弓形蟲ROP16蛋白在人白血病細胞THP-1表達及對其細胞增殖與凋亡的影響

陳 梅，賈 偉，黨甜甜，潘亞菲，楊寧愛，蘇雅靜，趙志軍

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種原生動物寄生蟲，專性寄生于幾乎所有有核細胞，可引起人獸共患寄生蟲病[1]。該寄生蟲在全球范圍內分布，其中間宿主廣泛且無特異性，被認為是世界上最成功的寄生蟲。弓形蟲入侵宿主的過程中分泌的弓形蟲棒狀體蛋白(ROP16)對于在宿主細胞內入侵和復制起著及其重要的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，ROP16是一種重要的毒力決定因子，入侵宿主細胞后主要定位于宿主細胞核內[3-4]，影響宿主細胞的信號轉導和轉錄激活因子(STAT)信號通路，干擾宿主細胞內信號通路傳導，影響宿主細胞的增殖、分化和凋亡等功能[5-7]。近年來，弓形蟲ROP16蛋白與宿主細胞相互作用的研究逐漸成為熱點，但大多數(shù)研究以體內動物模型和體外細胞實驗為基礎，深入挖掘弓形蟲的致病效應，目的是更好地防治弓形蟲病。對于弓形蟲ROP16蛋白殺傷腫瘤細胞的生物探索尚少，目前關于ROP16誘導腫瘤細胞凋亡的研究僅有少數(shù)，如ROP16蛋白可誘導肝癌細胞 HepG2、小鼠腦神經(jīng)細胞、人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y 細胞發(fā)生凋亡[8-10]，而關于急性單核細胞白血病細胞的研究極少。所以，本研究利用弓形蟲II型(Me49)ROP16蛋白對人急性單核細胞白血病細胞株THP-1生物學行為影響和分子機制進行研究。旨在為開發(fā)靶向、低毒、可控的寄生蟲抗腫瘤生物治療提供候選分子及相應的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 弓形蟲Ⅱ型Me49蟲株為本實驗室保存；THP-1細胞購于上海名勁生物科技有限公司，起始來源 ATCC、熒光標記的ROP16過表達慢病毒及其對照組購自漢恒生物公司；胎牛血清與RPMI-1640 培養(yǎng)液購自BI公司；青鏈霉素購于北京索萊寶公司。嘌呤霉素購于Sigma公司，Trizol試劑購于美國Invitrogen公司, Real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒購于大連 TaKaRa 生物工程公司。His-tag抗體購自Abcam公司；兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3抗體購于ABclonal公司；兔抗人β-actin購自CST公司；HPR 標記山羊抗兔 IgG(IgG-HRP)購自Proteintech公司，CY3標記的羊抗鼠IgG(H+L)購于ABclonal公司；Real Time PCR 所用引物均由上海生工有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將THP-1細胞從液氮中取出后并迅速置于37 ℃溫浴鍋中復蘇，使用含10%FBS的1640 培養(yǎng)液吹打懸浮細胞，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d進行換液，待細胞生長至90%左右時進行傳代，細胞傳代3次后用于后續(xù)實驗。

1.2.2 ROP16過表達穩(wěn)轉細胞系構建 將處于對數(shù)生長期且未分化的THP-1懸浮細胞按5×105/孔接種于96孔板,采用半數(shù)接種法，每孔滴加100 L細胞懸液,設置ROP16過表達組、空載體組和空白對照組，按照使用說明書向96孔板中加入過表達慢病毒(overExp-ROP16)及其空載組慢病毒(overExp-NC)，加入慢病毒體積計算公式為:慢病毒體積=MOI×細胞數(shù)目/病毒滴度，在預實驗中確定過表達 overExp-ROP16 慢病毒最佳 MOI 值為70，overExp-NC空載體慢病毒最佳 MOI 值為 60，放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后補加完全培養(yǎng)液100 μL,每孔補足為200 μL,48 h后離心更換新鮮培養(yǎng)基。感染72 h后觀察細胞熒光表達情況；確定慢病毒轉染成功后，用含嘌呤霉素(濃度為1 μg/mL)的1640完全培養(yǎng)基篩選細胞，每2 d對細胞進行換液，約1周后，至空載體組和過表達組無細胞死亡。獲取穩(wěn)定表達 ROP16的THP-1細胞株進行后續(xù)實驗。

