沉默信息調(diào)節(jié)因子在姜黃素減輕炎癥反應(yīng)改善壓力性心肌肥厚中的作用

熊鳳梅，劉瑞萍，郭煥利，武冬梅，孫 娜

心肌肥厚是心臟在前負(fù)荷和／或后負(fù)荷超載時(shí)所作出的重塑性反應(yīng)［1］。慢性壓力負(fù)荷增大會(huì)增加心肌壁厚度、纖維化程度和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致心肌順應(yīng)性降低和血流動(dòng)力學(xué)障礙。研究表明，持續(xù)的壓力負(fù)荷增加引起的心肌肥厚是心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是導(dǎo)致心力衰竭的重要原因，并伴有嚴(yán)重的不良事件，如呼吸衰竭和心臟驟停［2］。而鈣穩(wěn)態(tài)失衡、活性氧（reactive oxygen，ROS）堆積、線(xiàn)粒體功能和代謝障礙、纖維化、細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)等在壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚中發(fā)揮重要作用［1］。姜黃素（curcumin，Cur）是從姜科中提取出來(lái)的一種天然植物化合物，由于其具有抗氧化、清除ROS、抗炎、抗腫瘤等多種藥理學(xué)特性［3－5］，近年來(lái)在壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚中的作用也逐漸受到關(guān)注。有研究表明，Cur可以激活mTOR抑制自噬改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚［6］。同時(shí)，Cur還能上調(diào)鈉鈣交換體，改善心臟收縮和舒張功能，抑制壓力性心肌肥厚［7］。結(jié)果表明，Cur在壓力性心肌肥厚中發(fā)揮保護(hù)作用。然而Cur能否通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)改善壓力性心肌肥厚還不清楚，其具體作用機(jī)制也未闡明。沉默信息調(diào)節(jié)因子（silent information regulator，SIR）屬于NAD＋依賴(lài)的Ⅲ型去乙酰化酶，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在有SIR T1－7亞型［8］。過(guò)去十年間，已經(jīng)有大量研究結(jié)果證實(shí)SIRT1信號(hào)在心血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。其中，SIRT1在缺血性心臟病、血管老化、葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控、動(dòng)脈粥樣硬化等方面的作用較為清楚［9－11］。然而，SIRT1在心肌肥厚中的作用研究較少，具體機(jī)制仍有待闡明。同時(shí)，Cur能否調(diào)控心肌肥厚中SIRT1信號(hào)目前還不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬采用主動(dòng)脈縮窄術(shù)（transverse aortic constriction，TAC）構(gòu)建壓力負(fù)荷增大引起的心肌肥厚模型，探討Cur減輕炎癥反應(yīng)改善壓力負(fù)荷引起心肌肥厚的作用及其對(duì)SIRT1信號(hào)的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只8周齡健康C57／BL6雄性小鼠，體質(zhì)量20～25 g；由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購(gòu)買(mǎi)后飼養(yǎng)在溫度為（24±2）℃、濕度為55%～65%的環(huán)境中，12 h光照／黑暗循環(huán)，各組小鼠均可自由獲取食物和水。所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵循西安市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)制定的動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南。

1.2 制備TAC模型以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 用2%異氟烷將小鼠麻醉好后，仰臥位將四肢固定在恒溫板上。按照以往文獻(xiàn)報(bào)道的手術(shù)方法［12］，在第二肋間縱向剪開(kāi)皮膚，并逐層分離肌肉，暴露橫主動(dòng)脈弓，在無(wú)名動(dòng)脈和左頸動(dòng)脈之間預(yù)先穿一根7－0號(hào)絲線(xiàn)，用絲線(xiàn)將一根27號(hào)的針頭和血管結(jié)扎固定，然后將針頭取出并逐層縫合肌肉和皮膚。假手術(shù)組小鼠暴露橫主動(dòng)脈弓并穿線(xiàn)但不結(jié)扎，其他操作和手術(shù)組相同。48只C57／BL6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、TAC組、TAC＋Cur組和TAC＋Cur＋EX527組，每組12只。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道確定Cur灌胃給藥，濃度為150 mg／kg，EX527經(jīng)腹腔注射給藥，濃度為5 mg／kg［13－14］。

