PD-1/PD-L1及相關(guān)炎癥因子在細(xì)粒棘球蚴感染致肝損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用

楊晨晨，田居靈，魏 琴，姜 濤

棘球蚴病又稱包蟲病，是由棘球絳蟲的幼蟲引起的人獸共患感染性疾病[1-2]。雖然最初細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus，E.granulosus)的幼蟲(棘球蚴)被認(rèn)為是引起囊型包蟲病(Cystic Echinococcosis，CE)的唯一病原體，但是根據(jù)中間宿主(例如綿羊、馬、牛、豬、駱駝和鹿)的不同，病原體還包括特來皮棘球絳蟲(Echinococcusortleppi，E.ortleppi)、加拿大棘球絳蟲(Echinococcuscanadensis，E.canadensis)等[3-4]。囊型包蟲病具有世界性分布的特點，并且已經(jīng)成為一些地區(qū)的重大公共衛(wèi)生問題。囊型包蟲病在秘魯、智利、阿根廷、巴西、地中海地區(qū)、中亞、中國西部和東非流行，僅在南極洲沒有發(fā)現(xiàn)[5-6]。寄生蟲感染宿主后，其抗原物質(zhì)刺激宿主的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而對寄生蟲進(jìn)行識別、抑制和清除[7]?？辜纳x感染是宿主識別寄生蟲抗原并產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過程，寄生蟲也在通過免疫逃避方式對抗宿主的免疫殺傷作用[8]。

程序性死亡受體-1(programmed cell death receptor 1，PD-1)是表達(dá)于活化的T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞的共刺激分子，PD-1及其配體PD-L1(programmed cell death-Ligand-1,)是一種負(fù)向的共刺激分子，其主要作用是維持T細(xì)胞的自身耐受以及防止免疫反應(yīng)過度，但如果這種負(fù)性調(diào)節(jié)作用占優(yōu)勢就會導(dǎo)致病原的免疫逃逸。PD-1/PD-L1在抗感染免疫中起負(fù)調(diào)節(jié)作用，可抑制或下調(diào)T細(xì)胞的活化和某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生及對病原體的清除能力，增強(qiáng)機(jī)體對病原體的耐受從而促進(jìn)免疫抑制[9]。相關(guān)研究證明，PD-1/PD-L1在細(xì)菌、病毒感染和腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮作用。但目前對于PD-1/PD-L1以及相關(guān)炎癥因子在棘球蚴感染小鼠的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本研究分析PD-1/PD-L1在細(xì)粒棘球蚴感染不同階段小鼠肝臟中的表達(dá)，并分析相關(guān)炎癥因子的水平，探討PD-1/PD-L1信號通路在棘球蚴感染中的作用，為囊型包蟲病臨床治療方案及治療時間的選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 伊紅染液(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，兔抗PD-1(Cell Signaling Technology公司)，兔抗PD-L1(Abcam公司)，流式細(xì)胞術(shù)微球陣列法試劑盒(Cytometric Bead Array，CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit(BD)公司，中性樹膠(北京索萊寶科技有限公司)，蘇木素(合肥麗檢醫(yī)療科技有限公司)。鼓風(fēng)干燥箱(上海MBE，GZX-9070)，超凈工作臺(AIRTECH，SW-CJ-2F)，水平離心機(jī)(上海安亭)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(東京理化， SLI-400)。

1.2 實驗動物及分組 SPF級BALB/c小鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2018-0001，雌雄各半，SPF級，體重18～22 g，動物使用許可證號：SYXK(新)2018-0003，將BALB/c小鼠分為對照組和模型組，每組40只。新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過，倫理審批號：IACUC20170706-01，嚴(yán)格遵循3R原則統(tǒng)一管理。

1.3 動物模型制備 取新鮮自然感染細(xì)粒棘球蚴的羊肝，經(jīng)流水沖洗，75%乙醇消毒肝臟表面。使用一次性醫(yī)用注射器抽取囊內(nèi)原頭蚴，用含雙抗的PBS漂洗3次，計數(shù)備用，按10 000個原頭蚴/只腹腔接種，建立細(xì)粒棘球蚴感染小鼠模型[10]。腹腔接種后2 d、8 d、1個月、3個月、6個月時，行內(nèi)眥靜脈取全血，常溫靜置1 h，分離血清，3 000 r/min離心5 min，存于-80 ℃冰箱待檢。

1.4 HE染色 組織脫水、包埋，切片，經(jīng)4 μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.5 各組小鼠不同時間點肝組織中PD-1/PD-L1的表達(dá) 常規(guī)脫蠟、水化及抗原修復(fù)后孵育一抗PD-1抗體(1∶50)、PD-L1抗體(1∶25)4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育2 h，滴加3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色液，在顯微鏡下觀察，用自來水終止顯色。用蘇木精復(fù)染，返藍(lán)。梯度乙醇脫水，透明。用中性樹膠封片，采圖。