1.2.3 PCR檢測rop16基因在THP-1細胞中的表達 提取各組細胞DNA，以DNA為模板，反應體系為(20 μL): DNA 1 L, 上、下游引物各1 μL，Taq PCR Master Mix 10 μL，無酶水補足。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 細胞免疫熒光檢測ROP16蛋白在THP-1細胞中的定位 待各組細胞達到對數(shù)生長期后，離心吹打成細胞懸液，使用六孔板進行細胞爬片，滴加細胞懸液在玻片上，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察結果。爬片成功后的細胞滴加1 mL 4%多聚甲醛固定15 min,吸棄固定液，PBS洗3遍，每次5 min；固定后的細胞加入0.5% TritonX-100透膜5 min,PBS洗3遍，再用2% BSA 室溫封閉1 h, PBS洗3遍，加入稀釋好的His-tag抗體(1∶200) 4 ℃過夜，PBS洗3遍，再加入CY3標記的山羊抗小鼠IgG(H+L) (1∶800) 室溫避光孵育1 h,用PBS避光洗3遍；再用DAPI室溫避光復染10 min,PBS避光清洗3次，用抗淬滅劑封片，使用相應激發(fā)光，激光共焦顯微鏡下觀察熒光拍照。

1.2.5 CCK-8檢測ROP16蛋白對THP-1細胞的增殖 向96孔板中加入處在對數(shù)期的各組細胞(包括空白組、空載體組、過表達組細胞)，每孔接種3×105個。每組設置3個復孔，計數(shù)好的細胞懸液向96孔板中加入100 μL/孔,并置于37 ℃、5% CO2恒溫濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于0、24、48、72 h時向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液,在繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h后用酶標儀測出各孔在不同時間450 nm處的OD值，依據(jù)檢測的OD值進行細胞增殖統(tǒng)計分析。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的穩(wěn)轉細胞調整細胞密度后制成單細胞懸液，同時設定空白組與空載組，離心，棄上清；用預冷的 PBS 洗滌沉淀后離心，棄上清，用 500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞后加入5 μL Annexin Ⅴ-APC和 10 μL 7-AAD 輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育10 min 后上機進行檢測。

1.2.7 蛋白免疫印跡 Western blot檢測各組細胞中ROP16蛋白的表達以及凋亡相關蛋白表達情況。將各組細胞傳代培養(yǎng)并達到對數(shù)生長期后，提取各組細胞全蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。以20 μg/孔上樣量進行SDS-PAGE電泳,到目的蛋白分開后將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜上，5% BSA封閉2 h,TBST洗3遍后，根據(jù)不同分子量的蛋白分別加入鼠抗人His-tag抗體(1∶1 000)、兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3(1∶5 000)抗體以及β-actin抗體(1∶5 000)置于4 ℃過夜,加入相應種屬的二抗室溫孵育1.5 h，洗膜3遍后進行ECL顯色液顯影，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

1.2.8 Real time PCR檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達水平 采用Trizol法提取空白對照組THP-1細胞、空載體組、過表達組中總RNA，并檢測各組細胞RNA的濃度及純度，TaKaRa反轉錄試劑盒合成cDNA，通過 SYBR Green 熒光定量PCR測定不同細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA水平表達情況。以GAPDH作為內參基因,相對定量使用的方法是2-ΔΔCt。所用引物見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結 果

2.1 過表達ROP16慢病毒轉染結果 將包裝成功的overExp-ROP16 慢病毒和 overExp-NC組慢病毒分別轉染THP-1細胞72 h后熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光表達強烈，待細胞生長到一定數(shù)量使用含嘌呤霉素1640 完全培養(yǎng)基篩選細胞，待1周后，使用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)實驗組視野中90%以上細胞均發(fā)出綠色熒光(圖1)，表明過表達 ROP16細胞株與空載細胞株構建成功。

A、B、C:細胞形態(tài)(透射光，×200)；a、b、c： GFP表達(熒光，×200)圖1 慢病毒轉染THP-1細胞篩選后熒光表達情況Fig.1 Fluorescence expression of lentivirus transduced THP-1 cells after screening

2.2 THP-1細胞中ROP16過表達鑒定 構建的穩(wěn)轉細胞通過PCR電泳鑒定出過表達組細胞中rop16基因的表達(圖2A),Western blot檢測過表達組ROP16蛋白水平較空載體組與空白對照組高表達(t值分別為18.92和18.53，P<0.05)(圖2B)。

圖2 PCR與Western blot檢測 ROP16在THP-1細胞中的表達Fig.2 Expression of ROP16 in THP-1 cells, detected by PCR and western blotting

