ANXA2敲除的A549細(xì)胞系的構(gòu)建及其對(duì)H1N1和H9N2流感病毒復(fù)制的影響

劉永寧，馬欣傲，呂思瑩，李 媛，李旭勇，司振書(shū)，郭 晶，李玉保，劉 成

ANXA2是膜聯(lián)蛋白家族中的一員，可以在胞漿、細(xì)胞膜以及細(xì)胞內(nèi)囊泡中存在，也可以出現(xiàn)在細(xì)胞核中[8-9]。主要參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括生物膜形成、調(diào)節(jié)細(xì)胞膜運(yùn)輸、內(nèi)涵體形成和小囊泡集合、胞吐、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白組裝、細(xì)胞凋亡以及炎性應(yīng)答等[10-12]。除此之外，ANXA2還能夠參與多種病毒的入侵、復(fù)制、組裝、出芽以及釋放等生物進(jìn)程[6]。據(jù)報(bào)道，ANXA2還參與流感病毒的入侵及成熟病毒粒子形成階段[7,13]，表明ANXA2在流感病毒感染致病過(guò)程中具有重要意義。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是在細(xì)菌和古細(xì)菌研究中發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)過(guò)改造之后，是目前對(duì)基因組進(jìn)行高效編輯的重要技術(shù)[14-15]，具有操作簡(jiǎn)單、成本低和效率高等優(yōu)點(diǎn)。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的研究與發(fā)展，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種基因敲除細(xì)胞模型的建立中。如Wei等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)篩選出SARS-CoV-2感染的關(guān)鍵宿主因子，包括受體ACE2和蛋白酶Cathepsin l[16]。Park等利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功獲得了ANP32A敲除細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)ANP32A基因的敲除可通過(guò)降低病毒聚合酶活性來(lái)抑制流感病毒的復(fù)制[17]。為研究ANXA2在流感病毒復(fù)制過(guò)程中的功能，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了ANXA2敲除的A549細(xì)胞系，為在細(xì)胞水平上闡述流感病毒的復(fù)制過(guò)程和致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒、細(xì)胞株和質(zhì)粒 人流感病毒毒株A/WSN/1933(H1N1)簡(jiǎn)稱WSN(H1N1)、禽流感病毒毒株A/chicken/Shandong/98/2018(H9N2)簡(jiǎn)稱SD98(H9N2)由本實(shí)驗(yàn)室保存；人胚胎腎細(xì)胞(HEK293T，293T)、人肺腺癌細(xì)胞(A549)、犬腎細(xì)胞(MDCK)由本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買并保存；質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G和LentiCRISPRv2均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張安定教授饋贈(zèng)。

1.1.2 試劑 DMEM及F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶均購(gòu)自Gibco公司；限制性內(nèi)切酶BsmBⅠ與T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購(gòu)自Thermo公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒、基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；TPCK胰酶、聚凝胺(Polybrene)、嘌呤霉素(Puromycin)購(gòu)自Sigma公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自GLPBIO公司；兔抗ANXA2抗體、鼠抗β-actin抗體為Proteintech公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG以及羊抗兔IgG抗體購(gòu)自武漢戴安生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中人的ANXA2全基因序列(Gene ID號(hào)：302)，標(biāo)記出基因編碼區(qū)。選取第3個(gè)外顯子上合適的靶向位點(diǎn)，通過(guò)網(wǎng)站https://zlab.bio/guide-design-resources設(shè)計(jì)3對(duì)sgRNA，并根據(jù)sgRNA靶向區(qū)域設(shè)計(jì)特異性鑒定引物(表1)。設(shè)計(jì)的引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.2 sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將成對(duì)的sgRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈；載體LentiCRISPRv2經(jīng)BsmBⅠ酶切后回收線性化的載體。用T4 DNA連接酶將退火后的sgRNA雙鏈DNA與線性化的LentiCRISPRv2在16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，分別構(gòu)建質(zhì)粒LentiCRISPRv2-ANXA2-sgRNA1 (簡(jiǎn)稱ANXA2-sgRNA1)、LentiCRISPRv2-ANXA2-sgRNA2 (簡(jiǎn)稱ANXA2-sgRNA2)和LentiCRISPRv2-ANXA2-sgRNA3 (簡(jiǎn)稱ANXA2-sgRNA3)。挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序正確后進(jìn)行去內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取。

