2型豬鏈球菌cps2D基因敲除株的構(gòu)建及其基本生物學(xué)特性的研究

劉旭苗，王悄悄，林 苗，倪 華，鄭 峰，王怡雯，汪春暉，潘秀珍，曹祥榮

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)屬球菌科、鏈球菌屬、革蘭氏陽性兼性厭氧菌[1-2]。它是一種重要的人獸共患病病原菌，不僅能夠感染豬，嚴(yán)重危害豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，還能夠通過傷口或豬產(chǎn)品感染人[3]，從而引起人患腦膜炎、敗血癥等重要的疾病，嚴(yán)重者可因鏈球菌中毒性休克綜合征致多臟器衰竭而死亡[4]，威脅相關(guān)從業(yè)人員的健康。在1998年和2005年，我國江蘇省和四川省分別暴發(fā)大規(guī)模的S.suis2感染豬和人的疫情，兩次感染人群中分別有14例和38例死亡，病死率高達(dá)62%～81%[5-7]。在S.suis不同血清型中，2型豬鏈球菌(Streptococcussuisserotype 2,S.suis2)致病力最強(qiáng)，臨床檢出率最高[8]。

莢膜多糖(capsular polysaccharides，CPS)是S.suis中公認(rèn)的重要毒力因子[9]，由莢膜多糖基因簇cps編碼，其中包含用以編碼糖基轉(zhuǎn)移酶、CPS聚合酶及CPS合成調(diào)控相關(guān)蛋白的基因[10]。近期有研究顯示，細(xì)菌酪氨酸激酶/磷酸酶信號系統(tǒng)在多個細(xì)菌中廣泛參與CPS的合成調(diào)節(jié)、細(xì)胞分裂、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等多個原核細(xì)胞重要生命過程[11]。實驗室前期對S.suis2中國強(qiáng)毒株05ZYH33cps基因簇分析發(fā)現(xiàn)，SSU05_0565、SSU05_0566 和SSU05_0567 3個基因分別編碼跨膜蛋白Cps2B、酪氨酸激酶Cps2C和酪氨酸磷酸酶Cps2D[12-15]，組成酪氨酸激酶/磷酸酶信號系統(tǒng)，并針對酪氨酸激酶/磷酸酶信號系統(tǒng)開展了相關(guān)研究。

本文采用同源重組的原理構(gòu)建2型豬鏈球菌莢膜多糖基因簇中cps2D基因敲除株(Δcps2D)，對比野毒株與敲除株的基本生物學(xué)特性差異，包括細(xì)菌生長特性、溶血活性、革蘭染色、細(xì)菌鏈長、莢膜形態(tài)等，初步探討該基因?qū)τ诩?xì)菌基本生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及引物S.suis2中國強(qiáng)毒株05ZYH33分離自2005年四川資陽中毒性休克癥病人[12]，實驗室保存；E.coilDH5α購自日本TaKaRa公司；pSET2質(zhì)粒由Daisuke Takamatsu教授惠贈[16]；實驗所用引物由蘇州金唯智公司合成，引物序列見表1。

表1 實驗所用引物Tab.1 Primers used in this study

①:The underlined sequences are homologous recombination sequences.

1.2 主要試劑與儀器 高保真酶PrimeSTAR Max Premix、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、In-Fusion Snap Assembly Master Mix購自日本TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司；TSA、TSB培養(yǎng)基購自美國BD公司；哥倫比亞血平板購自蕪湖歐克生物公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-211C)購自上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 敲除質(zhì)粒pUC19::cps2D的構(gòu)建及驗證 首先設(shè)計擴(kuò)增引物L(fēng)1/L2、R1/R2、Spc1/Spc2(表1)，兩端含有載體或相鄰片段的同源序列。使用高保真酶，以05ZYH33菌株基因組DNA為模板，分別以L1/L2、R1/R2為引物擴(kuò)增cps2D基因上、下游同源臂L片段及R片段，以pSET2質(zhì)粒為模板，Spc1/Spc2為引物擴(kuò)增spcR抗性基因即S片段。使用In-Fusion Snap Assembly Master Mix無縫克隆試劑盒將L、S、R與線性的pUC19載體相連，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化E.coilDH5α感受態(tài)，涂布在AmpR和SpcR雙抗性平板上篩選，挑取陽性克隆組合PCR驗證，驗證正確的重組質(zhì)粒作為敲除質(zhì)粒命名為pUC19::cps2D。