2.3 ROP16蛋白在THP-1細胞中的定位 為了驗證ROP16蛋白在THP-1細胞中的表達位置，進行了細胞免疫熒光試驗。我們用 DAPI 試劑標記細胞核(藍色熒光)，His-tag抗體標記ROP16(紅色熒光)，過表達陰性對照組與空白細胞組作對照。在共聚焦顯微鏡下，ROP16蛋白聚集在THP-1細胞核中，說明ROP16蛋白在THP-1細胞中表達，且定位于細胞核(圖3)。

圖3 免疫熒光檢測ROP16蛋白在THP-1細胞中的定位(×600)Fig.3 Localization of ROP16 protein in THP-1 cells, detected by immunofluorescence (×600)

2.4 ROP16 對THP-1細胞增殖及凋亡的影響 ROP16轉染THP-1細胞后通過CCK-8檢測細胞的增殖情況，CCK-8的結果提示ROP16使THP-1細胞的增殖能力明顯降低，從24 h開始差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.75、7.49、4.75，P<0.05)(圖4)。流式細胞術檢測到ROP16對THP-1細胞的凋亡率較對照組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(t=29.80，P<0.01)，圖5。

2.5 ROP16對THP-1細胞凋亡相關因子Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達水平的影響 以THP-1正常細胞組為對照，空載體組Bcl-2、Bax、Caspase-3表達水平無顯著變化(t值分別為0.92、0.66、1.80，P均>0.05)；過表達組Bax、Caspase-3 mRNA均呈高表達(t=3.85、28.92，P<0.05),而Bcl-2低表達(t=19.17，P<0.01)(圖6)。表明ROP16蛋白可使THP-1細胞中Bax、Caspase-3基因表達上調，而使Bcl-2表達下調。

①P<0.05;②P<0.01 vs Control group or overExp-NC group；ns P>0.05 vs Control group圖4 CCK-8檢測ROP16對THP-1細胞的增殖影響Fig.4 CCK-8 was used to detect the effect of ROP16 on the proliferation of THP-1 cells

A:流式檢測ROP16對THP-1細胞凋亡的影響；B:THP-1細胞凋亡的半定量分析 ①P<0.01 vs Control group or overExp-NC group圖5 流式細胞術檢測ROP16對THP-1細胞的凋亡影響Fig.5 Effect of ROP16 on THP-1 apoptosis, detected by flow cytometry

A:Bax; B：Caspase-3; C:Bel-20 mRNA ①P<0.05;②P<0.01 vs Control group or overExp-NC group； ns P>0.05 vs Control group圖6 qPCR檢測ROP16對THP-1細胞Bax、Caspase-3、Bcl-2 mRNA表達水平的影響Fig.6 qPCR detection of the effects of ROP16 on the expression of Bax, Caspase-3 and Bcl-2 mRNA in THP-1 cells

2.6 ROP16蛋白對THP-1細胞凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2的影響 ROP16基因過表達載體轉染THP-1細胞后的穩(wěn)轉細胞株進行Western blot檢測，THP-1細胞組(對照組)與過表達陰性組相比Bax、Caspase-3、Bcl-2表達差異無統(tǒng)計學意義(t值分別為0.21、1.62、1.57，P>0.05)，過表達組與對照組相比，Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白高表達(t=33.90、52.48，P均<0.01), Bcl-2、Pro-Caspase-3蛋白呈低表達(t=52.69、23.32，P均<0.01)，見圖7。

①P<0.01 vs Control group or over Exp-NC group圖7 Western blot 檢測ROP16蛋白對THP-1細胞凋亡相關蛋白的影響Fig.7 Effects of ROP16 protein on apoptosis-associated proteins in THP-1 cells, detected by western blotting

3 討 論

寄生蟲抗腫瘤逐漸成為生物治療研究的熱點，而利用寄生蟲蟲體蛋白進行抗腫瘤研究更是未來發(fā)展的方向，用蟲體蛋白靶向治療腫瘤具有高效、低毒又避免了全蟲所帶來的毒性。弓形蟲ROP16是棒狀體分泌的一類具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性蛋白，在弓形蟲速殖子、緩殖子以及子孢子中均有表達，是弓形蟲在宿主細胞侵襲前后分泌的重要的特異性效應分子之一[11]。本研究團隊前期工作發(fā)現(xiàn)，弓形蟲ROP16蛋白具有調節(jié)肺癌腫瘤細胞系A549 生物表型的作用[12-13]。我們在研究弓形蟲與宿主的免疫調控機制過程中也發(fā)現(xiàn)，剛地弓形蟲速殖子裂解液能夠抑制乳腺癌細胞系MDA231和肺癌細胞系A549 細胞的增殖，并且誘導MDA231和A549細胞凋亡，提示弓形蟲速殖子在體外具有顯著的抗腫瘤活性，進一步研究分析發(fā)現(xiàn)，速殖子裂解液中包含的關鍵分子是ROP16蛋白，提示弓形蟲ROP16蛋白可能與抗腫瘤關系密切。