1.6 CBA法檢測小鼠外周血細(xì)胞因子含量 打開凍干的Mouse Soluble Protein Flex Set 標(biāo)準(zhǔn)品，用2 mL Assay Diluent倍比稀釋(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256)重懸標(biāo)準(zhǔn)品，室溫平衡15 min。充分混合稀釋好的捕捉微球，按1∶100稀釋待測的小鼠血清樣品。每個實驗管加入50 μL混合好的捕捉微球，將50 μL稀釋好的梯度標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品管中，將待測血清樣品加入到樣品管中，再分別加入50 μL PE抗體。避光靜置3 h，每管加入1 mL Wash Buffer洗液，充分混勻，200 g離心5 min，棄上清，加入300 μL Wash Buffer洗液，震蕩重懸微球后上機(jī)檢測，用軟件分析數(shù)據(jù)，具體步驟參見試劑盒操作手冊。

2 結(jié) 果

2.1 實驗鼠一般情況 對照組精神良好，體重隨著實驗時間增長而增加，飲食及運(yùn)動佳。模型組2 d、8 d、1個月時小鼠精神狀態(tài)尚可，飲食、運(yùn)動情況未受影響。模型組6個月時小鼠精神尚可，飲食偏少。

2.2 小鼠腹腔情況 模型組1個月時腹部未見膨隆，3個月時小鼠可見腹部出現(xiàn)輕微膨隆。模型組6個月時小鼠可見體型偏瘦，腹部出現(xiàn)明顯膨隆，個體有差異，有些可見膨隆，有些小鼠腹部膨隆已經(jīng)影響到小鼠的正常飲食及運(yùn)動。小鼠感染棘球蚴情況見圖1。

A:對照組；B:模型組2 d；C:模型組8 d；D:模型組1個月；E:模型組3個月；F:模型組6個月圖1 小鼠感染棘球蚴情況Fig.1 Mice infected with Echinococcus granulosus

2.3 小鼠肝臟HE染色結(jié)果 對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞排列整齊。模型組感染2 d、8 d時肝組織鏡下未發(fā)生明顯的改變。1個月時，小鼠肝臟未見明顯病理變化，僅可見少量炎性細(xì)胞浸潤。3個月時，肝組織未見大片明顯壞死，但是可見小部分肝細(xì)胞變性壞死區(qū)域，也可見有巨噬細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞聚集。感染6個月時，肝臟結(jié)構(gòu)被大面積破壞，肝細(xì)胞呈片狀壞死，有大片肝細(xì)胞壞死變性，可見大量炎性細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)浸潤，見圖2。

A：對照組；B：模型組2 d；C：模型組8 d；D：模型組1個月；E：模型組3個月；F：模型組6個月圖2 小鼠肝臟HE染色( ×200)Fig.2 HE staining( ×200) of mouse livers

2.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果 對照組小鼠肝組織PD-1表達(dá)呈陰性，模型組2 d和1個月時PD-1呈陰性表達(dá)，8 d時小鼠肝臟僅可見部分陽性表達(dá)PD-1的細(xì)胞，3個月的模型小鼠肝臟出現(xiàn)明顯陽性細(xì)胞，主要位于肝損傷區(qū)域細(xì)胞，6個月小鼠PD-1的表達(dá)主要集中于肝壞死區(qū)域周圍，可見明顯增多的陽性細(xì)胞存在。隨著感染時間的延長，PD-1表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且均明顯高于對照組。感染各階段PD-1在肝組織中的表達(dá)見圖3。

A：對照組；B：模型組2 d；C：模型組8 d；D：模型組1個月；E：模型組3個月；F：模型組6個月圖3 PD-1在小鼠肝組織中的表達(dá)(免疫組化染色 ×200)Fig.3 Expression of PD-1 in the liver in two groups of mice

對照組小鼠肝組織PD-L1表達(dá)呈陰性，模型組2 d和8 d時均可見大量陽性細(xì)胞表達(dá)，1個月肝臟PD-L1呈低表達(dá)，3個月的模型小鼠肝臟出現(xiàn)較多陽性細(xì)胞，主要位于肝損傷區(qū)域細(xì)胞，6個月小鼠PD-L1的表達(dá)主要集中于肝壞死區(qū)域周圍，可見明顯增多的陽性細(xì)胞存在。在細(xì)粒棘球蚴感染早期，肝臟中PD-L1有一個高表達(dá)，待機(jī)體適應(yīng)了免疫調(diào)控，PD-L1進(jìn)入低表達(dá)時期，隨著感染時間的延長，PD-L1表達(dá)逐漸增強(qiáng)，直到6個月達(dá)高峰，且均明顯高于對照組，見圖4。

