DNA識(shí)別受體介導(dǎo)的天然免疫參與抗痘病毒感染的研究進(jìn)展

成溫玉，雷霆宇，張博昕，景志忠

痘病毒是人類(lèi)研究最早的病毒，也是人類(lèi)利用病毒研發(fā)疫苗的開(kāi)端。作為一類(lèi)廣泛存在的人獸共患性病原，目前發(fā)現(xiàn)在隸屬脊椎動(dòng)物痘病毒亞科18個(gè)屬中，超過(guò)10種痘病毒具有感染人的能力，其中正痘病毒屬中的天花病毒(variola virus，VARV)、猴痘病毒(monkeypox virus，MPXV)、牛痘病毒(cowpox virus，CPXV)以及痘苗病毒(vaccinia virus，VACV)等對(duì)人類(lèi)的危害最大[1]。盡管人類(lèi)已經(jīng)消滅了天花，然而MPXV疫情在非洲及美洲人群中反復(fù)多次暴發(fā)且造成高達(dá)10%的致死率，以及CPXV和VACV等常引起人群零星發(fā)病甚至小規(guī)模的感染，給人類(lèi)的生命健康帶來(lái)極大的威脅[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，世界各地陸續(xù)取消了痘病毒免疫接種工作，痘病毒的易感人群不斷上升，人類(lèi)抵御痘病毒感染的能力減弱[1-2]。同時(shí)，羊口瘡、禽痘、綿羊痘、山羊痘及鼠痘在國(guó)內(nèi)外普遍流行，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和畜牧業(yè)的健康發(fā)展[1,3]。此外，2019年新疆發(fā)生的牛結(jié)節(jié)性皮膚病疫情表明，由結(jié)節(jié)性皮膚病病毒引起的又一外來(lái)痘病毒病傳入我國(guó)，現(xiàn)已在多個(gè)省份的牛群中呈流行趨勢(shì)，給我國(guó)的養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

宿主免疫細(xì)胞中存在一系列能夠識(shí)別病原微生物相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)，其是機(jī)體天然免疫防御病原微生物感染和啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[5]。當(dāng)病原微生物進(jìn)入機(jī)體時(shí)釋放的DNA、RNA、蛋白質(zhì)、多肽、脂類(lèi)、糖類(lèi)及其衍生物等PAMPs分別被不同的PRR識(shí)別后，經(jīng)過(guò)一系列級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)誘導(dǎo)干擾素(interferons，IFNs)、干擾素刺激基因(interferon stimulated genes，ISGs)以及炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗病原微生物感染的作用[6-7]。目前，已知Toll 樣受體(Toll like receptors，TLRs)家族中的TLR8和TLR9，AIM2樣受體(AIM2-like receptors)家族中的AIM2和IFI16(IFNγ-inducible protein 16)，DEAD-box解旋酶家族中的DDX9、DDX36和DDX41，以及cGAMP合成酶(cGAMP synthase，cGAS)、DNA依賴(lài)的蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)、DAI(DNA-dependent activator of interferon)等受體具有識(shí)別不同病原DNA的能力[5-7]。痘病毒作為一類(lèi)在胞質(zhì)中復(fù)制的DNA病毒，現(xiàn)已證實(shí)可被部分DNA受體識(shí)別并誘導(dǎo)抗病毒天然免疫反應(yīng)。為了系統(tǒng)性地了解宿主應(yīng)答痘病毒感染的天然免疫反應(yīng)機(jī)制，本文以實(shí)驗(yàn)室前期的研究為基礎(chǔ)并結(jié)合他人的研究成果，對(duì)DNA識(shí)別受體介導(dǎo)的天然免疫在痘病毒感染中的作用機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)概述。

