實(shí)驗(yàn)室條件下探究二氯異氰尿酸鈉對(duì)偽狂犬病病毒的殺滅效果

黃 忍，陳 明，成 靜，向 磊，劉小兵，梁煥斌，肖 馳

（1.廣東天農(nóng)食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

消毒是豬場(chǎng)重要的生物安全措施之一。豬場(chǎng)常用的消毒方法有物理消毒法、化學(xué)消毒法和生物消毒法等，其中化學(xué)消毒法最為常用[1]?；瘜W(xué)消毒劑的正確選擇和使用是決定豬場(chǎng)消毒效果的關(guān)鍵，同時(shí)化學(xué)消毒劑的價(jià)格也直接影響到豬場(chǎng)的消毒頻次。自2018年8月非洲豬瘟暴發(fā)以來，非洲豬瘟（African swine fever, ASF）給國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]?，F(xiàn)階段還未研發(fā)出安全有效的疫苗和特效藥，生物安全是現(xiàn)階段防控非洲豬瘟最有效的手段[3]。消毒作為生物安全的重要環(huán)節(jié)，起到切斷傳播途徑、消滅非洲豬瘟病毒的關(guān)鍵作用[4]。然而市場(chǎng)上的消毒藥琳瑯滿目，其最終的消毒效果是否能達(dá)到要求，使用多大的劑量才能真正達(dá)到殺滅病毒效果是各大養(yǎng)殖戶和企業(yè)比較困惑的事情?，F(xiàn)階段對(duì)于非洲豬瘟病毒的研究?jī)H限于幾個(gè)科研機(jī)構(gòu)。因此為了了解消毒藥對(duì)非洲豬瘟的殺滅效果，很多集團(tuán)實(shí)驗(yàn)室衍生出了很多評(píng)估方法，如通過細(xì)菌試驗(yàn)和使用其他DNA病毒代替非洲豬瘟進(jìn)行消毒評(píng)估試驗(yàn)等[4]，也能間接說明消毒藥對(duì)非洲豬瘟的殺滅效果。鑒于此，本研究使用同類DNA病毒的偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）替代非洲豬瘟病毒進(jìn)行消毒藥的評(píng)估，以期篩選出有效的消毒劑。同時(shí)我們也對(duì)二氯異氰尿酸鈉在多種條件下的殺毒效果進(jìn)行評(píng)估，為幫助尋找消毒效果好且廉價(jià)的消毒藥提供選擇參考。

1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2021年8月20日至10月28日在夾江天農(nóng)食品有限公司實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2 材料

2.1 毒株

偽狂犬病活疫苗Bartha-K61毒株，購(gòu)自某生物制藥有限公司。

2.2 試劑

過硫酸氫鉀復(fù)合鹽、二氯異氰尿酸鈉（45%，以有效率計(jì)）、氯化鈉，市購(gòu)。

2.3 中和劑

根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]選用4%硫代硫酸鈉生理鹽水。

3 方法

3.1 過硫酸氫鉀復(fù)合鹽溶液、二氯異氰尿酸鈉溶液對(duì)PRV核酸破壞能力的測(cè)定

使用生理鹽水對(duì)偽狂犬病活疫苗進(jìn)行稀釋，同時(shí)配置1∶100、1∶200的過硫酸氫鉀復(fù)合鹽溶液和0.3%的二氯異氰尿酸鈉溶液。在常溫下分別將上述800 μL消毒液和100 μL稀釋后的疫苗液渦旋混勻相互作用30 min、5 min；每個(gè)消毒劑濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)，后加入100 μL中和劑終止反應(yīng)；提取病毒核酸，使用PCR進(jìn)行PRV檢測(cè)。對(duì)照組為800 μL生理鹽水+100 μL偽狂犬病疫苗稀釋液+100 μL中和劑。