2012年11月，于揚(yáng)在易觀國(guó)際集團(tuán)第五屆移動(dòng)互聯(lián)網(wǎng)博覽會(huì)首次提出“互聯(lián)網(wǎng)+”理念，他指出：“互聯(lián)網(wǎng)+”公式應(yīng)該是我們所在的行業(yè)目前的產(chǎn)品和服務(wù)，在與我們未來(lái)看到的多屏全網(wǎng)跨平臺(tái)用戶場(chǎng)景結(jié)合之后產(chǎn)生的這樣一種化學(xué)公式[2]。

1.2.3 ANXA2基因敲除A549細(xì)胞株的篩選 將ANXA2-sgRNA1、ANXA2-sgRNA2及ANXA2-sgRNA3分別與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G(比例為：4∶2∶1)共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后收集慢病毒備用。將狀態(tài)良好的A549細(xì)胞接至6孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，接種上述慢病毒，并同時(shí)添加8 μg/mL polybrene。長(zhǎng)滿單層后，用嘌呤霉素進(jìn)行壓力篩選，觀察未接慢病毒的對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔一個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)7～10 d后挑取單克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞系傳代后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ANXA2敲除的A549細(xì)胞株的檢測(cè) 收集單克隆細(xì)胞株，編號(hào)后用基因組提取試劑盒提取細(xì)胞基因組DNA作為模板。用表1中的突變鑒定引物，擴(kuò)增sgRNA靶位點(diǎn)上下游區(qū)間的DNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序及序列比對(duì)，檢測(cè)所獲單克隆細(xì)胞株ANXA2基因的敲除效果。將經(jīng)PCR鑒定為ANXA2基因敲除的單克隆細(xì)胞株(A549-ANXA2-KO)和野生型A549細(xì)胞(A549-WT)接種于6孔細(xì)胞板中，待長(zhǎng)滿后裂解細(xì)胞收集蛋白樣品。用Western-blot方法檢測(cè)ANXA2蛋白的敲除效果。其中目的條帶孵育兔抗ANXA2抗體(1∶2 000)，內(nèi)參用鼠抗β-actin抗體(1∶5 000)，二抗分別用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶5 000)和羊抗鼠IgG抗體(1∶5 000)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)ANXA2是否敲除。

1.2.5 細(xì)胞活力測(cè)定 將A549-ANXA2-KO和A549-WT細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔板(每孔100 μL)，每種細(xì)胞設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；分別在第12、24、36、48、60、72 h向每孔加10 μL CCK-8試劑。孵育1 h后，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定A549-ANXA2-KO和A549-WT細(xì)胞的OD450值，并計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As為A549-ANXA2-KO細(xì)胞孔+CCK-8，Ac為A549-WT細(xì)胞孔+CCK-8，Ab為培養(yǎng)基+CCK-8。

1.2.6 敲除ANXA2對(duì)流感病毒復(fù)制的影響 將A549-ANXA2-KO和A549-WT細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞板，待匯合度達(dá)到80%～90%，用無(wú)菌PBS洗兩遍，同時(shí)接種SD98(H9N2)(感染復(fù)數(shù)MOI為0.1、0.5 μg/mL TPCK胰酶)或WSN(H1N1)毒株(MOI為0.01、0.5 μg/mL TPCK胰酶)，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于12、24、36 h收取上清液，測(cè)定病毒的TCID50，繪制病毒在A549-ANXA2-KO和A549-WT細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 本研究的數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.3.0軟件處理，采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LentiCRISPRv2-ANXA2-sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將退火獲得的sgRNA雙鏈克隆至LentiCRISPRv2載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒ANXA2-sgRNA1、ANXA2-sgRNA2和ANXA2-sgRNA3，并測(cè)序，結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。

加黑部分為sgRNA序列圖1 LentiCRISPRv2-ANXA2-sgRNA重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequencing results for the LentiCRISPRv2-ANXA2-sgRNA recombinant plasmid

2.2 ANXA2敲除A549細(xì)胞株的篩選與鑒定

2.2.1ANXA2基因敲除細(xì)胞的篩選與測(cè)序鑒定 將測(cè)序正確的3個(gè)重組ANXA2-sgRNA質(zhì)粒分別與輔助質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，之后收集慢病毒并感染A549細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素加壓和有限稀釋法篩選出7株可能敲除ANXA2基因的單克隆A549細(xì)胞株，分別提取細(xì)胞的基因組DNA，用表1中的突變鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。結(jié)果顯示，有1株單克隆細(xì)胞株經(jīng)測(cè)序在ANXA2基因第3外顯子位置有1 bp堿基的插入突變(圖2A)，從基因水平表明成功構(gòu)建了ANXA2基因缺失的A549細(xì)胞。

