如何保證豬場實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

于新友，李天芝

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.渤海先進(jìn)技術(shù)研究院，山東 濱州 256600）

非洲豬瘟在我國已經(jīng)暴發(fā)近3年零5個(gè)月了，病毒已經(jīng)形成一定的污染面。豬場毒株流行呈現(xiàn)多元化態(tài)勢(shì)，強(qiáng)毒株、天然弱毒變異株、弱毒疫苗株均有報(bào)道。一些新出現(xiàn)流行毒弱毒株甚至可以暫時(shí)與豬共存，與其他豬常見病發(fā)生混感。目前尚無疫苗預(yù)防，也無藥物治療，生物安全是防控非洲豬瘟的最有效方法。當(dāng)前豬場主流的防非措施還是生物安全。然而所有的措施都是靠人去執(zhí)行的，嚴(yán)格的措施是否能落地，要看各豬場的管理水平。

為精準(zhǔn)防控非洲豬瘟，國家鼓勵(lì)豬場實(shí)驗(yàn)室開展非洲豬瘟自檢工作，非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)為豬場實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目[1]。豬場實(shí)驗(yàn)室要遠(yuǎn)離豬場，按要求做好分區(qū)管理，每個(gè)區(qū)域固定專用移液器、槍頭、離心管、工作服等，嚴(yán)禁帶出本區(qū)域[2]。熒光PCR檢測(cè)這個(gè)非洲豬瘟發(fā)生前對(duì)大家陌生的詞匯，迅速成為熱門。很多人被逼半路出家，開展自救檢測(cè)。熒光PCR檢測(cè)是一種技術(shù)含量很高的工作，要想做好并不容易。為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，筆者結(jié)合自身工作對(duì)檢測(cè)環(huán)節(jié)的一些常見問題進(jìn)行總結(jié)，供豬場試驗(yàn)室人員參考。

1 核酸制備方式

一些檢測(cè)單位受條件所限，選擇核酸快提試劑，關(guān)于核酸提取國家無統(tǒng)一明確的規(guī)定。筆者認(rèn)為保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，核酸提取最好采用商品化試劑盒，主要有柱式人工提取或磁珠法自動(dòng)提取，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身?xiàng)l件和樣品數(shù)量選擇。不同廠家的試劑盒核酸提取效果肯定不一樣，價(jià)格差別也很大，要經(jīng)過試驗(yàn)比對(duì)篩選，盡管這樣也不能保證同廠家核酸提取試劑盒每批次的穩(wěn)定性。核酸提取能對(duì)核酸富集和純化，總體效果還是好于免核酸提取法，但也不能一概而論，對(duì)組織或血清樣本應(yīng)該不會(huì)影響最終結(jié)果的判定。以柱式提取法為例，科普一下怎樣從病毒到核酸。一般是200 μL樣品，經(jīng)裂解、掛柱、洗滌、洗脫等幾個(gè)步驟，最終核酸50 μL。柱式法對(duì)試驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)要求高，適合少量樣本的高頻次提取操作，影響因素多。磁珠法機(jī)器操作，自動(dòng)化程度高，適合大量樣本檢測(cè)，但儀器試劑成本高。核酸提取時(shí)動(dòng)作輕柔，可減少氣溶膠的產(chǎn)生，防止樣品間交叉污染。核酸提取后，所有耗材及液體均要置于含消毒液的自封袋中，封口包裝，避免實(shí)驗(yàn)室核酸氣溶膠污染。

2 檢測(cè)試劑盒的選擇

市場上非洲豬瘟熒光PCR檢測(cè)試劑盒品種繁多、魚龍混雜，價(jià)格差別大，有國產(chǎn)的和進(jìn)口的，有合法文號(hào)的和沒有合法文號(hào)的，養(yǎng)殖戶選擇困難。進(jìn)口試劑盒檢測(cè)結(jié)果一般較準(zhǔn)確和可靠，但價(jià)格昂貴，不同豬場實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己經(jīng)費(fèi)情況選擇購買。國產(chǎn)試劑盒生產(chǎn)廠家較多，質(zhì)量差別大，要根據(jù)國家相關(guān)政策要求，選用目前符合國家規(guī)定試劑盒開展非洲豬瘟自檢項(xiàng)目。鑒于些有文號(hào)試劑盒檢測(cè)效果并不理想，購買時(shí)可同業(yè)內(nèi)人員溝通交流，選擇口碑好的生產(chǎn)廠家的試劑盒。任何檢測(cè)試劑盒都有檢測(cè)極限，敏感性和特異性不能兼得，選擇自己能把握的試劑盒。筆者曾試購買某款有文號(hào)產(chǎn)品3盒，敏感性確實(shí)不錯(cuò)，但無論怎么做都不能保證陰性對(duì)照成立。最后查閱大量資料，將其歸結(jié)為探針時(shí)間久，降解后自發(fā)熒光。有些廠家的非洲豬瘟檢測(cè)產(chǎn)品都不止一款，有的多達(dá)七八種，產(chǎn)品質(zhì)量難免參差不齊，亂象叢生。有的廠家為滿足不同的市場需求，開發(fā)不同敏感性產(chǎn)品。豬場實(shí)驗(yàn)室也可以購買多個(gè)廠家試劑盒，用自己檢測(cè)的樣品進(jìn)行驗(yàn)證比對(duì)。新購買試劑盒時(shí)，試劑4 ℃融化，瞬時(shí)離心后，可根據(jù)自己檢驗(yàn)量分裝保存，為保證檢測(cè)效果，試劑盡量減少凍融次數(shù)，首次檢測(cè)前最好先驗(yàn)證陰性對(duì)照和陽性對(duì)照是否成立。