1.3 小鼠心臟超聲評(píng)價(jià)心臟功能 用2%異氟烷將C57／BL6小鼠麻醉，并用脫毛膏將待測(cè)小鼠胸前區(qū)的體毛去掉，將小鼠四肢與恒溫平臺(tái)的電極接觸并固定，實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)進(jìn)行心電監(jiān)測(cè)。采用Vevo2100超聲成像系統(tǒng)進(jìn)行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。采用M超在心臟短軸乳頭肌水平記錄心臟功能。用Vevo Lab 3.1軟件測(cè)量各組小鼠超聲數(shù)據(jù)并計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening，LVFS）。

1.4 蘇木素（hematoxylin，HE）染色觀察心肌細(xì)胞橫截面積 術(shù)后6周時(shí)取材，用2%異氟烷麻醉小鼠，頸動(dòng)脈取血，并快速開(kāi)胸取出心臟，在預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）中反復(fù)沖洗。將各組心臟放入相應(yīng)標(biāo)記的盛有4%多聚甲醛離心管中，室溫放置兩天后行石蠟包埋、切片。HE染色步驟：在二甲苯和梯度酒精中將石蠟切片脫蠟復(fù)水；HE染細(xì)胞核；伊紅染細(xì)胞質(zhì)；中性樹(shù)膠封片；用Image J軟件測(cè)量各組心肌細(xì)胞橫截面積。

1.5 Masson染色觀察心臟纖維化 術(shù)后6周時(shí)取材，用2%異氟烷麻醉小鼠，頸動(dòng)脈取血，并快速開(kāi)胸取出心臟，在預(yù)冷的PBS中反復(fù)沖洗。將各組心臟放入相應(yīng)標(biāo)記的盛有4%多聚甲醛離心管中，室溫放置兩天后行石蠟包埋、切片。Masson染色步驟：石蠟切片脫蠟復(fù)水；HE染核；Masson麗春紅酸性復(fù)紅染液復(fù)染；1%磷鉬酸水溶液處理后直接用苯胺藍(lán)染色；酒精和二甲苯透明處理，中性樹(shù)膠封片。Image J軟件測(cè)量各組心臟纖維化面積比例。

1.6 蛋白免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 稱(chēng)取各組小鼠左室50 mg心肌組織，加入RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑提取蛋白；在上清中加入上樣緩沖液，并在96℃金屬浴煮10 min，然后將蛋白樣品分裝并保存在－80℃冰箱；配制十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）凝膠，每孔上樣蛋白量為30μg，電泳1.5 h，恒流240 mA轉(zhuǎn)膜80 min，用5%脫脂奶粉室溫下將聚偏氟乙烯（PVDF）膜封閉1.5 h，并與相應(yīng)的SIRT1、乙?；D(zhuǎn)錄因子（Acetylated transcription factors，Ac－FOXO1）、心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）、白介素（interleukin，IL）－1β、IL－6和磷酸甘油醛脫氫酶（phosphoglyceraldehyde dehydrogenase，GAPDH）抗體4℃孵育過(guò)夜；洗膜緩沖液（tris buffered saline tween，TBST）漂洗3次，每次10 min，室溫孵育二抗2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影，GAPDH為內(nèi)參。用Image Lab軟件進(jìn)行灰度值分析并統(tǒng)計(jì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析（One－way ANOVA），當(dāng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)再運(yùn)用SNK－q檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EX527阻斷Cur對(duì)壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚的保護(hù)作用 Sham組心肌橫截面積為（212.7±7.6）μm，心肌纖維化比例為（1.46±0.5）%，心臟重量／體重比值為（4.94±0.31）；TAC組心肌細(xì)胞橫截面積為（384.3±13.4）μm，心肌纖維化比例為（11.7±1.8）%，心臟重量／體重比值為（7.1±0.57），與Sham組比均明顯增大（P＜0.01）；TAC＋Cur組心肌橫截面積為（226.1±8.9）μm，心肌纖維化比例為（3.4±0.7）%，心臟重量／體重比值為（5.1±0.24），與TAC組比均明顯減?。≒＜0.01）；TAC＋Cur＋EX527組心肌橫截面積為（387.5±15.7）μm，心肌纖維化比例為（12.2±1.3）%，心臟重量／體重比值為（7.08±0.39），與TAC＋Cur組比均明顯增加（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 EX527阻斷姜黃素對(duì)心肌肥厚和纖維化的抑制作用