1.4 敲除菌株Δcps2D的構(gòu)建 據(jù)Smith等[17]方法，制備05ZYH33感受態(tài)細(xì)胞。將5 μL敲除質(zhì)粒(2 μg)與50 μL 05ZYH33感受態(tài)混合，冰浴10 min。電轉(zhuǎn)儀參數(shù)為2 000 Ω、25 μF，電轉(zhuǎn)結(jié)束后加入950 μL預(yù)熱的復(fù)蘇液(每100 mL含TSB粉末3 g，酵母提取物2 g，蔗糖10.269 g)，37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，涂布在含SpcR抗性平板上。挑取單克隆菌株，Check In 1/ Check In 2為引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步篩選cps2D候選敲除株。

1.5 敲除菌株Δcps2D的組合PCR及RT-PCR驗證 在cps2D基因上游同源臂L和下游同源臂R的外側(cè)設(shè)計引物命名為Check Out 1/Check Out 2(表1)。提取cps2D候選敲除株和05ZYH33的基因組DNA以及總RNA，將總RNA用DNase I消化后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別以DNA、RNA、cDNA為模板，以Check In 1/ Check In 2、Spc1/Spc2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從轉(zhuǎn)錄水平驗證cps2D候選敲除株，將正確的cps2D基因敲除株命名為Δcps2D，40%終濃度的甘油-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 生長曲線測定 將05ZYH33及Δcps2D甘油菌進(jìn)行活化，在哥倫比亞血平板上劃線純化，生長48 h后挑取3個單菌接種在500 μL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜振蕩培養(yǎng)，使用TSB將菌液濃度調(diào)至OD600值為0.4，1∶50的比例重新轉(zhuǎn)接于1.5 mL TSB(加入10%FBS)，每間隔1 h測量菌液OD600值(每個菌測量3次)至12 h。使用Graphpad Prism 8.0軟件繪制生長曲線。

1.7 菌落形態(tài)及溶血活性觀察 將05ZYH33及Δcps2D甘油菌進(jìn)行活化，在哥倫比亞血平板上劃線純化，生長48 h后挑取單菌接種在TSB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。將菌液進(jìn)行梯度濃度稀釋，取10-6稀釋倍數(shù)的菌液200 μL涂布在哥倫比亞血平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)、大小以及溶血環(huán)大小。

1.8 革蘭染色及細(xì)菌鏈長統(tǒng)計 將05ZYH33及Δcps2D甘油菌進(jìn)行活化，在哥倫比亞血平板上劃線純化，生長48 h后挑取單菌接種在TSB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。次日按1∶50的比例轉(zhuǎn)接，37 ℃靜置培養(yǎng)，將兩個菌液樣本OD600值調(diào)整在0.6，進(jìn)行革蘭染色后置于顯微鏡下觀察拍照。每個菌株隨機(jī)選擇100條細(xì)菌鏈進(jìn)行鏈長統(tǒng)計，SPSS軟件分析兩組數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，t檢驗做統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析。

1.9 透射電子顯微鏡觀察 將05ZYH33及Δcps2D甘油菌進(jìn)行活化，在哥倫比亞血平板上劃線純化，生長48 h后挑取單菌接種在TSB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。次日按1∶50的比例轉(zhuǎn)接，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。3 000 r/min離心15 min收集菌體，1×PBS洗滌菌體兩次，棄去PBS，用2.5%戊二醛重懸菌體，4 ℃過夜固定。固定后用1×PBS漂洗2次，每次10 min。于1%鋨酸中固定2 h后使用丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂618包埋切片，快速用水化的醋酸雙氧鈾/檸檬酸鉛進(jìn)行染色，最后使用JEM-1010透射電鏡于100 kV加速電壓下觀察。使用Imagej軟件統(tǒng)計細(xì)菌細(xì)胞的莢膜厚度，SPSS 25.0軟件分析兩組數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，t檢驗做統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 敲除株Δcps2D的構(gòu)建及驗證 高保真酶PCR分別擴(kuò)增出L片段(1 030 bp)、R片段(1 030 bp)和S片段(1 130 bp)，片段大小均與預(yù)期相符(圖 1A)。對重組載體進(jìn)行組合PCR鑒定(圖 1B)，結(jié)果證明敲除質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pUC19::cps2D。敲除質(zhì)粒pUC19::cps2D電轉(zhuǎn)至05ZYH33感受態(tài)細(xì)胞中后，使用Check In 1/ Check In 2引物對陽性克隆進(jìn)行驗證，Check In引物擴(kuò)增陰性的菌株作為疑似敲除株。共篩選69個克隆，得到26個疑似敲除株，對疑似敲除株進(jìn)行組合PCR驗證，各組引物均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的條帶(圖 1C)。RT-PCR驗證結(jié)果顯示，Δcps2D用Check In引物不能擴(kuò)增出條帶，而Spc1/Spc2則能擴(kuò)增出條帶，與05ZYH33相反，其他引物組合擴(kuò)增出的片段都與預(yù)期相符(圖 1D)。表明在DNA和RNA水平上該基因都已經(jīng)敲除成功，Δcps2D敲除株構(gòu)建成功。