3 儀器和耗材的選擇

市場上儀器價(jià)格差異大，50萬的儀器和2萬的儀器檢測(cè)結(jié)果肯定不一樣，筆者做過相關(guān)研究，僅改變儀器，同一樣本檢測(cè)CT竟然相差10以上，因此，豬場實(shí)驗(yàn)室在經(jīng)費(fèi)允許的情況下，最好購買性能優(yōu)良、質(zhì)量好的熒光PCR儀。為防止氣溶膠污染，熒光PCR反應(yīng)加樣的槍頭應(yīng)選用細(xì)長、帶濾芯的，槍頭要與移液器匹配，防止移液不準(zhǔn)確。PCR反應(yīng)8聯(lián)管可分為透明管和不透明管，0.1 mL和0.2 mL等不同類別，要與所購買的熒光PCR儀相匹配，不同批次的管和蓋不能混用。PCR反應(yīng)管的蓋子一定要緊，否則一旦有陽性樣本擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)液揮發(fā)，會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)。

4 注意操作細(xì)節(jié)

柱式法核酸提取時(shí)，管體標(biāo)記清晰，最后一步，延長離心時(shí)間，去除殘留酒精，防止干擾擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)加樣在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，提前紫外燈照射30 min，物品有規(guī)律擺放，合理分區(qū)，凈區(qū)在左邊，污區(qū)在右邊。廢棄槍頭打入帶蓋10% 84消毒液中，消毒液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，最長使用時(shí)間不要超過3 d。加樣操作時(shí)配戴手套，動(dòng)作輕柔，防止氣溶膠產(chǎn)生及模板吸入加樣器內(nèi)。加樣時(shí)遵循從低濃度到高濃度的順序，先加陰性對(duì)照，再加檢測(cè)樣品，最后加陽性對(duì)照。PCR反應(yīng)管蓋一定要蓋緊，避免熒光物質(zhì)外漏，瞬時(shí)離心混勻，避免氣泡產(chǎn)生。加上后盡快上機(jī)擴(kuò)增，防止探針淬滅[3]。每次試驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，必要時(shí)增加陰性對(duì)照數(shù)量，對(duì)不同操作節(jié)段進(jìn)行監(jiān)控，隨機(jī)放于擴(kuò)增樣品中間，陽性對(duì)照不要用強(qiáng)陽性樣本，尤其不要用強(qiáng)陽性質(zhì)粒作陽性對(duì)照。PCR結(jié)束后PCR產(chǎn)物嚴(yán)禁開蓋，以防氣溶膠污染[4]。檢測(cè)過程中用到的吸頭、離心管、PCR反應(yīng)管及時(shí)清理，嚴(yán)禁高壓滅菌，可放置于10% 84消毒液瓶中，在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。樣品處理過程中用過的廢棄槍頭、離心管等潛在被污染物品，要高壓處理，以防實(shí)驗(yàn)室人為散毒。試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有地面及墻面等進(jìn)行消毒，75%酒精空中噴霧，開啟紫外燈照射4 h以上。

5 弱陽性樣本檢測(cè)問題

檢測(cè)時(shí)經(jīng)常碰到一些弱陽性樣本在對(duì)照成立的情況下，檢測(cè)結(jié)果時(shí)陰時(shí)陽的問題，嚴(yán)重困擾檢測(cè)人員。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因眾多，首先病毒核酸含量低，存在一個(gè)取樣概率問題即所謂的撈現(xiàn)象，核酸如水里的湯圓不是每次都取到，目前主流試劑盒最多核酸加入量不過5 μL。試劑盒研發(fā)敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)為稀釋至一定濃度樣本重復(fù)檢測(cè)20次，有19次檢測(cè)陽性即為最低檢測(cè)線，在其他所有條件都相同的條件下，低濃度樣本時(shí)陰時(shí)陽結(jié)果就可以理解了，但也不能排除實(shí)驗(yàn)室氣溶膠污染。新冠檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求設(shè)置3份陰性對(duì)照，意思是可能存在1份陰性對(duì)照不成立的情況。建議非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)也可以設(shè)置3份陰性對(duì)照。對(duì)于一些專家提到的非洲豬瘟熒光PCR檢測(cè)50個(gè)循環(huán)，起跳即陽的說法筆者不認(rèn)同。某些引物探針擴(kuò)增后期有非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，市面上尚無50個(gè)循環(huán)擴(kuò)增程序的廠家，包括新冠熒光PCR檢測(cè)試劑，原因值得思考。如果按此理論設(shè)定100個(gè)循環(huán)敏感性豈不更好，實(shí)際上每種試劑都有一定的擴(kuò)增能力。

6 小結(jié)

鑒于診斷制品的特殊性，很難制定統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果判定方法，試劑的穩(wěn)定性受到保存運(yùn)輸?shù)确矫嬗绊懞茈y保證檢測(cè)結(jié)果始終一致。試劑盒體系不一樣、程序不一樣、使用儀器不一樣，會(huì)得到不一樣的檢測(cè)結(jié)果。此外，人員也是關(guān)鍵的，需要具備一定的專業(yè)素質(zhì)，要有一定的理論知識(shí)，定期培訓(xùn)和考核，持證上崗[5]，專業(yè)的人干專業(yè)的事，否則出現(xiàn)問題根本不知道如何分析解決，只會(huì)機(jī)械式操作。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件，是否有分區(qū)操作，這些所有的因素都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。