雙抗原夾心ELISA法檢測(cè)登革病毒感染患者血清中的EDⅢ抗體

丁細(xì)霞，蔡建飄，溫 坤，詹利利，宋嘉齡，陳滿

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球每年超過(guò)1億人感染登革病毒，其中50萬(wàn)人發(fā)展成為登革出血熱，死亡人數(shù)超過(guò)25 000人。隨著全球氣候變暖、國(guó)際旅游業(yè)和城市化等因素影響，登革熱的發(fā)病率逐年上升。近年來(lái)我國(guó)登革熱疫情越發(fā)嚴(yán)重，2002年、2006年和2014年在廣東省分別出現(xiàn)登革熱大流行，受感染人數(shù)已超45 171人[1-2]。而迄今為止，人類對(duì)登革熱仍無(wú)特效治療藥物及安全有效疫苗[3]。臨床實(shí)踐證明早期診斷、及時(shí)臨床救治可以有效減少登革熱的病死率。我們前期利用登革病毒NS1蛋白特異性單克隆抗體建立雙抗體夾心抗原檢測(cè)方法，該方法能區(qū)分4個(gè)血清型登革病毒感染，具有很好的特異性和敏感性[4]。并分析了登革病毒感染患者血清中的NS1抗原和抗體的動(dòng)態(tài)過(guò)程，證實(shí)了聯(lián)合抗原和抗體檢測(cè)能夠明顯提高登革病毒感染的檢出率[5]。為了獲得一套完整的抗原、抗體檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)登革病毒感染的全程診斷。我們利用前期表達(dá)的EDⅢ蛋白建立一種雙抗原夾心抗體檢測(cè)方法，該方法與傳統(tǒng)的間接法或抗體捕獲法不同，利用兩種抗原夾心來(lái)捕獲血清中的抗體，具有更高靈敏度和特異度。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 酶聯(lián)板(costar，Coming，美國(guó))，TMB顯色液(KPL，美國(guó))，HRP(Sigma．Aldrich，美國(guó))，RPMI 1640、MEM培養(yǎng)基和胎牛血清(GIBCO,美國(guó))，SPF級(jí)雌性10-12周Balb/c小鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，登革病毒核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州達(dá)安基因股份有限公司，登革病毒NS1抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司，登革病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒(Panbio，澳洲)，其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 質(zhì)粒、菌種、抗體和細(xì)胞株 4個(gè)血清型的DENV標(biāo)準(zhǔn)株和白蚊伊蚊C6/36細(xì)胞由廣州市疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)。重組的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白為本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞表達(dá)并經(jīng)鎳柱純化所獲得，該蛋白經(jīng)登革病毒免疫的動(dòng)物血清證實(shí)具有良好的抗原性[6]。1-4型登革病毒EDⅢ蛋白特異性單抗隆抗體和西尼羅病毒NS1單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室保存。登革病毒NS1抗原檢測(cè)方法為本實(shí)驗(yàn)室前期建立。

1.3 血清標(biāo)本 1-4型登革病毒EDⅢ蛋白分別免疫的小鼠血清、1-4型登革病毒EDⅢ蛋白混合后免疫的小鼠血清和1型登革病毒EDⅢ蛋白免疫的兔血清、AF-MP1免疫的小鼠血清和兔血清為本實(shí)驗(yàn)室前期免疫動(dòng)物獲得；184例健康人群血清標(biāo)本來(lái)源于珠江醫(yī)院健康人群體檢血清，168例臨床確診的登革熱患者血清標(biāo)本(其中1型登革病毒感染患者血清167份，2型登革病毒感染患者血清1份)來(lái)源于2014年廣州市登革熱疫情暴發(fā)時(shí)珠江醫(yī)院收集的門診和住院登革熱患者血清，所有血清標(biāo)本均經(jīng)PCR或者NS1抗原檢測(cè)陽(yáng)性。

1.4 HRP標(biāo)記1-4型登革病毒EDⅢ蛋白及效價(jià)測(cè)定 采用改良的過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記1-4型登革病毒EDⅢ蛋白。操作簡(jiǎn)述如下：稱取4 mg辣根過(guò)氧化物酶攪拌溶解于1 mL蒸餾水中，加入0.1 mol/L過(guò)碘酸鈉0.2 mL，室溫避光反應(yīng)30 min，用1 mmol/L pH4.4醋酸鈉緩沖液于4 ℃透析去除多余的過(guò)碘酸鈉，并用碳酸鹽緩沖液(0.2 mol/L pH=9.5)調(diào)節(jié)pH值至9.0，并加入到 1 mg 經(jīng)碳酸鹽緩沖液(0.2 mol/L pH9.5)透析過(guò)的EDⅢ蛋白中，室溫下避光反應(yīng)2 h，最后加入100 μL 新配4 mg/mL硼氫化鈉，4 ℃避光靜置2 h后，用PBS于4 ℃避光透析，加入終濃度為50%的甘油-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