1 Toll樣受體

TLRs是最早發(fā)現(xiàn)的PRR，人類(lèi)存在10個(gè)TLRs(TLR1～10)，小鼠則具有12個(gè)成員(TLR1～9、11～13)。TLR9是第1個(gè)被證實(shí)具有識(shí)別DNA能力的受體分子，其定位于細(xì)胞內(nèi)體的膜上，依賴(lài)于C端的亮氨酸富集重復(fù)區(qū)(leucine-rich repeat，LRR)識(shí)別dsDNA分子中未甲基化的CpG序列，并借助N端的TIR(Toll/IL-1 receptor domain)功能域招募接頭分子MyD88(myeloid differentiation factor 88)，分別通過(guò)NF-κB和IRF7調(diào)控促炎性細(xì)胞因子及I型IFNs的表達(dá)[7]。VACV是研究痘病毒的典型代表，其中弱毒株MAV(modified vaccinia virus Ankara)是根除天花的重要疫苗株，因其安全且免疫性良好，常被用于痘病毒的研究。目前，除了證實(shí)TLR9能夠識(shí)別MAV的感染之外，鼠痘病毒(ectromelia virus，ECTV)、黏液瘤病毒(myxoma virus，MYXV)以及羊口瘡病毒(orf virus，ORFV)都能被TLR9識(shí)別并誘導(dǎo)I型IFNs的表達(dá)[8-10]。同樣在山羊痘病毒(goatpox virus，GTPV)感染的山羊脾臟組織中，TLR9及I型IFNs也出現(xiàn)了顯著上調(diào)[11]，表明TLR9具有廣泛識(shí)別痘病毒感染的能力。在MAV感染的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)中，宿主可通過(guò)TLR9激活DCs的成熟分化并表達(dá)抗病毒細(xì)胞因子[12]。MyD88是TLRs家族蛋白(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9、TLR13)識(shí)別PAMP的關(guān)鍵接頭分子，對(duì)比MAV誘導(dǎo)TLR9-/-與MyD88-/-漿細(xì)胞樣DC(pDC)及小鼠中I型IFNs的表達(dá)顯示，缺失MyD88的pDC和小鼠中MAV誘導(dǎo)的IFN-α/β表達(dá)量低于TLR9-/-細(xì)胞及個(gè)體[12]。同樣在ECTV感染的細(xì)胞及小鼠中也表現(xiàn)出MyD88比TLR9對(duì)于I型IFNs的表達(dá)及小鼠的存活更重要[8-9]，表明機(jī)體中還存在不依賴(lài)TLR9但依賴(lài)MyD88的其他TLRs識(shí)別痘病毒感染的方式。

盡管MAV只是VACV缺失了部分基因的弱毒株，但是VACV活病毒卻不能誘導(dǎo)DCs產(chǎn)生I型IFNs[13]，而滅活的VACV以及VACV的基因組DNA則可通過(guò)MyD88激活pDC并誘導(dǎo)I型IFNs的表達(dá)[14]，暗示VACV存在拮抗宿主I型IFNs應(yīng)答的病毒蛋白。進(jìn)一步通過(guò)基因敲除鼠源pDCs中TLR9基因以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，VACV-DNA誘導(dǎo)的I型IFNs并非依賴(lài)于TLR9，而是TLR8[14]。雖然起初證實(shí)鼠源TLR8不具有識(shí)別功能，但后來(lái)在鼠源的pDCs中發(fā)現(xiàn)TLR8可識(shí)別VACV基因組DNA中富含poly(A)和poly(T)的序列并依賴(lài)于MyD88誘導(dǎo)I型IFNs的表達(dá)，同時(shí)動(dòng)物感染試驗(yàn)證實(shí)TLR8對(duì)于小鼠抗VACV感染起到至關(guān)重要的作用[15]。然而在Bauer等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)，TLR8在鼠源pDCs的表達(dá)量低且并不能介導(dǎo)poly(A) DNA激活NF-κB及TNF-α的表達(dá)；同樣在我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作也證實(shí)，鼠源TLR8不能識(shí)別富含A/T的DNA，這些結(jié)果暗示TLR8識(shí)別VACV的功能存在爭(zhēng)議，而Martinez等[15]證實(shí)TLR8識(shí)別VACV誘導(dǎo)I型IFNs的能力可能是與其他TLRs協(xié)同作用的結(jié)果。另外，現(xiàn)已明確TLR8主要識(shí)別ssRNA[17]，因此有關(guān)TLR8是否具備直接識(shí)別VACV及其他痘病毒DNA的功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。除了上述TLRs參與痘病毒的感染識(shí)別外，TLR2和TLR4被證實(shí)也參與了痘病毒感染引起的IFNs和炎癥因子的表達(dá)[18-19]。TLR2主要參與細(xì)菌細(xì)胞膜成分的識(shí)別，而在VACV感染小鼠的應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，TLR2通過(guò)MyD88激活NK細(xì)胞釋放IFN-γ和顆粒酶發(fā)揮抗VACV感染的作用[18]。然而在DCs應(yīng)答VACV感染時(shí)，TLR2并不能識(shí)別VACV，而是MyD88介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)起到重要作用[19]。由此可見(jiàn)在不同的細(xì)胞類(lèi)型中，TLR2識(shí)別VACV的能力存在差異，這可能是不同細(xì)胞類(lèi)型所具有的免疫機(jī)制存在差異。Hutchens等[20]利用VACV感染小鼠試驗(yàn)證實(shí)，TLR4可識(shí)別病毒粒子依賴(lài)于TRIF(TIR domain-containing adapter inducing interferon-β)介導(dǎo)TNF-α和IL-6的產(chǎn)生發(fā)揮抗病毒作用。而且VACV可編碼拮抗TLR4的病毒蛋白A46，敲除病毒的A46基因或使用TLR4的激活劑MC159可顯著提高DCs中NF-κB的活化和IFNs的表達(dá)[21-22]，也充分證實(shí)機(jī)體存在依賴(lài)于TLR4的抗痘病毒感染的免疫應(yīng)答。