A：對照組；B：模型組2d；C：模型組8d；D：模型組1個月；E：模型組3個月；F：模型組6個月圖4 PD-L1在小鼠肝組織中的表達(dá)(免疫組化染色 ×200)Fig.4 Expression of PD-L1 in the liver in two groups of mice

2.5 小鼠細(xì)胞因子血清學(xué)檢查 應(yīng)用CBA試劑盒檢測了血清中IL-6、IL-17A、TNF-α的水平。采用重復(fù)測量方差分析的統(tǒng)計學(xué)方法對細(xì)胞因子水平進(jìn)行分析，球形檢驗P<0.05，不服從球形檢驗，參看多變量檢驗結(jié)果，對于因子，不同的時間IL-6、IL-17A、TNF-α改變不同(P<0.05)，說明在2 d、8 d、1個月、3個月及6個月時，IL-6、IL-17A、TNF-α不同。對于因子和分組，2組對應(yīng)的P<0.05，表明2組間IL-6、IL-17A、TNF-α不同。

模型組小鼠TNF-α在感染2 d時高于對照組(t=15.587,P<0.05)，后開始下降，仍高于對照組，從3個月時TNF-α開始升高，且高于對照組(t=12.430,P<0.05),至6個月時達(dá)高峰(圖5a)。

模型組小鼠血清中IL-17A在感染8 d時高于對照組(t=0.067,P<0.05)，后呈上升趨勢，在1個月、3個月、6個月時均明顯高于對照組(t=3.917、3.257、6.513，P<0.05),至6個月時達(dá)高峰，而對照組在每個時間點時IL-17A沒有明顯變化(圖5b)。

模型組小鼠血清中IL-6在感染2 d開始即高于對照組(t=5.623,P<0.05)，6個月的時候達(dá)高峰，明顯高于對照組(t=5.782，P<0.05)(圖5c)。

圖5 小鼠血清中TNF、IL-17A、IL-6的濃度變化趨勢Fig.5 Changes in the concentrations of TNF, IL-17A and IL-6 in mouse serum

3 討 論

寄生蟲感染宿主后，其抗原物質(zhì)刺激宿主的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而對寄生蟲進(jìn)行識別、抑制和清除。研究寄生蟲與宿主的免疫關(guān)系對理解寄生蟲的繁衍進(jìn)化、致病危害、免疫診斷以及對寄生蟲病的防治都具有深遠(yuǎn)意義[11-12]。

抗原特異性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的有效產(chǎn)生及維持需要2種信號：一是主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)，由肽提供的特異性的抗原信號；二是由抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC)表面共刺激分子提供的共刺激信號。在T細(xì)胞活化的不同時間階段，多種共刺激分子發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。其中負(fù)性共刺激分子包括PD-1/PD-L1/PD-L2、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4)/B7-1等，它們抑制或下調(diào)T細(xì)胞的活化和某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在抗感染免疫中起負(fù)調(diào)節(jié)作用，這些分子在平衡宿主的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，且有利于棘球蚴在機(jī)體內(nèi)的慢性感染和寄生。