2.2 EX527阻斷Cur減少壓力負(fù)荷引起的ANP和BNP表達(dá)的作用 免疫印跡結(jié)果顯示，TAC組小鼠心肌ANP和BNP的相對(duì)表達(dá)量為（2.33±0.15）和（2.11±0.1），與Sham組比均明顯增加（P＜0.01）；TAC＋Cur組心肌ANP和BNP的相對(duì)表達(dá)量為（1.23±0.1）和（1.13±0.09），與TAC組比均明顯減少（P＜0.01）；TAC＋Cur＋EX527組心肌ANP和BNP的相對(duì)表達(dá)量為（2.4±0.17）和（2.14±0.13），與TAC＋Cur組比均明顯增加（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 姜黃素降低小鼠心肌組織中ANP和BNP表達(dá)的作用被EX527阻斷

2.3 EX527阻斷Cur改善壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚心臟功能的作用 心臟超聲結(jié)果顯示Sham組LVEF和LVFS值分別為（71±3）%和（40.7±1.3）%；TAC組LVEF和LVFS值分別為（40±1）%和（23.7±0.8）%，與Sham組比均明顯降低（P＜0.01）；TAC＋Cur組LVEF和LVFS值分別為（57±1.5）%和（35.1±1）%，與TAC組比均明顯增加（P＜0.01）；TAC＋Cur＋EX527組LVEF和LVFS值分別為（41±1.8）%和（23.2±0.9）%，與TAC＋Cur組比均明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 EX527阻斷姜黃素改善心肌肥厚心臟功能

2.4 EX527阻斷Cur對(duì)壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚中炎性因子的抑制作用 免疫印跡結(jié)果表明TAC組心肌TNF－α、IL－6和IL－1β的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.93±0.08）、（2.11±0.11）和（1.87±0.07），與Sham組比均明顯增加（P＜0.01）；TAC＋Cur組心肌TNF－α、IL－6和IL－1β的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.08±0.1）、（1.22±0.09）和（1.05±0.08），與TAC組比均明顯減?。≒＜0.01）；TAC＋Cur＋EX527組心肌TNF－α、IL－6和IL－1β的相對(duì)表達(dá)量分別為（2.02±0.12）、（2.15±0.03）和（1.96±0.03），與TAC＋Cur組比均明顯增加（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 EX527阻斷姜黃素對(duì)心肌肥厚中炎性因子表達(dá)的抑制作用

2.5 EX527阻斷Cur對(duì)壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚中SIRT1信號(hào)的激活作用 免疫印跡結(jié)果表明TAC組心肌SIRT1的相對(duì)表達(dá)量為（0.42±0.05），與Sham組比明顯減少（P＜0.01），而其底物Ac－FOXO1的相對(duì)表達(dá)量為（2.05±0.12），與Sham組比明顯增加（P＜0.01）；TAC＋Cur組心肌SIRT1的相對(duì)表達(dá)量為（0.79±0.07），與TAC組比明顯增加（P＜0.01），Ac－FOXO1的相對(duì)表達(dá)量為（1.17±0.09），與TAC組比明顯減少（P＜0.01）；TAC＋Cur＋EX527組心肌SIRT1的相對(duì)表達(dá)量為（0.39±0.04），與TAC＋Cur組比明顯減少（P＜0.01），Ac－FOXO1的相對(duì)表達(dá)量為（2.14±0.08），與TAC＋Cur組比明顯增加（P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