并分別以10 μg/mL的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白特異性單抗隆抗體包被聚苯乙烯微孔板，并以抗西尼羅病毒NS1蛋白特異性單克隆抗體為無(wú)關(guān)對(duì)照，分別加入梯度稀釋的HRP標(biāo)記的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白，以相同稀釋度下抗登革病毒EDⅡ蛋白特異性抗體包被板條檢測(cè)OD450值/無(wú)關(guān)對(duì)照OD450值(P/N值)≥2.1為該HRP標(biāo)記蛋白的效價(jià)。

1.5 雙抗原夾心ELISA法的建立 以1-4型登革病毒EDⅢ蛋白(按1∶1∶1∶1濃度比)為捕獲抗原，HRP標(biāo)記的4個(gè)血清型登革病毒EDⅢ蛋白(HRP-EDⅢ)為檢測(cè)抗原用于建立雙抗原夾心抗體檢測(cè)方法。簡(jiǎn)述如下：將1-4型登革病毒EDⅢ蛋白(按1∶1∶1∶1比例混合后)分別按(0.05 μg/ mL，0.1 μg/ mL，0.2 μg/ mL，0.5 μg/ mL，0.8 μg/ mL，1 μg/ mL)6個(gè)不同蛋白濃度包被聚苯乙烯微孔板，4 ℃包被16 h后，用0.25%的酪蛋白封閉液4 ℃封閉24 h后，分別加入不同稀釋度的EDⅢ蛋白免疫小鼠血清，并以曲霉AF-MP蛋白免疫小鼠的鼠血清為陰性對(duì)照，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板5次后，加入100 μL/孔不同稀釋度(1∶200，1∶500，1∶1 000，1∶2 000)的HRP-EDⅢ蛋白，37 ℃孵育30 min，洗板8次后，加入100 μL/孔的TMB，室溫避光顯色10 min，1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定A450值。

1.6 雙抗原夾心檢測(cè)方法的特異性和敏感性 利用所建立的雙抗原夾心ELISA法分別檢測(cè)1-4型登革病毒EDⅢ蛋白免疫的小鼠血清和1型登革病毒免疫的兔血清，以曲霉AF-MP蛋白免疫的小鼠血清[7]和兔血清為陰性對(duì)照，評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的敏感性和特異性。

1.7 雙抗原夾心檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用 利用上述建立檢測(cè)方法對(duì)184份珠江醫(yī)院門診健康體檢者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)以確定檢測(cè)方法的臨界值。并以此為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)臨床確診的168例登革熱患者血清標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)與Panbio MAC ELISA試劑盒進(jìn)行同步比較，并分析3種檢測(cè)方法對(duì)不同時(shí)期登革熱患者檢測(cè)的敏感性。

1.8 登革病毒NS1抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)臨床標(biāo)本 具體操作參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]，簡(jiǎn)述如下：抗登革病毒NS1單抗包被的酶聯(lián)板，分別加入1∶10稀釋的登革患者血清標(biāo)本，并以健康體檢血清標(biāo)本為陰性對(duì)照，37 ℃孵育1 h，洗滌后加入1∶1 000稀釋后的HRP-3B1A15，37 ℃孵育30 min，洗滌后加入TMB室溫避光顯色10 min，1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行McNemar's χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HRP標(biāo)記EDⅢ蛋白的效價(jià)測(cè)定結(jié)果 以抗西尼羅病毒NS1蛋白特異性單克隆抗體為無(wú)關(guān)對(duì)照，以1-4型登革病毒EDⅢ蛋白特異性單克隆抗體包被聚苯乙烯微孔板，經(jīng)直接ELISA法檢測(cè)HRP分別標(biāo)記的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白效價(jià)(除2型為1∶16 000外)均在1∶512 000以上，說(shuō)明HRP標(biāo)記EDⅢ蛋白具有很好的效價(jià)，可用于作為雙抗原夾心檢測(cè)方法的檢測(cè)抗原。

2.2 雙抗原夾心ELISA法的建立 以不同濃度的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白混合物(濃度比例1∶1∶1∶1)包被聚苯乙烯微孔板，并以不同濃度的HRP標(biāo)記EDⅢ蛋白為檢測(cè)抗原，分別檢測(cè)不同稀釋度的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白免疫小鼠血清標(biāo)本，并以曲霉AF-MP蛋白免疫小鼠血清為陰性對(duì)照。經(jīng)方陣滴度法確定了捕獲抗原的最佳包被濃度為1-4型登革病毒EDⅢ蛋白(濃度比例1∶1∶1∶1混合)0.2 μg/mL, 檢測(cè)抗原的工作濃度為1∶1 000。