A：M. DNA marker；1. L片段；2. R片段；3. S片段；B：M. DNA marker；1. L1/L2；2. R1/R2；3. Spc1/Spc2； 4. L1/Spc2；5. Spc1/R2；6. L1/R2；C：Combined PCR verification of knockout strain Δcps2D；D：RT-PCR verification of gene knockout Δcps2D圖1 基因敲除株Δcps2D的構(gòu)建及驗證Fig.1 Construction and verification of the knockout strain Δcps2D

2.2 生長曲線繪制 分別將OD600值為0.4的05ZYH33菌株和Δcps2D敲除株菌液接種到新鮮TSB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，每間隔1 h測定OD600值。使用Graphpad Prism 8.0軟件繪制生長曲線(圖2)，從圖中能看到野毒株與敲除株的生長的各個階段，對數(shù)期菌體密度迅速增加，進(jìn)入平臺期后逐漸趨于穩(wěn)定，且略有下降的趨勢。在對數(shù)期內(nèi)，野毒株的菌體密度始終高于敲除株，監(jiān)測至12 h時野毒株已經(jīng)進(jìn)入平臺期，OD600趨于穩(wěn)定，而敲除株生長相對緩慢。實驗獨立重復(fù)3次，每組設(shè)3個平行重復(fù)。

圖2 05ZYH33和Δcps2D生長曲線Fig.2 Growth curve of 05ZYH33 and Δcps2D

2.3 革蘭染色觀察及細(xì)菌鏈長統(tǒng)計 分別制作05ZYH33菌株和Δcps2D敲除株革蘭染色涂片，在油鏡下隨機(jī)選取視野觀察細(xì)菌形狀及鏈長。油鏡下顯示細(xì)菌菌體呈紫色，為革蘭陽性菌，細(xì)菌呈球形，多個菌形成長短不一的鏈狀(圖3A、B)，每個菌株隨機(jī)選取100條鏈統(tǒng)計每鏈細(xì)胞數(shù)，野毒株平均每鏈細(xì)胞數(shù)為(7.90±3.186)個，敲除株平均每鏈細(xì)胞數(shù)為(5.32±1.969)個。以上結(jié)果說明，cps2D缺失導(dǎo)致細(xì)菌鏈長顯著變短(圖3C)。

2.4 細(xì)菌形態(tài)及溶血活性觀察 將05ZYH33與Δcps2D菌液分別梯度稀釋后涂布在哥倫比亞血平板上，觀察其菌落形態(tài)以及溶血情況。野毒株與敲除株均能在平板上形成圓形或橢圓形，灰白色(由中間向四周顏色逐漸變淺)，光滑濕潤的菌落；經(jīng)分析，05ZYH33與Δcps2D菌落周圍菌發(fā)生了溶血，形成β溶血環(huán)，溶血環(huán)直徑大小無顯著差異。

2.5 透射電子顯微鏡觀察 利用透射電子顯微鏡，觀察細(xì)菌的表面莢膜結(jié)構(gòu)。野毒株莢膜結(jié)構(gòu)非常典型，位于細(xì)胞壁外側(cè)，質(zhì)地均勻，電子密度高，且細(xì)胞壁薄而清晰(圖4A)。敲除株細(xì)胞壁外只有極少莢膜成分，電子密度低，在視野中呈透明狀，且敲除菌株細(xì)胞壁不明顯(圖4B)。莢膜厚度統(tǒng)計結(jié)果顯示，05ZYH33莢膜厚度為(0.05±0.007)μm，Δcps2D莢膜厚度為(0.02±0.001)μm，野毒株與敲除株莢膜厚度均有差異(圖4C)。