2 AIM2樣受體

2.1 AIM2 AIM2是PHYIN蛋白家族中的代表性成員，也是第一個(gè)被鑒定能夠形成炎癥小體的DNA識(shí)別受體。AIM2主要識(shí)別胞質(zhì)中不少于80個(gè)堿基的dsDNA序列[23]。當(dāng)DNA結(jié)合到AIM2的HIN結(jié)構(gòu)域后發(fā)生寡聚化，使得N端的PYD結(jié)構(gòu)域與接頭分子ASC結(jié)合，誘導(dǎo)ASC寡聚化并激活炎癥小體。隨后，ASC依賴(lài)于自身的CARD結(jié)構(gòu)域與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1, caspase-1)的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而激活caspase-1，使得白細(xì)胞介素1β前體(pro-interleukin 1β, pro-IL-1β)和白細(xì)胞介素18前體(pro-interleukin 18, pro-IL-18)的剪切，最終成熟的IL-1β和IL-18分泌到胞漿中，從而介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)或細(xì)胞焦亡[23]。在Hornung等[24]首次驗(yàn)證AIM2具有識(shí)別dsDNA的研究中，利用VACV感染巨噬細(xì)胞證實(shí)AIM2可識(shí)別該病毒誘導(dǎo)caspase-1的活化及細(xì)胞死亡。同樣在以金絲雀痘病毒和雞痘病毒為載體的研究中也證實(shí)巨噬細(xì)胞表達(dá)的AIM2可識(shí)別這兩種病毒載體，并激活巨噬細(xì)胞強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[25]。我們實(shí)驗(yàn)室利用ECTV感染小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，AIM2能夠識(shí)別ECTV的感染并引發(fā)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。由此可見(jiàn)AIM2也具備廣泛識(shí)別痘病毒的能力。然而在非骨髓源的人類(lèi)細(xì)胞中盡管缺失AIM2功能，但MAV感染后卻依然誘導(dǎo)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，可見(jiàn)還有其他痘病毒識(shí)別受體應(yīng)答MAV的感染[26]。同時(shí)也表明AIM2的DNA識(shí)別功能具有細(xì)胞特異性，其在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮廣泛的DNA識(shí)別能力。