2.3 雙抗原夾心ELISA法檢測(cè)動(dòng)物免疫血清的敏感性和特異性 利用所建立的雙抗原夾心ELISA法同時(shí)檢測(cè)梯度稀釋的1-4型登革病毒EDⅢ蛋白免疫小鼠血清和1型登革病毒EDⅢ蛋白免疫兔血清，并以曲霉AF-MP蛋白免疫小鼠和兔血清為陰性對(duì)照，結(jié)果如圖1所示，本研究所建立檢測(cè)方法對(duì)1-4型登革病毒EDⅢ蛋白免疫小鼠血清的檢測(cè)限分別為：DENV1-EDⅢ和DENV4-EDⅢ為1∶3 200；DENV2-EDⅢ和DENV3-EDⅢ為1∶6 400；1-4型登革病毒EDⅢ蛋白混合免疫小鼠血清和DENV1-EDⅢ蛋白免疫兔血清檢測(cè)限分別為1∶25 600和1∶51 200，而與曲霉AF-MP蛋白免疫小鼠和兔血清均無(wú)交叉反應(yīng)。

2.5 雙抗原夾心ELISA法與Panbio MAC ELISA試劑盒的比較 利用所建立的雙抗原夾心ELISA方法和Panbio IgM抗體檢測(cè)試劑盒分別對(duì)實(shí)驗(yàn)室確診的168份登革病毒感染患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并比較兩個(gè)方法的敏感性。結(jié)果如表1所示，2種檢測(cè)方法對(duì)168份確診登革熱患者血清標(biāo)本檢測(cè)的陽(yáng)性率經(jīng)McNemar分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。且吻合率為k=0.817，P=0.000，說(shuō)明兩種診斷方法的吻合率較高。

2.6 雙抗原夾心和雙抗體夾心聯(lián)合檢測(cè)登革病毒感染患者血清 為進(jìn)一步評(píng)價(jià)本方法在不同發(fā)病時(shí)間段的檢測(cè)價(jià)值以便于更好的指導(dǎo)臨床應(yīng)用，我們又平行分析了不同發(fā)病時(shí)間段患者血清中DENV1-NS1蛋白和抗EDⅢ抗體的檢出率。結(jié)果表明，在發(fā)病第1～2 d時(shí)，NS1抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率在94.1%～100%，而抗體完全檢測(cè)不到；在發(fā)病3～8 d，NS1抗原的檢出率為86.7%～100%，在發(fā)病第3 d，血清中抗EDⅢ抗體逐漸被檢測(cè)出來(lái)，且隨著發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)檢出率逐漸增高，在發(fā)病第9 d時(shí)檢出率可達(dá)100%；而兩種檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)時(shí)，標(biāo)本檢測(cè)的陽(yáng)性率可以提升到94.1%～100%(表2)。

表1 雙抗原夾心法與Panbio MAC ELISA檢測(cè)結(jié)果的比較Tab.1 Sensitivity between double-antigen sandwich ELISA and Panbio MAC ELISA for sera from patients with DENV infection

圖1 雙抗原夾心ELISA法檢測(cè)DENV-EDⅢ免疫動(dòng)物血清的靈敏度Fig.1 Detection sensitivity of the double-antigen sandwich ELISA for anti-DENV-EDⅢ serum

表2 3種檢測(cè)方法對(duì)不同發(fā)病時(shí)間登革病毒感染患者血清標(biāo)本檢測(cè)的靈敏性Tab.2 Sensitivity results of three assays in acute sera from patients with confirmed DENV-1 infection at different times

3 討 論

我們?cè)谇捌谝呀?jīng)建立了一套能夠同時(shí)檢測(cè)到4個(gè)血清型登革病毒NS1抗原的檢測(cè)方法[4]，該方法目前已與公司合作實(shí)現(xiàn)試劑盒的產(chǎn)業(yè)化并獲得了醫(yī)療器械生產(chǎn)注冊(cè)證。但我們前期的研究表明同時(shí)聯(lián)合抗原和抗體檢測(cè)方法能夠更好地提高登革病毒感染的檢出率[5]。針對(duì)這一特點(diǎn)及目前用于登革病毒抗體檢測(cè)的商品化試劑盒大部分都是基于間接ELISA法或者IgM的捕獲法，而這兩種檢測(cè)方法在臨床應(yīng)用中普遍認(rèn)為特異性不好，尤其對(duì)于黃熱病毒交替流行疫區(qū)的診斷帶來(lái)諸多不便。而近年來(lái)研究表明，具有雙重識(shí)別機(jī)制的雙抗原夾心抗體檢測(cè)方法明顯比傳統(tǒng)的IgM捕獲法的敏感性和特異性提高了許多。鑒于此，為了提高檢測(cè)方法的特異性，我們?cè)诔晒Ρ磉_(dá)獲得4個(gè)血清型登革病毒EDIII蛋白基礎(chǔ)上，利用4個(gè)血清型登革病毒EDIII蛋白混合包被作為捕獲抗原，以HRP標(biāo)記的4個(gè)血清型登革病毒EDIII蛋白作為檢測(cè)抗原，建立雙抗原夾心抗體捕獲的ELISA檢測(cè)方法，以期解決當(dāng)前MAC-ELISA的特異性問(wèn)題。

