非小細胞肺癌中Cx43蛋白表達水平及其臨床意義

史 冊 張偉華 劉艷梅

肺癌屬于臨床常見惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，肺癌中80%以上屬于非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，早期 NSCLC患者術(shù)后5年總生存率可達86%，然而肺癌早期診斷較為困難，大部分NSCLC確診時已到晚期階段，5年生存率甚至在10%以下[1]?？p隙連接是細胞間信息交換重要通道，縫隙連接細胞間通訊在組織生長、組織器官內(nèi)細胞間協(xié)調(diào)穩(wěn)定維持等諸多方面均具有重要作用[2]?？p隙連接蛋白(connexin,Cx)是由連接蛋白基因編碼的一組蛋白質(zhì)，作為縫隙連接基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)參與細胞生長到死亡全部過程，包括生長、發(fā)育、增殖、分化、代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定維持等[3]。Cx43屬于間隙連接蛋白家族主要成員，主要在心肌組織、成纖維細胞、上皮細胞等中表達，可作為縫隙連接結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)[4]。細胞縫隙連接蛋白的表達水平則提示細胞間通迅功能強弱，如細胞縫隙連接蛋白少則提示該細胞功能較獨立或缺乏信息交通，所以Cx表達異常所致的細胞縫隙連接功能缺陷可能和多種腫瘤惡性增殖與轉(zhuǎn)化相關(guān)[5]?；诖?，本研究分析NSCLC患者癌組織Cx43表達水平，分析其表達與疾病臨床病理、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床的早期診斷、治療及預(yù)后判斷提供分子學(xué)依據(jù)，報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2013年12月至2017年12月收治的NSCLC行手術(shù)治療的患者76例，其中男性42例，女性34例；年齡41～79歲，平均(65.81±6.47)歲；吸煙史：有29例，無47例；病理類型：鱗癌57例，腺癌19例；TNM分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期30例，Ⅲ期27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無42例，有34例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床組織學(xué)或細胞學(xué)確診為NSCLC；②可接受隨訪；③經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位或腫瘤類型；②合并骨髓、血液、免疫疾??；③合并心腦血管疾??；④合并嚴(yán)重感染；⑤近3個月內(nèi)接受過放化療或外科手術(shù)。

1.3 檢測方法

標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片，60 ℃條件烘烤20 min，二甲苯脫蠟后梯度酒精連續(xù)脫水，PBS清洗(3次)，去離子水沖洗，室溫下，3%H2O2阻斷10 min，PBS清洗(3次)，抗原熱修復(fù)，PBS清洗(3次)。浸于10%的BSA中，室溫下孵育5 min，非特異性位點封閉，加一抗，4 ℃孵育，PBS清洗(3次)。滴加HRP標(biāo)記SP，43 ℃孵育30 min，PBS清洗(3次)，DAB顯色 10 min，PBS清洗，蘇木精溶液復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水10 min，封片觀察。

1.4 染色結(jié)果判斷

由兩位病理科醫(yī)師通過光學(xué)顯微鏡分析切片各位點，確定蛋白表達，閱片者均在對研究對象一般資料不了解的前提下獨立閱片和分析，對于判定結(jié)果意見存在分歧的切片，協(xié)商討論達成一致。高倍鏡下選取5個視野，保證每一視野中可觀察到的細胞數(shù)在200個以上，Cx43陽性表達定位于細胞質(zhì)和細胞膜，依陽性細胞染色強度與比例判定Cx43蛋白表達結(jié)果[6]：著色程度：無(0分)，淡黃(1分)，棕黃(2分)，棕褐(3分)；陽性細胞比例：陰性(0分)，1%～25%(1分)，>25%～50%(2分)，>50%～75%(3分)，>75%～100%(4分)；染色分級為著色程度與陽性細胞比例乘積，<6分為低表達，≥6分代表高表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0，計數(shù)資料以例數(shù)與率(%)表示，組間采用χ2檢驗比較；采用Logistic回歸分析影響Cx43蛋白在NSCLC癌組織中的表達水平的因素，通過Kaplain-Maier方法描繪生存曲線，計算Cx43蛋白高表達與低表達患者生存率，并用Log-rank檢驗，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cx43蛋白在NSCLC癌組織中的表達

NSCLC癌組織中Cx43蛋白高表達率為35.53%(27/75)，低于癌旁組織的76.32%(58/76)(χ2=25.649，P<0.05)。

2.2 NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達與臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系

性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理類型與NSCLC患者癌組織中Cx43蛋白表達水平無關(guān)(P>0.05)；低分化、臨床分期Ⅲ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Cx43蛋白高表達率均低于中高分化、臨床分期Ⅰ期或Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見表1。

表1 NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達與臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系/例

2.3 影響NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達的Logistic回歸分析

將上述因素差異有統(tǒng)計學(xué)意義項納入多因素Logistic回歸模型，以Cx43蛋白表達作為因變量，Cx43蛋白(高表達=0，低表達=1)，以上述差異有統(tǒng)計學(xué)意義項作為自變量，并進行賦值，分化程度(高分化=0，中分化=1，低分化=2)、臨床分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(未發(fā)生=0，發(fā)生=1)，Logisitic回歸分析顯示分化程度低、臨床分期高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致Cx43蛋白低表達的獨立危險因素。見表2。