2.2 IFI16 IFI16也屬于PYHIN家族的一員，含有一個(gè)N端pyrin結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)C端HIN結(jié)構(gòu)域。IFI16是一種特殊的DNA受體，穿梭于胞核和胞質(zhì)間，在靜息狀態(tài)下其主要定位于細(xì)胞核[27]。當(dāng)外源性的DNA被HIN結(jié)構(gòu)域識(shí)別后，引起IFI16之間形成同源多聚體并定位于細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而募集STING，同時(shí)激活TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1, TBK1)，從而依賴(lài)于IRF3和NF-κB活化入核，促進(jìn)I型IFNs及ISGs的產(chǎn)生[27]。此外，IFI16也可以激活炎癥小體通路，誘導(dǎo)IL-1β和IL-18的成熟與分泌[27]。盡管痘病毒屬于胞質(zhì)DNA病毒，然而在VACV感染過(guò)程中依然可被IFI16識(shí)別，并且Unterholzner等[28]證實(shí)IFI16主要識(shí)別痘病毒基因組中一段保守的70 bp DNA序列。通過(guò)人工合成VACV的這段70mer雙鏈DNA，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可明顯刺激IFN-β，而單鏈的VACV 70mer DNA卻無(wú)法誘導(dǎo)IFN的表達(dá)。同樣在金絲雀痘病毒為載體的研究中發(fā)現(xiàn)，金絲雀痘病毒可通過(guò)IFI16-STING通路誘導(dǎo)I型IFNs的表達(dá)和炎癥反應(yīng)[25]。然而在敲除了IFI16基因的DC中，相較于野生型的DC，MAV誘導(dǎo)的I型IFNs并未在上述兩種基因型的細(xì)胞中表現(xiàn)出任何差異[13]。另外，對(duì)于小鼠感染致死性的ECTV而言，IFI16也并不是抵抗ECTV感染的關(guān)鍵PRR。當(dāng)小鼠缺失了IFI16基因后，無(wú)論是ECTV誘導(dǎo)機(jī)體IFNs的表達(dá)，還是感染鼠的肝臟組織中病毒載量都與野生型小鼠相差無(wú)幾[29]。由此可見(jiàn)，盡管IFI16能夠識(shí)別VACV 70 bp的DNA序列，但其并不是機(jī)體識(shí)別痘病毒的關(guān)鍵性PRR，并且，目前尚未發(fā)現(xiàn)痘病毒編碼的專(zhuān)門(mén)抑制IFI16功能的蛋白。

3 DEAD/H-box解旋酶

DEAD/H-box解旋酶是一類(lèi)參與RNA生物學(xué)代謝的蛋白分子，因其保守的Asp-Glu-Ala-Asp/His(D-E-A-D/H)氨基酸基序而得名，各分子在不同物種間非常保守，都包含由至少9個(gè)保守氨基酸序列組成的ATP水解酶和解旋酶結(jié)構(gòu)域[30]。自DDX58(RIG-I)、DHX58(LGP2)、MAD5等分子被發(fā)現(xiàn)具有識(shí)別病毒dsRNA并誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答能力以來(lái)，一系列成員被證實(shí)為PRR。其中DHX9、DHX36和DDX41被發(fā)現(xiàn)在樹(shù)突狀細(xì)胞中具備DNA識(shí)別能力[31]。2010年美國(guó)德州大學(xué)安德森癌癥中心Liu YJ率先證實(shí)了DHX9和DHX36在人源漿細(xì)胞樣DC中具有識(shí)別病原DNA的功能，其中DHX9依賴(lài)于DUF(domain of unknown function)結(jié)構(gòu)域，而DHX36依賴(lài)于DEAH結(jié)構(gòu)域，均可結(jié)合MyD88介導(dǎo)抗病毒天然免疫[32]。然而在人的單核細(xì)胞中DHX9并不表現(xiàn)出核酸識(shí)別能力，可見(jiàn)DHX9的核酸識(shí)別能力具有細(xì)胞特異性[33]。盡管當(dāng)前尚無(wú)DHX9和DHX36參與識(shí)別痘病毒感染的直接證據(jù)，但在MYXV感染的癌細(xì)胞中，DHX9表現(xiàn)出抑制病毒增殖的能力[34]。利用shRNA技術(shù)敲降癌細(xì)胞中DHX9的表達(dá)后，MYXV的復(fù)制能力顯著提高[34]，其在痘病毒復(fù)制的晚期形成一個(gè)被稱(chēng)作“DHX9抗病毒顆粒”的結(jié)構(gòu)抑制“病毒復(fù)制工廠”生成，從而限制病毒的增殖[35]。IL-6是PRR識(shí)別PAMP后產(chǎn)生的抗病毒重要細(xì)胞因子，痘病毒感染通常誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IL-6的分泌。研究發(fā)現(xiàn)，DHX9是調(diào)控IL-6啟動(dòng)子激活的重要因子，其通過(guò)NF-κB依賴(lài)的反式激活調(diào)控IL-6啟動(dòng)子活性，發(fā)揮抗病毒感染的作用[33]。然而在單核細(xì)胞中，痘病毒編碼的毒力因子E3則直接作用于DHX9，抑制了DHX9依賴(lài)的NF-κB反式激活，從而限制了抗病毒細(xì)胞因子的產(chǎn)生[33]。同樣在MYXV基因編碼的中也發(fā)現(xiàn)了E3同系物M029，參與調(diào)控DHX9的免疫應(yīng)答功能[36]。由此可見(jiàn)，DHX9在單核細(xì)胞中并不能直接識(shí)別痘病毒，而是參與了天然免疫應(yīng)答正向調(diào)節(jié)作用。對(duì)于DHX36在病毒感染中研究相對(duì)較少，較多的研究證據(jù)表明其有可能作為DHX9和DHX36的調(diào)節(jié)中介發(fā)揮抗病毒功能，有關(guān)其在痘病毒中的作用尚需深入解析。