ROP16蛋白是弓形蟲侵入宿主細胞時分泌且釋放到胞質溶膠中，并通過核易位序列迅速轉移到宿主細胞核內發(fā)揮作用[14]。Saeij等[7]發(fā)現(xiàn) ROP16可在10 min內從棒狀體分泌到宿主細胞核，影響宿主細胞的信號轉導和轉錄激活因子(STAT)信號通路，并直接使STAT3和STAT6發(fā)生磷酸化，干擾宿主細胞內信號通路傳導，調控宿主細胞白細胞介素-12(IL-12)的產(chǎn)生，影響宿主細胞的增殖、分化與凋亡等功能。弓形蟲根據(jù)蟲株的毒力水平可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。與Ⅰ型蟲株相比，Ⅱ型蟲株的感染導致巨噬細胞中 IL-12 P40 產(chǎn)生上調，而Ⅰ型和Ⅲ型蟲株則會下調 IL-12的表達[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[13]，在 A549 細胞中，弓形蟲Ⅰ型RH株 ROP16 蛋白具有激活 p-STAT3/6作用，且能使 ARG1 mRNA 的表達上調，IL-12 mRNA 的表達下調，而弓形蟲Ⅱ型ME49 蟲株ROP16蛋白則無激活 p-STAT3/6 作用，但能使 IL-12 mRNA 和 iNOS mRNA 的表達上調。iNOS可催化合成 NO，已有文獻報道NO具有抗腫瘤的作用[15]。因此，本研究采用弓形蟲Ⅱ型(ME49 蟲株)ROP16 蛋白對白血病細胞THP-1進行研究，通過構建過表達ROP16慢病毒載體,轉染THP-1細胞后可觀察到強熒光信號，Western blot與免疫熒光結果顯示ROP16蛋白在THP-1細胞中穩(wěn)定表達且定位于細胞核，為后續(xù)對細胞功能研究提供基礎。

細胞凋亡是由于內外環(huán)境變化以及在基因與信號通路調控下所引起的細胞程序性死亡過程。腫瘤細胞對化療藥物誘導凋亡的敏感性受線粒體中 Bcl-2/Bax 蛋白的比例控制[16]。 Bax與相關蛋白的促凋亡活性因與抗凋亡蛋白Bcl-2形成復合物而受到抑制。當培養(yǎng)的細胞收到死亡信號時，Bax移動到線粒體和其他膜位點并引發(fā)線粒體功能轉變，包括細胞色素c向周圍細胞質的釋放、跨膜電位的喪失和線粒體通透性轉變，導致細胞凋亡。Caspase-3是線粒體細胞凋亡過程中的重要執(zhí)行者，其過表達可加速細胞凋亡進程[17]，當細胞受到外界刺激改變了Bcl-2蛋白家族對凋亡的調控，引發(fā)Caspase-3激活，最終促發(fā)細胞凋亡[18]。本研究探討弓形蟲ROP16蛋白對白血病細胞株THP-1的增殖、凋亡作用及其機制中，CCK-8結果顯示，與對照組相比，過表達ROP16組能夠明顯抑制THP-1細胞的增殖，流式檢測誘導THP-1細胞凋亡。qPCR與Western blot實驗分別從轉錄與翻譯水平解釋ROP16蛋白能上調促凋亡蛋白Bax、C-Caspase-3的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2,從而調控線粒體凋亡途徑誘導THP-1細胞凋亡。綜上所述，弓形蟲Ⅱ型(Me49株)ROP16蛋白能在THP-1細胞中表達并通過入核抑制THP-1細胞增殖并誘導其凋亡，其作用機制可能通過上調促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平降低而引起的，此項研究對未來利用寄生蟲蟲體蛋白治療血液腫瘤(非實體瘤)提供理想生物治療候選分子奠定基礎。

利益沖突：無

引用本文格式：陳梅，賈偉，黨甜甜，等. 弓形蟲ROP16蛋白在人白血病細胞THP-1表達及對其細胞增殖與凋亡的影響[J].中國人獸共患病學報，2022，38(4)：277-284. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.041