2.2.2 ANXA2敲除細(xì)胞的蛋白水平鑒定 收集A549-ANXA2-KO和A549-WT細(xì)胞的蛋白樣品，經(jīng)Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，A549-WT細(xì)胞中ANXA2蛋白正常表達(dá)，而A549-ANXA2-KO細(xì)胞中ANXA2蛋白未見(jiàn)表達(dá)(圖2B)。表明ANXA2基因的插入突變導(dǎo)致ANXA2閱讀框移碼，使得A549-ANXA2-KO不能表達(dá)ANXA2蛋白。表明本研究成功獲得ANXA2敲除的A549細(xì)胞系。

A. A549-ANXA2-KO細(xì)胞株測(cè)序鑒定結(jié)果；B. Western- blot鑒定A549-ANXA2-KO細(xì)胞株。圖2 ANXA2敲除A549細(xì)胞的鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of ANXA2 knockout A549 cells

2.3 ANXA2敲除對(duì)A549細(xì)胞活力的影響 利用CCK-8檢測(cè)敲除細(xì)胞系的細(xì)胞活力，結(jié)果如圖3所示，A549-ANXA2-KO與A549-WT細(xì)胞活力相當(dāng)，表明在A549細(xì)胞上敲除ANXA2后對(duì)細(xì)胞的活力沒(méi)有影響(t12 h=1.744、t24 h=0.631、t36 h=0.259、t48 h=1.559、t60 h=2.074、t72 h=2.201，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)敲除組與對(duì)照組兩兩對(duì)比，P>0.05)。

圖3 敲除ANXA2對(duì)A549 細(xì)胞活力的影響Fig.3 Viability of ANXA2 knockout A549 cells

2.4 ANXA2敲除對(duì)流感病毒復(fù)制的影響 為了進(jìn)一步探索ANXA2對(duì)流感病毒復(fù)制的影響，我們分別用人流感病毒W(wǎng)SN(H1N1)和禽流感病毒SD98(H9N2)毒株感染A549-ANXA2-KO及A549-WT細(xì)胞，并于感染后第12、24和36 h收集上清進(jìn)行病毒TCID50的測(cè)定。結(jié)果顯示，禽流感病毒SD98(H9N2)在A549-ANXA2-KO細(xì)胞上的復(fù)制滴度較A549-WT細(xì)胞顯著升高約1.2個(gè)logs值(t=13.92，P<0.05)。人流感病毒W(wǎng)SN(H1N1)感染后第24 h在A549-ANXA2-KO細(xì)胞上的復(fù)制滴度較A549-WT細(xì)胞升高約1.05個(gè)logs值(t=3.790，P<0.05)，在第12 h和36 h也有輕微升高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t12h=2.658,P>0.05；t36h=2.752,P>0.05，圖4)。

①P<0.05, ②P<0.01圖4 ANXA2敲除對(duì)流感病毒復(fù)制的影響Fig.4 Effects of ANXA2 knockout on influenza viruses

3 討 論

流感病毒為呼吸道病毒，具有肺組織嗜性。A549細(xì)胞作為人肺癌細(xì)胞是流感病毒作用機(jī)制研究的最佳細(xì)胞模型之一。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了ANXA2敲除的A549細(xì)胞系，并經(jīng)CCK-8分析發(fā)現(xiàn)ANXA2敲除并沒(méi)有影響細(xì)胞活力。將流感病毒分別接種于A549-ANXA2-KO和A549-WT細(xì)胞，結(jié)果ANXA2缺失細(xì)胞的流感病毒滴度高于A549-WT細(xì)胞，表明ANXA2缺失能夠促進(jìn)流感病毒復(fù)制。但該作用在人流感病毒和禽流感病毒上存在一定的差異性。ANXA2敲除后，人流感病毒W(wǎng)SN(H1N1)病毒滴度有所升高，但在感染后第12 h和36 h差異并不顯著；而禽流感病毒SD98(H9N2)感染后的第12、24、36 h，A549-ANXA2-KO細(xì)胞中的病毒滴度均顯著高于A549-WT細(xì)胞。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種動(dòng)物、植物以及微生物的基因編輯中，是目前最有力的基因編輯工具[16-18]。盡管如此，對(duì)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶點(diǎn)特異性問(wèn)題仍存在爭(zhēng)議。隨著研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9技術(shù)在應(yīng)用的過(guò)程中存在一定的脫靶效應(yīng)[19-21]。脫靶效應(yīng)會(huì)引起非特異性的基因編輯，使得后續(xù)的篩選工作更繁瑣，降低整個(gè)研究的可靠性，甚至一定程度上增加了實(shí)際應(yīng)用中的安全隱患[22]。但也有研究表明，CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)問(wèn)題被夸大了[23]。有證據(jù)表明大多數(shù)的Cas9脫靶效應(yīng)是短暫的，并且對(duì)功能的影響很小[24-27]。面對(duì)爭(zhēng)議，研究人員利用轉(zhuǎn)錄組、全基因組測(cè)序等多種方法來(lái)分析Cas9脫靶效應(yīng)究竟有多大的影響，但所用方法都較繁瑣，并且價(jià)格昂貴[28-29]。因此，本研究未進(jìn)行脫靶驗(yàn)證。