3 討 論

S.suis2的莢膜多糖(CPS)是目前廣泛認(rèn)可的重要毒力因子，在侵入和感染宿主細(xì)胞的過程中具有非常重要的作用，能夠保護(hù)自身不受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[9]。有研究報道，細(xì)菌酪氨酸激酶/磷酸酶信號系統(tǒng)對于莢膜的合成有非常重要的調(diào)控作用，例如在肺炎鏈球菌中酪氨酸磷酸化信號系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞分裂位點處CPS合成，該系統(tǒng)基因突變會導(dǎo)致細(xì)胞分裂缺陷[18]。無乳鏈球菌中的酪氨酸激酶可參與調(diào)節(jié)莢膜多糖合成與細(xì)菌的粘附能力[19]。實驗室前期針對于S.suis2中國強(qiáng)毒株05ZYH33cps基因簇中的酪氨酸激酶/磷酸酶組分開展了相關(guān)研究。研究發(fā)現(xiàn)，Cps2C為S.suis2中的酪氨酸激酶，且能夠發(fā)生自磷酸化；其編碼基因敲除后細(xì)菌的莢膜變薄，毒力也明顯下降[15]。Cps2B是由cps2B基因編碼的跨膜蛋白，其C末端結(jié)構(gòu)域為酪氨酸激酶的激活結(jié)構(gòu)域，是Cps2C正常發(fā)揮激酶活性所必需的[14]。cps2B基因敲除后細(xì)菌成鏈能力下降，莢膜結(jié)構(gòu)及致病力喪失，在人和豬仔全血中生存力下降[13]。實驗室也針對低分子量酪氨酸磷酸酶(SS-PTP)開展了原核表達(dá)以及基因敲除等相關(guān)研究[14]。

A：05ZYH33透射電子顯微鏡；B：Δcps2D透射電子顯微鏡；C：05ZYH33與Δcps2D莢膜厚度統(tǒng)計；①P<0.01圖4 05ZYH33與Δcps2D透射電子顯微鏡觀察及莢膜厚度統(tǒng)計Fig.4 Transmission electron microscopy observation and capsule thickness statistics of 05ZYH33 and Δcps2D

在實驗室前期工作的基礎(chǔ)上，本文基于同源重組的原理構(gòu)建cps2D基因敲除株。設(shè)計兩端為cps2D上下游同源臂，中間為spcR抗性基因的重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化05ZYH33使其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，將cps2D替換為spcR抗性基因以實現(xiàn)該基因的敲除。組合PCR驗證、RT-PCR驗證結(jié)果證明在DNA以及RNA水平上cps2D基因均已缺失，基因敲除株Δcps2D構(gòu)建成功。對05ZYH33及Δcps2D進(jìn)行基本生物學(xué)特性的研究，包括生長曲線測定、革蘭染色觀察及細(xì)菌鏈長統(tǒng)計、菌落形態(tài)及溶血活性觀察、透射電鏡觀察等。研究結(jié)果顯示，敲除菌株Δcps2D的生長變緩，每鏈細(xì)胞數(shù)顯著減少，而菌落形態(tài)以及溶血活性沒有發(fā)生顯著變化。從透射電鏡的結(jié)果來看，敲除株細(xì)胞壁外電子密度低，莢膜成分明顯減少，莢膜結(jié)構(gòu)稀疏，且細(xì)胞壁也不夠清晰。證明cps2D對于CPS的正常合成具有非常重要的作用。而其他生物學(xué)特性的改變，究其原因可能也與莢膜的變化密切相關(guān)。在肺炎鏈球菌中有報道顯示，酪氨酸激酶能夠通過影響分裂位點處CPS的組裝以及染色體的分離，來影響細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期，該激酶缺失后會導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常[18]。本研究中cps2D基因敲除后，細(xì)菌的生長狀態(tài)發(fā)生變化，生長速率減緩，因此推測Δcps2D生長緩慢可能與其莢膜結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。有文獻(xiàn)報道，鏈球菌的細(xì)胞鏈長度受到肽聚糖、脂磷壁酸和細(xì)胞壁錨定蛋白等因素的影響[20]。Δcps2D的鏈長顯著變短，每鏈細(xì)胞數(shù)減少，05ZYH33每鏈細(xì)胞數(shù)主要集中于5～10個細(xì)胞這一區(qū)間，最長能達(dá)到18個細(xì)胞的，而Δcps2D的每鏈細(xì)胞數(shù)主要集中于0～5個細(xì)胞這一區(qū)間，且沒有超過15個細(xì)胞的長鏈。因此，我們推測Δcps2D鏈長變短也是由于莢膜以及細(xì)胞壁的變化所導(dǎo)致的。課題組正在開展回補株的構(gòu)建、小鼠毒力實驗以及cps2D下游調(diào)控基因的相關(guān)研究，以期進(jìn)一步揭示cps2D在莢膜合成調(diào)控過程中的分子機(jī)制。本研究成功構(gòu)建cps2D的基因敲除株，研究了cps2D的基本生物學(xué)特性，cps2D敲除菌株作為重要的實驗材料，能夠為后續(xù)進(jìn)一步研究酪氨酸磷酸酶組分對于莢膜合成的影響及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：無

引用本文格式：劉旭苗，王悄悄，林苗，等. 2型豬鏈球菌cps2D基因敲除株的構(gòu)建及其基本生物學(xué)特性的研究[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(4)：285-290. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.043