DDX41的DNA識(shí)別能力也是由Liu YJ團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，其在髓系DC中均能識(shí)別poly(dA:dT)和poly(dG:dC)，并且在人源單核細(xì)胞THP-1中直接識(shí)別VACV的DNA[37]。DDX41依賴(lài)于其保守的DEADc結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA并在STING的介導(dǎo)下引發(fā)I型IFN和ISGs表達(dá)釋放[37]。然而在MVA感染的巨噬細(xì)胞中，利用shRNA敲降DDX41后并未對(duì)MVA誘導(dǎo)的TBK-1和IRF3磷酸化水平造成影響，暗示DDX41在巨噬細(xì)胞中或者對(duì)MAV的感染不具有識(shí)別功能[13]。盡管已有許多證據(jù)證實(shí)DDX41的DNA識(shí)別能力，但對(duì)其在痘病毒感染中的作用還需要進(jìn)一步探究，其有可能與DHX9和DHX36的功能類(lèi)似，只是作為調(diào)節(jié)因子參與了外源DNA誘導(dǎo)的抗病毒天然免疫反應(yīng)。

4 cGAS

cGAS是2013年美國(guó)德州西南醫(yī)學(xué)中心Chen ZJ團(tuán)隊(duì)首次證實(shí)的又一重要DNA識(shí)別受體，具有廣泛識(shí)別外源DNA的功能。cGAS屬于核苷酸轉(zhuǎn)移酶(nucleotide transferase，NTase)家族的一員，具有N-端的DNA結(jié)合區(qū)、中間的NTase結(jié)構(gòu)域和C-端的Mab21(male abnormal 21)結(jié)構(gòu)域[38]。cGAS在識(shí)別dsDNA時(shí)，通過(guò)構(gòu)象改變形成二聚體并與2個(gè)dsDNA以2∶2方式形成復(fù)合體，依賴(lài)于活性位點(diǎn)的改變催化ATP和GTP合成第二信使cGAMP。cGAMP擴(kuò)散至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并結(jié)合位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STING使其活化，進(jìn)一步招募TBK1且誘導(dǎo)IRF3磷酸化，從而誘導(dǎo)宿主Ⅰ型IFN的產(chǎn)生以及其他細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗病毒作用[38]。同時(shí)活化的STING也可直接激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，入核后調(diào)控炎癥因子及其他細(xì)胞因子表達(dá)[38]。