3.2 不同濃度二氯異氰尿酸鈉對(duì)PRV核酸破壞能力的測(cè)定

將二氯異氰尿酸鈉配置成終濃度為0.08%、0.1%、0.3%、0.5%的溶液；分別取上述消毒液800 μL和100 μL稀釋后的偽狂犬病疫苗在冷藏（8～10 ℃）條件下作用30 min、10 min、1 min，每個(gè)消毒劑設(shè)置4個(gè)重復(fù)，作用時(shí)間結(jié)束后立即加入100 μL中和劑終止反應(yīng)。提取核酸，使用PCR進(jìn)行PRV檢測(cè)。對(duì)照組為800 μL生理鹽水+100 μL病毒液+100 μL中和劑。

3.3 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在低溫環(huán)境和無有機(jī)物條件下對(duì)PRV核酸的破壞效果

將二氯異氰尿酸鈉配置成終濃度為含10%氯化鈉的0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液。將配置好的消毒液提前放置于低溫（-8～-9 ℃）冰柜中30 min預(yù)冷；同時(shí)將稀釋好的偽狂犬病疫苗和終止液提前放置于8～10 ℃的冰箱中30 min預(yù)冷。取出各預(yù)冷樣品，將800 μL消毒液和100 μL疫苗液混合均勻后，放置在低溫（-8～-9 ℃）冰柜中作用20 min、10 min、5 min、1 min，每個(gè)作用時(shí)間設(shè)置4個(gè)重復(fù)，時(shí)間一到立即加入100 μL終止液終止反應(yīng)，提取病毒核酸，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

3.4 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在高有機(jī)物和低溫條件下對(duì)PRV核酸的破壞效果

3.4.1 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在有血清存在的情況下對(duì)PRV核酸的破壞效果 將配置好的含10%氯化鈉的消毒液提前放置低溫（-8～-9 ℃）冰柜中30 min預(yù)冷；同時(shí)將稀釋好的偽狂犬病疫苗、豬血清和終止液提前放置于8～10 ℃的冰箱中30 min預(yù)冷。在2 mL離心管中同時(shí)加入預(yù)冷后的600 μL消毒液、200 μL豬血清和100 μL病毒液，渦旋、震蕩、離心后在低溫（-8～-9 ℃）冰柜中分別作用20 min、10 min、5 min、1 min，每個(gè)作用時(shí)間設(shè)置4個(gè)重復(fù)，加入100 μL中和劑終止反應(yīng)，提取病毒核酸，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

3.4.2 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在有新鮮糞便存在的情況下對(duì)PRV核酸的破壞效果 將配置好的含10%氯化鈉的消毒液提前放置低溫（-8～-9 ℃）冰柜中30 min預(yù)冷；將稀釋好的偽狂犬病疫苗、豬糞和終止液提前放置于8～10 ℃的冰箱中30 min預(yù)冷。在2 mL離心管中同時(shí)加入預(yù)冷后的800 μL消毒液、1 g豬糞便和100 μL病毒液，渦旋、震蕩、離心后置于低溫（-8～-9 ℃）冰柜中分別作用20 min、10 min、5 min、1 min，每個(gè)作用時(shí)間設(shè)置4個(gè)重復(fù)，加入100 μL終止液終止反應(yīng)，提取病毒核酸，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

4 結(jié)果

4.1 兩種消毒藥對(duì)PRV核酸破壞效果的測(cè)定結(jié)果

從試驗(yàn)結(jié)果看，在相同的條件下，終濃度為0.3%的二氯異氰尿酸鈉溶液對(duì)PRV核酸的破壞作用優(yōu)于過硫酸氫鉀復(fù)合鹽溶液。結(jié)果見表1。

表1 消毒藥與病毒作用后核酸PCR結(jié)果

4.2 不同濃度二氯異氰尿酸鈉對(duì)PRV核酸破壞效果的測(cè)定結(jié)果

由表2可知，0.3%的二氯異氰尿酸鈉溶液與PRV反應(yīng)后，核酸PCR結(jié)果CT值為0，且濃度越高殺滅效果越好，而低于0.3%濃度的二氯異氰尿酸鈉溶液仍能檢測(cè)到CT值。