PD-1/PD-L1負(fù)性共刺激途徑是研究最早、最深入的負(fù)性共刺激途徑之一。PD-1與PD-L1的結(jié)合導(dǎo)致T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，激活負(fù)調(diào)控，影響T細(xì)胞的正常免疫功能或直接導(dǎo)致T細(xì)胞的程序性凋亡，PD-L1/PD-1信號途徑具有顯著的負(fù)調(diào)控T細(xì)胞活化增殖作用。PD-1/PD-L1通路是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory cells，Treg)發(fā)揮寄生蟲免疫抑制功能的關(guān)鍵因素。病原體進(jìn)入機(jī)體后可誘導(dǎo)PD-1及其配體的表達(dá)上調(diào)。在淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)[13]、幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)[14]、墨西哥利什曼原蟲(Leishmaniamexicana)等的病原體感染中，淋巴細(xì)胞表面均持續(xù)高表達(dá)PD-1，從而抑制淋巴細(xì)胞的增生和細(xì)胞因子的分泌，造成淋巴細(xì)胞的功能損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，用日本血吸蟲兩種不同抗原免疫小鼠后PD-1表達(dá)顯著增高，PD-L1和PD-L2的表達(dá)也較對照組顯著上調(diào)，在日本血吸蟲感染早期(急性期)可能是日本血吸蟲抗原通過干擾素-γ(IFN-γ)上調(diào)PD-L1的表達(dá)而發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。本研究通過建立棘球蚴的感染模型發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠肝組織PD-1、PD-L1表達(dá)均呈陰性，模型組在3個月前PD-1基本呈陰性表達(dá)，3個月時的模型小鼠PD-1出現(xiàn)陽性表達(dá)，主要位于肝損傷甚至壞死區(qū)域周圍，可見明顯增多的陽性細(xì)胞。在細(xì)粒棘球蚴感染早期(2 d開始)，肝臟中PD-L1就有一個高表達(dá)，感染早期負(fù)性共刺激分子在小鼠機(jī)體中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，PD-L1后期進(jìn)入低表達(dá)時期，提示在細(xì)粒棘球絳蟲在宿主體內(nèi)生長過程中，能上調(diào)PD-1、PD-L1的表達(dá)，結(jié)果提示PD-1、PD-L1在感染前期、中期發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，可進(jìn)一步促進(jìn)棘球蚴組織在體內(nèi)迅速生長。本研究觀察不同時間小鼠肝組織中PD-1、PD-L1的表達(dá)，通過HE也觀察到小鼠隨著實驗時間的延長，肝臟結(jié)構(gòu)損壞嚴(yán)重，并隨著感染程度增加，PD-1陽性表達(dá)也逐漸增強(qiáng)，提示細(xì)粒棘球蚴感染時，在PD-1的參與下可導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)的免疫紊亂和免疫損傷作用，加重感染進(jìn)程和慢性化的發(fā)展，與其他研究者結(jié)果相一致[15]。

另外，細(xì)粒棘球蚴病發(fā)展成為慢性感染過程中涉及多種免疫細(xì)胞和信號分子的參與。本次研究比較了棘球蚴感染小鼠和正常小鼠血清中不同炎癥因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴感染后，細(xì)胞因子IL-6、IL-17A、TNF-α高表達(dá)，特別是各細(xì)胞因子隨時間增長濃度上升，這是發(fā)生免疫損傷的原因。棘球蚴感染后，小鼠血清中IL-17A的表達(dá)有增高趨勢，提示小鼠感染棘球蚴后發(fā)生一定程度的炎癥反應(yīng)。IL-6水平可作為提示病變嚴(yán)重程度指標(biāo)之一。細(xì)粒棘球蚴感染小鼠后IL-6水明顯升高，可能是棘球蚴釋放出的抗原刺激T細(xì)胞活化并釋放IL-6的結(jié)果。提示IL-6含量升高可能參與機(jī)體的抗蟲過程，表明慢性感染階段炎癥因子水平明顯升高，機(jī)體對蟲體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，可能有助于抑制蟲體發(fā)育。模型組小鼠的TNF-α在感染2 d時高于對照組，后呈現(xiàn)一個下降趨勢，從3個月開始時TNF-α又開始升高，且高于對照組，至6個月時達(dá)高峰，表明TNF-α在棘球蚴感染宿主后機(jī)體的免疫應(yīng)答全過程中發(fā)揮作用，在達(dá)到峰值之前與棘球蚴的生長趨勢一致。由此可見，IL-6、TNF-α、IL-17A參與了棘球蚴感染并導(dǎo)致了炎癥反應(yīng)。

在細(xì)粒棘球蚴慢性感染宿主過程中，蟲體及相關(guān)分泌代謝產(chǎn)物持續(xù)對宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激，一方面機(jī)體免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生一些相關(guān)炎癥因子對蟲體進(jìn)行殺傷和清除；另一方面蟲體也會誘導(dǎo)機(jī)體分泌多種免疫抑制分子如PD-1/PD-L1來營造局部形成“免疫抑制微環(huán)境”，導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受，從而促進(jìn)蟲體的慢性寄生。本研究對外周血中炎癥相關(guān)因子表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)確有逐步增高趨勢，提示機(jī)體免疫系統(tǒng)存在一定的炎癥反應(yīng)，同時我們對肝組織進(jìn)行免疫組化檢測也發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1的表達(dá)升高，進(jìn)而可能通過抑制T淋巴細(xì)胞的活性和增殖，使得在寄生局部產(chǎn)生一定的免疫抑制，促成免疫逃逸，利于蟲體的持續(xù)寄生生長。

綜上所述，PD-1/PD-L在寄生蟲疾病的演變過程中起作用。在感染早、中期阻斷PD-1/PD-L1信號通路的水平，有助于抗棘球蚴感染，減輕蟲體負(fù)荷，有望成為囊型包蟲病治療的又一靶點。

利益沖突：無

引用本文格式：楊晨晨，田居靈，魏琴，等. PD-1/PD-L1及相關(guān)炎癥因子在細(xì)粒棘球蚴感染致肝損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(4)：297-302. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.034