VACV作為DNA病毒的典型代表之一，可被cGAS識(shí)別并且誘導(dǎo)宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)。多個(gè)研究證實(shí)，無(wú)論是敲除細(xì)胞中還是小鼠體內(nèi)的cGAS-/-，VACV誘導(dǎo)的宿主Ⅰ型IFNs顯著降低且抗病毒能力明顯減弱[5-6,13]。同樣，對(duì)于VACV弱毒株的MAV以及滅活的MAV來(lái)說(shuō)，在常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞(conventional dendritic cells，cDC)中均可通過(guò)cGAS-STING通路誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生[6,13]。鑒于此，VACV也被廣泛用于cGAS的研究中。Ablasser等[39]在探究cGAS介導(dǎo)細(xì)胞間的天然免疫機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，VACV感染細(xì)胞通過(guò)cGAS合成的cGAMP可利用細(xì)胞間的縫隙連接激活相鄰細(xì)胞天然免疫反應(yīng)。同時(shí)，在被VACV感染的細(xì)胞中，由cGAS合成的cGAMP可被包裹進(jìn)病毒粒子，隨著病毒粒子的釋放并感染新的細(xì)胞，可將cGAMP傳遞且激活新細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)[40]。由此揭示了cGAMP作為信使分子在介導(dǎo)相鄰細(xì)胞產(chǎn)生快速免疫應(yīng)答反應(yīng)中起到重要作用。同時(shí)，借助于VACV，多個(gè)宿主蛋白(如鋅指蛋白ZCCHC3、羧肽酶CCP5/CCP6、谷氨酸化酶TTLL4/TTLL6以及GTP酶RAB2B)被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控cGAS-STING介導(dǎo)的抗痘病毒感染中發(fā)揮重要作用[41-43]。盡管上述研究均證實(shí)cGAS在識(shí)別痘病毒感染并發(fā)揮抗病毒天然免疫的發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而在VACV感染的多個(gè)細(xì)胞系(鼠角質(zhì)細(xì)胞308、巨噬細(xì)胞NR9456和樹(shù)突狀細(xì)胞)中卻未能檢測(cè)到cGAS介導(dǎo)的Ⅰ型IFNs表達(dá)[6]。由此可見(jiàn)，痘病毒具有逃逸cGAS介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)的能力?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，由VACV B2R基因編碼的痘病毒免疫核酸酶(poxvirus immune nucleases，poxins)能夠降解cGAS-STING通路中的cGAMP，使得STING無(wú)法被激活，阻礙了宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)[44]。當(dāng)敲除B2R基因后病毒的復(fù)制并未受到影響，但在感染小鼠臟器組織中的病毒滴度卻顯著降低，可見(jiàn)poxins是VACV重要的毒力蛋白，并且該基因在大多數(shù)痘病毒的基因組中都存在[44]。除了poxins之外，VACV編碼的F17通過(guò)干擾cGAS的調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合體mTOR使得cGAS調(diào)控受阻從而阻礙了cGAS-STING通路的激活，限制了Ⅰ型IFNs和ISGs的表達(dá)[45]。由此可見(jiàn)痘病毒在對(duì)抗宿主應(yīng)答過(guò)程中豐富的逃逸策略，同時(shí)也反映出宿主cGAS-STING在抵抗痘病毒感染的重要功能。

除了VACV之外，ECTV在感染過(guò)程中也可被cGAS識(shí)別。我們實(shí)驗(yàn)室通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)小鼠cGAS不僅可以識(shí)別人工合成的dsDNA，而且可識(shí)別滅活的ECTV[5]。進(jìn)一步利用基因敲除手段證實(shí)小鼠通過(guò)cGAS-STING-TBK1-IRF3/IRF7信號(hào)通路參與了ECTV誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生，且cGAS和STING具有限制ECTV增殖的能力[46]。隨后Wong等[29]也證實(shí)了ECTV通過(guò)cGAS-STING通路誘導(dǎo)宿主Ⅰ型IFN的分泌，并且可通過(guò)外源注射cGAMP挽救ECTV感染小鼠因缺失cGAS基因造成致死現(xiàn)象，由此可見(jiàn)cGAS在小鼠抗ECTV感染中的重要作用。值得注意的是，我們利用ECTV分別感染TLR9-/-、STINGgt/gt和cGAS-/-小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，TLR9-/-小鼠對(duì)ECTV更易感且致死率更高，可見(jiàn)TLR9在抗ECTV感染中表現(xiàn)出更為重要的作用[5,46]。類(lèi)似于VACV poxins，ECTV編碼的Schlafen蛋白也具有抑制cGAS-STING通路的作用，其具有核酸酶的作用，很可能與poxins的作用機(jī)制相似，通過(guò)降解cGAS合成的cGAMP阻礙cGAS-STING介導(dǎo)的I型IFN反應(yīng)[47]。