表2 不同濃度二氯異氰尿酸鈉溶液與病毒作用后核酸PCR結(jié)果

4.3 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在無有機(jī)物環(huán)境下與PRV作用核酸PCR結(jié)果

由表3可知，0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在低溫且無有機(jī)物條件下與偽狂犬病疫苗作用1 min，可完全將病毒核酸破壞。

表3 與消毒液作用后PRV核酸PCR結(jié)果

4.4 0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在高有機(jī)物條件下與PRV作用核酸PCR結(jié)果

由表4可知，0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在有20%血清和低溫（-8～-9 ℃）條件下與偽狂犬病疫苗作用20 min可完全將病毒核酸破壞。由表5可知，0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在有1 g糞便和低溫（-8～-9 ℃）條件下與偽狂犬病疫苗作用10 min可完全將病毒核酸破壞。

表4 二氯異氰尿酸鈉溶液、疫苗液和血清三者混合作用下PRV核酸PCR結(jié)果

表5 二氯異氰尿酸鈉溶液、疫苗液和糞便三者混合作用下PRV核酸PCR結(jié)果

5 討論

本試驗(yàn)通過PCR檢測(cè)方法，探討了兩種消毒劑對(duì)PRV核酸的破壞作用，通過試驗(yàn)最終確定了終濃度為0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液對(duì)PRV核酸的破壞作用更強(qiáng)；同時(shí)開展了0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在無有機(jī)物和高有機(jī)物條件下對(duì)病毒核酸破壞效果的試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在無有機(jī)物條件下0.3%二氯異氰尿酸鈉溶液在1 min可完全破壞病毒的核酸，而在有20%血清情況下需要20 min才能完全破壞病毒核酸，在有1 g新鮮糞便情況下需要10 min就能完全破壞病毒核酸。本研究還考慮到了低溫區(qū)域存在冰凍的現(xiàn)象，因此也評(píng)價(jià)了消毒藥在低溫（-8～-9 ℃）條件下對(duì)偽狂犬病核酸的破壞效果。

對(duì)于消毒藥的評(píng)估有多種方法。徐振娜等[6]通過消毒液和H3N2豬流感病毒混合后感染雞胚，并通過雞胚的成活率來判定消毒液的消毒效果。肖琦等[7]將次氯酸分別和等量圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）混合后作用一定時(shí)間，然后感染對(duì)應(yīng)細(xì)胞，通過96孔板細(xì)胞病變來判定次氯酸消毒液的消毒效果。而在大多數(shù)的養(yǎng)豬企業(yè)中，還沒有健全的實(shí)驗(yàn)室，在細(xì)胞培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)等技術(shù)及相關(guān)操作上也不成熟。多數(shù)消毒藥是先作用于病毒核酸外的物質(zhì)，如蛋白和各類酶，最后才作用于病毒的核酸，破壞核酸。反過來思考，一旦病毒的核酸遭到破壞，那么病毒一定是已經(jīng)滅活。本研究就是根據(jù)該思路進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。而且通過核酸來判定病毒是否滅活，對(duì)很多實(shí)驗(yàn)室來說是完全能夠進(jìn)行的。該方法能夠簡(jiǎn)單、直觀地判定病毒的滅活狀態(tài)。

在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，對(duì)于消毒劑的選擇，我們多使用過硫酸氫鉀復(fù)合鹽、濃戊二醛溶液、過氧乙酸和燒堿等。針對(duì)二氯異氰尿酸鈉溶液的使用報(bào)道相對(duì)較少，胡正華等[8]和崔玉杰等[9]探究了二氯異氰尿酸鈉溶液對(duì)水中微生物的殺滅效果，并驗(yàn)證了二氯異氰尿酸鈉溶液具有較好殺菌、消毒效果。本試驗(yàn)不僅驗(yàn)證了二氯異氰尿酸鈉溶液和其他消毒液具有同等的殺病毒效果，還驗(yàn)證了在高有機(jī)物和低溫條件下二氯異氰尿酸鈉溶液還具有較強(qiáng)的破壞病毒核酸效果。