表2 影響NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達的Logistic回歸分析

2.4 NSCLC癌組織中Cx43蛋白表達與生存時間的關(guān)系

隨訪3年，根據(jù)患者隨訪情況，繪制3年無進展生存曲線和總生存曲線，如圖1、圖2。Cx43蛋白高表達者3年無進展生存率與總生存率分別為：66.67%(18/27)、77.78%(21/27)，高于Cx43蛋白低表達者的42.86%(21/49)、51.02%(25/49)(P<0.05)。

圖1 3年無進展生存分析

圖2 3年總生存分析

3 討論

肺癌大多數(shù)起源于支氣管黏膜或腺體，因此又被稱為原發(fā)性支氣管肺癌，是全球發(fā)病率與死亡率相對較高的癌癥類型。肺癌病因較多，包括吸煙、職業(yè)暴露、空氣污染、飲食不良以及遺傳易感性等。近年來，NSCLC發(fā)病率增加，且以老年人群為主，NSCLC癌細胞生長分裂速度較為緩慢，擴散轉(zhuǎn)移一般較晚，因為早期患者癥狀一般不明顯[7]。

相鄰細胞間信息與能量物質(zhì)交換對于細胞新陳代謝、增殖、分化等生理過程均十分重要，該過程主要通過細胞間間隙連接通訊實現(xiàn)[8]。間隙連接通訊結(jié)構(gòu)與功能異常參與多種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。間隙連接普遍存在于動物組織中，位于細胞相鄰面，是相鄰細胞溝通的跨膜通道。目前哺乳動物連接蛋白家族包括 21種跨膜蛋白，依據(jù)家族基因編碼蛋白質(zhì)分子量命名，如Cx26、Cx32、Cx43等[9]。近年來研究表明[10]Cx在大多數(shù)腫瘤細胞中表現(xiàn)為降低甚至缺失，而其周圍毗鄰正常細胞縫隙連接蛋白功能正常，Cx表達上調(diào)或縫隙連接蛋白功能改善可抑制腫瘤發(fā)生或逆轉(zhuǎn)其表型。Cx43屬于抑癌基因，和惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，惡性腫瘤Cx基因抑制，常處于失活狀態(tài)，隨Cx43表達下降和缺失，可導(dǎo)致連接通信功能減退，細胞間信號傳遞、增殖分化受到影響，導(dǎo)致人體內(nèi)環(huán)境紊亂，腫瘤細胞惡性演變[11]。

Liu G等[12]研究發(fā)現(xiàn)，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)誘導(dǎo)Cx 基因表達后可明顯抑制轉(zhuǎn)化細胞生長及腫瘤形成。相關(guān)研究表明，Cx43異常表達與腎臟腫瘤、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮平滑肌肉瘤、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究中NSCLC患者癌組織Cx43高表達率低于癌旁組織，表明Cx43蛋白表達率降低也是NSCLC發(fā)生的原因之一。在腫瘤細胞中，Cx43 表達的降低或缺失使細胞間通訊出現(xiàn)異常，機體對細胞的監(jiān)視與調(diào)控力減弱，細胞過度克隆生長，Cx43表達升高促進間隙連接蛋白組裝，增加細胞間信號交流，控制細胞之間的生長[13]。郭愛萍等[14]研究利用免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，Cx43染色強度及陽性率隨肺癌分化程度下降而呈現(xiàn)出降低趨勢。本研究進一步分析Cx43蛋白表達水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示Cx43蛋白表達水平與鱗癌和腺癌病理類型以及腫瘤大小無相關(guān)性，但與癌組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有一定的關(guān)系，Cx43蛋白表達隨著分化程度降低、臨床分期增高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Cx43在NSCLC癌組織中的表達呈降低趨勢，提示Cx43蛋白可能參與NSCLC的進展。Cx43通過細胞間連接的穩(wěn)定性維持，參與到細胞增殖調(diào)控、凋亡及細胞間信號和刺激傳遞等，使腫瘤細胞重新恢復(fù)細胞連接通訊，達到抑制腫瘤發(fā)展的目的[15]。本研究對76例NSCLC患者3年生存率進行分析，應(yīng)用Kaplan-Meier法分析Cx43蛋白表達水平與NSCLC預(yù)后之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示NSCLC癌組織中Cx43蛋白低表達的患者，其3年總生存率與無進展生存率均低于Cx43蛋白高表達者，說明Cx43蛋白表達水平與NSCLC患者生存時間有關(guān)，Cx43蛋白表達水平可被用作判斷 NSCLC患者預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，Cx43蛋白在NSCLC癌組織中的表達下調(diào)，與NSCLC的發(fā)生及組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，Cx43蛋白表達是NSCLC 患者總生存期的預(yù)后生物分子標(biāo)志物，Cx43蛋白低表達可預(yù)示患者不良預(yù)后。