5 其他DNA識(shí)別受體

除上述DNA識(shí)別受體介導(dǎo)宿主抗痘病毒感染之外，DNA-PK、DAI等DNA識(shí)別受體也參與了痘病毒的感染[48-49]。DNA-PK是由Ku70、Ku80和DNA依賴(lài)性蛋白激酶催化亞基(DNA-PKcs)組成的異源三聚體蛋白復(fù)合物，是負(fù)責(zé)DNA損傷修復(fù)過(guò)程中非同源性末端接合反應(yīng)的關(guān)鍵性酶[48]。Ferguson等[48]于2012年首次在成纖維細(xì)胞(MEF)中證實(shí)DNA-PK具有識(shí)別外源DNA并誘導(dǎo)宿主天然免疫的功能，其不僅可以識(shí)別VACV基因組DNA，而且在不依賴(lài)于蛋白激酶的作用下可被MAV激活經(jīng)由IRF3誘導(dǎo)MEF的I型IFN反應(yīng)。盡管DNA-PK在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中，Ku是結(jié)合DNA主要位點(diǎn)，但在介導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)過(guò)程中DNA-PKcs卻發(fā)揮更為重要作用，敲除小鼠DNA-PKcs基因(DNA-PKcs-/-)后，MAV誘導(dǎo)小鼠的I型IFN和IL-6顯著降低[48]。目前，尚無(wú)直接證據(jù)證實(shí)DNA-PK可識(shí)別VACV并介導(dǎo)宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)，但已發(fā)現(xiàn)VACV編碼的C4和C16蛋白具有抑制DNA-PK識(shí)別DNA的功能，而這兩種蛋白在MAV中均缺失。C16通過(guò)結(jié)合Ku異二聚體阻礙了DNA-PKcs對(duì)DNA的結(jié)合，使得DNA-PK依賴(lài)的DNA識(shí)別通路受阻，造成細(xì)胞因子表達(dá)量降低[50]。C4則通過(guò)自身的C端與Ku結(jié)合阻斷了與DNA的結(jié)合，從而逃逸宿主DNA-PK對(duì)DNA的識(shí)別[51]。由此反映出DNA-PK原本在識(shí)別痘病毒感染中起到重要作用，但病毒在進(jìn)化中建立了相對(duì)應(yīng)的逃逸策略。

DAI(亦稱(chēng)ZBP1)是2007年Takaoka等[49]證實(shí)的又一個(gè)胞質(zhì)DNA識(shí)別受體，其通過(guò)STING經(jīng)由IRF3調(diào)控宿主天然免疫反應(yīng)。在小鼠的成纖維細(xì)胞(L929)中，DAI可識(shí)別VACV基因組DNA并誘導(dǎo)IFN-β的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，然而敲除小鼠DAI基因(DAI-/-)后，VACV對(duì)小鼠的致死率以及免疫應(yīng)答并無(wú)顯著影響[49]。在ECTV感染過(guò)程中，我們利用熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)其DAI在不同感染時(shí)間點(diǎn)以及不同組織出現(xiàn)了顯著性的轉(zhuǎn)錄變化[52]，但Xu等[8]證實(shí)敲除DAI基因的小鼠對(duì)ECTV的感染無(wú)差異，由此可見(jiàn)DAI并不是識(shí)別痘病毒感染的關(guān)鍵受體。除了參與調(diào)控宿主I型IFN應(yīng)答之外，DAI被發(fā)現(xiàn)在病原微生物感染誘導(dǎo)的壞死性凋亡(necroptosis)和炎癥反應(yīng)中起到一定的作用，其在不依賴(lài)受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)的情況下識(shí)別dsDNA通過(guò)RIPK3誘導(dǎo)壞死性凋亡并引起炎癥反應(yīng)[53]。在鼠巨細(xì)胞病毒感染的宿主細(xì)胞應(yīng)答研究中證實(shí)，DAI是識(shí)別病毒dsDNA并誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡關(guān)鍵受體[54]，但在敲除小鼠DAI基因(DAI-/-)后，小鼠卻對(duì)ECTV和VACV的敏感性沒(méi)有差異[8,42]，表明DAI在痘病毒感染中并未發(fā)揮重要作用。