圖5 EX527阻斷姜黃素對(duì)心肌肥厚中SIRT1信號(hào)的調(diào)控作用

3 討 論

壓力性心肌肥厚常見(jiàn)于心肌病、瓣膜病和高血壓［15－17］，診治不及時(shí)會(huì)逐漸進(jìn)展為心力衰竭并嚴(yán)重危害患者生命［18］。Cur是具有多種藥理學(xué)活性的天然化合物，因無(wú)毒副作用，成為治療臨床疾病的潛在藥物。已有證據(jù)表明Cur可通過(guò)調(diào)控鈣穩(wěn)態(tài)、纖維化、自噬、線(xiàn)粒體功能和氧化應(yīng)激在心血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用［19－20］。然而Cur在壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚中的作用機(jī)制并不十分清楚。本研究采用TAC模型模擬壓力性心肌肥厚，首先觀察了Cur在壓力性心肌肥厚中的作用。與以往的報(bào)道一致［6－7］，本研究結(jié)果表明Cur能改善TAC引起的心肌肥厚和心臟功能障礙。同時(shí)，本研究還觀察到SIRT1抑制劑EX527能夠阻斷Cur改善TAC所致心肌肥厚的作用，這提示SIRT1參與Cur改善壓力性心肌肥厚的作用。

炎癥反應(yīng)和纖維化是壓力性心肌肥厚心臟重構(gòu)中常見(jiàn)的病理因素，與左室結(jié)構(gòu)和功能的損傷程度具有一定的相關(guān)性［21］。研究表明TNF－α、IL－6和IL－1β等促炎因子表達(dá)的增加促進(jìn)了壓力性心肌肥厚的形成［22］。而炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)又會(huì)引起細(xì)胞外基質(zhì)聚積，加速心肌纖維化進(jìn)程［23］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cur能減小心肌細(xì)胞橫截面積、心臟／體重比值以及ANP和BNP表達(dá)，并改善心臟功能，同時(shí)抑制纖維化和TNF－α、IL－1β和IL－6表達(dá)，這些結(jié)果說(shuō)明Cur能改善TAC引起的心肌肥厚，并減輕心肌纖維化和炎癥反應(yīng)。然而EX527能阻斷Cur對(duì)TAC引起的心肌肥厚、纖維化和炎癥反應(yīng)的抑制作用，提示SIRT1在壓力性心肌肥厚炎癥反應(yīng)和心肌纖維化的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，同時(shí)，該結(jié)果提示SIRT1可能是Cur改善TAC引起的心肌肥厚的重要作用靶點(diǎn)。

大量研究表明SIRT1在心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、衰老和腫瘤等多種疾病中發(fā)揮重要作用［24－26］。Cur能激活SIRT1減輕心肌梗死引起的纖維化［27］；在糖尿病心肌病中，Cur能通過(guò)SIRT1－FOXO1和磷脂酰肌醇3激酶－蛋白激酶B（PI3KAKT）信號(hào)抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［28］。然而，SIRT1表達(dá)的變化在壓力性心肌肥厚模型中的作用仍不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在TAC引起的壓力性心肌肥厚中，SIRT1表達(dá)降低，其底物FOXO1的乙酰化水平增加。而Cur能上調(diào)SIRT1的表達(dá)，抑制FOXO1的乙?；?。然而，EX527能阻斷Cur對(duì)SIRT1和Ac－FOXO1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。因此，綜合以上這些結(jié)果提示Cur可能通過(guò)調(diào)控SIRT1信號(hào)抑制心肌纖維化和炎癥反應(yīng)減輕壓力性心肌肥厚。

綜上所述，壓力性心肌肥厚作為心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，尋找預(yù)防和治療的方法至關(guān)重要。本研究證實(shí)Cur具有改善壓力性心肌肥厚的作用，其作用與抑制SIRT1活性，減輕炎癥反應(yīng)和纖維化有關(guān)。