)地對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，以便更好地運(yùn)用到實(shí)際檢測(cè)工作中。目前仍缺乏NiV檢測(cè)方法的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，尤其是在一些欠發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，從而導(dǎo)致很多NiV感染未能得到準(zhǔn)確檢測(cè)的情況存在[15]，本研究對(duì)已經(jīng)建立的2種方法在同樣檢測(cè)條件下進(jìn)行了比較和驗(yàn)證，為標(biāo)準(zhǔn)化NiV的核酸檢測(cè)方法提供了參考。此外，已有研究顯示高質(zhì)量的病毒載量檢測(cè)對(duì)很多DNA或RNA病毒性疾病患者的治療和管理的必要性，如HIV/AIDS領(lǐng)域[23]，病毒感染者體內(nèi)的病毒載量可能與疾病治療效果和預(yù)后有重要提示意義。本研究以已知滴度的病毒液為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)梯度稀釋的病毒液進(jìn)行病毒RNA提取和檢測(cè)，建立了病毒滴度和Ct值之間的關(guān)系(圖4)，為臨床檢測(cè)和治療工作提供了參考。但值得注意的是，當(dāng)前我們國(guó)家沒有尼帕病毒感染的病例報(bào)道，缺乏尼帕病毒感染的臨床樣本，因此，今后還需要利用臨床樣本對(duì)以上方法進(jìn)一步評(píng)估，以明確實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床樣本的適用性。

尼帕病毒感染是WHO研發(fā)藍(lán)圖中的重點(diǎn)疾病。研發(fā)藍(lán)圖是指在流行病暴發(fā)之前或者暴發(fā)期間，為了研發(fā)診斷工具、疫苗、藥物、療法等相關(guān)技術(shù)而建立的全球戰(zhàn)略合作和防范平臺(tái)。但目前沒有針對(duì)尼帕病毒感染的藥物或疫苗，因此，診斷和發(fā)現(xiàn)是尼帕病毒防控的第一步。核酸檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)室常用診斷方法之一，定量PCR法具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)高效、靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)，已在病原診斷方面被廣泛應(yīng)用，成為必不可少的診斷工具之一，特別是在流行病暴發(fā)期間。我國(guó)已有正在運(yùn)行的生物安全四級(jí)(BSL-4)實(shí)驗(yàn)室，可以開展尼帕病毒等烈性病原相關(guān)的藥物和疫苗研究，為未來烈性病原的科研提供相關(guān)的技術(shù)支持。本研究依托武漢BSL-4實(shí)驗(yàn)室對(duì)前期建立的兩種尼帕病毒定量PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了比較和評(píng)估驗(yàn)證，為建立優(yōu)良、高效和穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室診斷方法提供了技術(shù)支撐。

(感謝武漢國(guó)家生物安全實(shí)驗(yàn)室全體工作人員在研究工作中提供的支持和幫助。)

利益沖突：無

引用本文格式：肖舒奇，師永霞，夏菡，等. 兩種檢測(cè)尼帕病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的比較與效果驗(yàn)證[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，38(4)：303-308. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.015