由于國(guó)內(nèi)沒(méi)有2、3和4型登革病毒流行，我們?nèi)狈ζ渌?個(gè)血清型登革病毒感染標(biāo)本對(duì)方法學(xué)進(jìn)行評(píng)估。因此，我們使用1-4型登革病毒EDIII蛋白分別免疫小鼠，以各個(gè)血清型EDIII蛋白免疫血清對(duì)檢測(cè)方法的敏感性進(jìn)行評(píng)估。本研究所建立檢測(cè)方法能夠同時(shí)檢測(cè)到4個(gè)血清型登革病毒EDIII蛋白免疫小鼠血清和DENV1EDIII蛋白免疫兔血清，而與曲霉AF-MP蛋白免疫小鼠和兔血清均無(wú)交叉反應(yīng)。此外，我們通過(guò)對(duì)184份健康體檢者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并確定檢測(cè)方法的臨界值。本研究所建立的雙抗原夾心檢測(cè)方法與健康體檢者血清標(biāo)本均無(wú)交叉反應(yīng)，特異度為100%(184/184)，在對(duì)168份確診的登革熱患者血清標(biāo)本的檢出率為57.1%(96/168)，而Panbio MAC ELISA試劑盒的檢出率為57.7%(97/168)，2種檢測(cè)方法結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=1.000。推測(cè)檢測(cè)的敏感性與標(biāo)本采集的時(shí)間有關(guān)，本研究所采集的標(biāo)本均為急性期標(biāo)本，標(biāo)本中抗體含量不高，導(dǎo)致這這兩種檢測(cè)方法的敏感性均不高。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)我們所建立檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用價(jià)值，我們利用前期研制的登革病毒NS1抗原檢測(cè)試劑盒同時(shí)對(duì)該168份登革熱患者血清標(biāo)本進(jìn)行平行檢測(cè)，并分析2種檢測(cè)方法在登革熱診斷方面的價(jià)值。結(jié)果表明，抗原檢測(cè)對(duì)于發(fā)病 7 d 以內(nèi)標(biāo)本檢測(cè)的陽(yáng)性率最高，而抗體檢測(cè)方法對(duì)于發(fā)病 6 d 以內(nèi)標(biāo)本檢測(cè)率不高，但對(duì)于發(fā)病 9 d 以上標(biāo)本檢出率可達(dá)100%。如同時(shí)聯(lián)合抗原抗體兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，可以明顯降低漏診率，其檢測(cè)的總陽(yáng)性率可提高到97.6%，對(duì)于酶聯(lián)檢測(cè)，這完全滿足臨床診斷需求。

綜上，為了進(jìn)一步提高登革熱臨床診斷的準(zhǔn)確性，本研究通過(guò)改變傳統(tǒng)的IgM捕獲法或間接法檢測(cè)抗體，通過(guò)酵母系統(tǒng)表達(dá)出4個(gè)血清型登革病毒EDⅢ蛋白，并用于建立雙抗原夾心抗體檢測(cè)方法，該方法具有良好的特異性和敏感性，對(duì)發(fā)病 9 d 以后標(biāo)本檢測(cè)的陽(yáng)性率高達(dá)100%。此外，研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合本課題組前期建立的登革病毒NS1抗原檢測(cè)方法可以明顯提高檢測(cè)的陽(yáng)性率和檢測(cè)時(shí)限，為登革熱臨床診斷提供重要依據(jù)。由于抗體的產(chǎn)生一般需要在發(fā)病 3～5 d 才開(kāi)始出現(xiàn)，而本研究發(fā)病8 d 以上的臨床標(biāo)本極少，這也是本研究的不足，為進(jìn)一步對(duì)該方法敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)，后續(xù)我們將收集更多登革熱恢復(fù)期患者血清標(biāo)本對(duì)本文所建立的方法學(xué)做進(jìn)一步評(píng)估。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：丁細(xì)霞，蔡建飄，溫坤，等. 雙抗原夾心ELISA法檢測(cè)登革病毒感染患者血清中的EDⅢ抗體[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(4)：317-321. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.035