另外，RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymerase III)、高遷移率族蛋白B(high mobility group box，HMGB)、富亮氨酸重復(fù)序列互作蛋白1(leucine-rich repeat in flightless-1 interaction protein 1，LRRFIP1)和減數(shù)分裂重組蛋白11同系物 A(meiotic recombination 11 homolog A，Mre11)等都被發(fā)現(xiàn)具有識(shí)別病毒DNA并介導(dǎo)I型IFN反應(yīng)[46,52]。然而，這些DNA受體被證實(shí)并非是識(shí)別病毒DNA的關(guān)鍵，甚至是多余的，而且具有細(xì)胞特異性。目前有關(guān)這些DNA識(shí)別受體在痘病毒的感染研究中較少，其在痘病毒感染中的功能有待深入探究。

6 小 結(jié)

痘病毒是已知病毒粒子中基因組最大、最復(fù)雜的一類(lèi)胞質(zhì)DNA病毒。痘病毒感染過(guò)程中釋放的dsDNA作為危險(xiǎn)信號(hào)可被宿主細(xì)胞中的一系列DNA識(shí)別受體識(shí)別后，激發(fā)機(jī)體天然免疫反應(yīng)。目前已通過(guò)體外細(xì)胞系和/或小鼠感染證實(shí)多種受體可識(shí)別痘病毒的PAMP，盡管這些受體具有一定的細(xì)胞特異性，然而痘病毒廣泛的細(xì)胞和組織嗜性，以及復(fù)雜的復(fù)制過(guò)程，使得機(jī)體中多種PRR參與識(shí)別病毒的感染并發(fā)揮抗病毒作用。在這些眾多的DNA受體中，TLR8、TLR9、DHX9和DHX36依賴(lài)于MyD88，而cGAS、IFI16、DDX41和DNA-PK依賴(lài)于STING，進(jìn)一步都通過(guò)TBK1-IRF3/7和IKK-NF-κB介導(dǎo)I型IFNs和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。利用痘病毒感染敲除DNA受體基因的研究證實(shí)，TLR9和cGAS是識(shí)別并發(fā)揮抗痘病毒感染的關(guān)鍵受體，且TLR9似乎比cGAS更為重要，這與二者調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)以及病毒的逃逸策略有關(guān)。TLR9位于胞內(nèi)膜(細(xì)胞內(nèi)體、溶酶體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜)中，痘病毒依賴(lài)膜融合的方式進(jìn)入胞內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)中完成基因組復(fù)制，因此，TLR9 優(yōu)先識(shí)別痘病毒基因組中未甲基化的CpG序列介導(dǎo)天然免疫防御；而一些病毒DNA進(jìn)入胞質(zhì)，被定位于胞質(zhì)中cGAS識(shí)別，通過(guò)STING誘導(dǎo)Ⅰ型IFNs的產(chǎn)生。TLR9能夠誘導(dǎo)全身性Ⅰ型IFNs的表達(dá)，而cGAS只誘導(dǎo)局部性的免疫應(yīng)答。其他DNA識(shí)別受體則因?yàn)榧?xì)胞特異性只發(fā)揮了一定的抗病毒作用。然而在痘病毒與宿主長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中，進(jìn)化出一系列逃逸宿主DNA識(shí)別的策略，痘病毒編碼的蛋白靶向作用于DNA識(shí)別或相應(yīng)的信號(hào)通路從而拮抗宿主免疫應(yīng)答。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)參與拮抗宿主天然免疫應(yīng)答的痘病毒蛋白，然而痘病毒基因組編碼大約200多個(gè)蛋白，是否還有其他病毒蛋白參與調(diào)控宿主免疫應(yīng)答有待進(jìn)一步探究。同時(shí)，宿主中是否還存在未被證實(shí)的DNA識(shí)別受體以及受體之間相互作用的機(jī)制有待深入探討。這為闡明痘病毒的致病與免疫機(jī)制以及其痘病毒病的防控提供了新策略和方向。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：成溫玉，雷霆宇，張博昕，等. DNA識(shí)別受體介導(dǎo)的天然免疫參與抗痘病毒感染的研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(4)：341-348. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.036