Ma Yong等[30]的研究指出ANXA2對(duì)流感病毒復(fù)制具有促進(jìn)作用，這與本研究的結(jié)果存在差異，原因可能是由于研究中所使用技術(shù)路徑的不同以及流感病毒毒株本身的差異造成的。Ma Yong等使用RNA干擾以及過(guò)表達(dá)的方法證明了ANXA2基因?qū)Σ《緩?fù)制的促進(jìn)作用，而本研究是基于CRISPR/Cas9技術(shù)制備的ANXA2基因敲除A549細(xì)胞系來(lái)研究ANXA2對(duì)流感病毒復(fù)制的影響。在過(guò)去，RNA干擾技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)勢(shì)在基因功能缺失型研究中發(fā)揮重要作用，但同時(shí)也存在不能完全敲除、脫靶嚴(yán)重等缺陷[31]。近年來(lái)新興的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、失活效率更高逐漸占據(jù)了主要地位，但同樣也存在脫靶效應(yīng)的爭(zhēng)議。Ma Yong等的研究在RNA干擾技術(shù)之外，還利用過(guò)表達(dá)的方法做了互補(bǔ)試驗(yàn)的驗(yàn)證。本研究中缺乏互補(bǔ)試驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證，因此尚不夠完善。對(duì)于ANXA2在病毒復(fù)制及與宿主相互作用過(guò)程中的功能仍需進(jìn)一步更深入的研究才能闡明。Gabriel G等[32]利用siRNA的方法沉默A549細(xì)胞中內(nèi)源性importin-α的表達(dá)后研究其對(duì)流感病毒復(fù)制的影響，結(jié)果顯示沉默importin-α3能夠抑制H7N7和H1N1亞型流感病毒的復(fù)制，但對(duì)H3N2亞型流感病毒復(fù)制具有促進(jìn)作用，對(duì)H5N1亞型流感病毒復(fù)制的影響不大。Ma Yong等的研究中使用的是高致病性H5N1亞型禽流感病毒株，本研究中用的是低致病性H9N2亞型毒株和PR8病毒株。因此，病毒毒株本身的差異性也可能是導(dǎo)致本研究與Ma Yong等研究結(jié)果不同的原因之一。此外，病原體和宿主的相互作用是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，影響禽流感病毒和人流感病毒與ANXA2相互作用的因素很多，ANXA2是否可能與流感病毒的跨種間傳播有關(guān)還需做進(jìn)一步研究。

ANXA2作為一個(gè)多功能蛋白，在流感病毒感染過(guò)程中，可參與流感病毒的復(fù)制[7]。在流感病毒粒子形成過(guò)程中，被整合進(jìn)入流感病毒粒子[13]。此外，ANXA2還可與流感病毒NS1蛋白相互作用[30]。但ANXA2影響流感病毒復(fù)制的分子機(jī)制還不明確，還需要深入探討。

近年來(lái)，新出現(xiàn)的非人流感病毒感染人的情況不斷報(bào)道，給人類造成了嚴(yán)重威脅。因此，預(yù)防和控制流感病毒的流行具有重要的意義[33-34]。本研究利用當(dāng)前流行的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立了ANXA2敲除的A549細(xì)胞系，并證實(shí)ANXA2能夠抑制流感病毒復(fù)制。本研究為進(jìn)一步闡明ANXA2在流感病毒復(fù)制中的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：劉永寧，馬欣傲，呂思瑩，等. ANXA2敲除的A549細(xì)胞系的構(gòu)建及其對(duì)H1N1和H9N2流感病毒復(fù)制的影響[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(4)：291-296，302. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.039