NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子在犬乳腺腫瘤組織中的表達(dá)

李 妍,藍(lán)婷英,龐 博,楊曉農(nóng),2,黃 堅(jiān),2*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院，成都 610041)

乳腺腫瘤為母犬最常見的腫瘤疾病之一，其惡性特征和不良預(yù)后與炎癥信號(hào)分子的關(guān)系緊密[1]。在乳腺腫瘤發(fā)生的過程中，炎癥相關(guān)免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)可通過釋放和激活炎癥信號(hào)相關(guān)因子促進(jìn)乳腺組織發(fā)生惡變[2]，而這已成為目前臨床抗腫瘤治療的研究靶點(diǎn)之一[3]。隨著研究的深入，一些新的炎癥信號(hào)因子被聚焦，而核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLRP3)炎癥小體是近年來炎性疾病和腫瘤醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，活化后的NLRP3炎癥小體通過控制多級(jí)促炎性細(xì)胞因子(Caspase-1、IL-1β和IL-18)的成熟與分泌來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，誘導(dǎo)組織細(xì)胞的DNA氧化損傷并發(fā)生失控性增殖，促進(jìn)腫瘤的形成和發(fā)展[4]。由于犬乳腺腫瘤臨床特征的多樣性以及疾病背景的差異化，NLRP3炎癥小體作為診斷標(biāo)記的臨床研究數(shù)據(jù)仍然缺乏。因此，本研究將采用RT-qPCR檢測(cè)結(jié)合組織病理學(xué)評(píng)價(jià)的方法，分析NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子的表達(dá)模式以及與犬乳腺腫瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，為其作為潛在的分子診斷靶標(biāo)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本資料

45份犬乳腺腫瘤樣本采自2018年11月—2020年1月在西南民族大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院接受腫瘤切除術(shù)的患犬。同時(shí)，另取16份不重復(fù)的腫瘤旁正常乳腺組織作為對(duì)照。所有犬在手術(shù)前均接受胸部X線檢查(排除可見的肺部轉(zhuǎn)移灶)、腹部超聲檢查(檢查是否有腹內(nèi)轉(zhuǎn)移灶)及相關(guān)術(shù)前評(píng)估。同時(shí)，登記患犬和腫瘤的信息，并在術(shù)后連續(xù)回訪12個(gè)月，記錄病例的預(yù)后情況。無菌采集患犬的乳腺腫瘤組織及部分腫瘤旁正常乳腺組織(辨別標(biāo)準(zhǔn)：眼觀無異常形態(tài)變化，組織病理學(xué)顯示為正常的乳腺組織結(jié)構(gòu))，將樣本無菌剪切為約0.5 cm3大小的組織塊，并用4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行石蠟包埋和組織切片的制作。另外從同一病例中另取約0.3 cm3的組織樣本，經(jīng)液氮速凍后，放入凍存管中，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

Trizol試劑、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ、PrimeScriptTMfirst Strand cDNA合成試劑盒、DNA聚合酶、pMD19-T克隆載體、DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物純化和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；石蠟、二甲苯、乙醇、蘇木素、伊紅染液、4%多聚甲醛及中性樹膠等均為國(guó)產(chǎn)試劑；QuantStudio 3熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI。

1.3 病理組織切片制備和評(píng)價(jià)

將固定完成的組織樣本修整后，用PBS徹底浸洗，然后經(jīng)梯度濃度乙醇脫水后，置入系列二甲苯中透明。將透明好的組織塊充分浸蠟，而后包埋置于室溫冷卻。將獲得的組織蠟塊上機(jī)連續(xù)切片(厚度為4 μm)，并按照HE染色方法進(jìn)行染片和用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。根據(jù)Goldschmidt 等[5]推薦的分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)犬乳腺腫瘤進(jìn)行組織分型和惡性分級(jí)。

1.4 RNA提取和RT-qPCR反應(yīng)

采用Trizol法提取組織中的RNA，按照試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank收錄的基因序列，利用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)RT-qPCR基因檢測(cè)的特異性引物序列，并送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。NLRP3(XM_00843 284.2)，上游引物：5′-GCAACAGTGTGAGGTGAGGCTAC-3′，下游引物：5′-TGCAATGCTCTTGGAGACACAGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為114 bp；Caspase-1(NM_001003125.1)，上游引物：5′-TCCTTCTAGGTGACAGCACCA-3′，下游引物：5′-TTCTGCTCCTCAACCCCACA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為117 bp；IL-1β(NM_001037971.1)，上游引物：5′-CTCCAGGAGGATGACCTGAAGAGC-3′，下游引物：5′-TGTAACTTGCAGTCCACCGATTGC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為125 bp；IL-18(XM_005619483.1)，上游引物：5′-TGGCCTGGAACACTTCTCTGA-3′，下游引物：5′-AGCCTCACTAGAGGTCTGGC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為164 bp；以β-actin(XM_025468289.1)為內(nèi)參基因，上游引物：5′-GCTACAGCTTCACCACCACTGC-3′，下游引物：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為94 bp。將擴(kuò)增得到特異性產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序驗(yàn)證后，克隆轉(zhuǎn)化和構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，將cDNA經(jīng)梯度稀釋后進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，并根據(jù)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。RT-qPCR反應(yīng)體系為TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性2 min：以優(yōu)化后的退火溫度延伸30 s，反應(yīng)結(jié)束后溫度降到60 ℃再以0.15 ℃·s-1升溫至95 ℃，共40個(gè)循環(huán)。采用2—ΔΔCt法，以腫瘤旁正常乳腺(ANMGs)為對(duì)照，對(duì)良性腫瘤(BCMTs)和惡性腫瘤(MCMTs)目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 組織病理學(xué)分型和分級(jí)結(jié)果

對(duì)收集的45份犬乳腺腫瘤樣本進(jìn)行組織病理學(xué)分類，其中15例為良性腫瘤(CBMTs)，30例為惡性腫瘤(CMMTs)。良性腫瘤包括復(fù)合型腺瘤6例、導(dǎo)管型腺瘤4例、肌上皮瘤4例、簡(jiǎn)單型腺瘤1例；惡性腫瘤包括惡性肌上皮瘤10例、混合性癌6例、實(shí)體瘤5例、炎性癌3例、富脂癌2例、管狀癌1例、導(dǎo)管乳頭狀癌1例、微乳頭侵潤(rùn)性癌1例和未分化癌1例。惡性腫瘤中，6例為惡性一級(jí)(占比20%)，12例為惡性二級(jí)(占比40%)，12例為惡性三級(jí)(占比40%)(圖1)。

A.腫瘤旁正常乳腺：小葉增生(小葉內(nèi)腺管增多)；B.良性腺瘤(腺管內(nèi)有分界明顯的立方或柱狀上皮細(xì)胞增殖，細(xì)胞分化良好)；C.混合性癌(惡性一級(jí))(惡性上皮細(xì)胞在乳腺腺管的原位增殖，梭形細(xì)胞散在分布于黏液樣基質(zhì)內(nèi))；D.實(shí)體瘤(惡性二級(jí))(細(xì)胞核深染、細(xì)胞質(zhì)少，細(xì)胞呈實(shí)心樣緊密排列呈無腺管結(jié)構(gòu)的小葉外觀)；E.炎性癌(惡性三級(jí))(皮膚淋巴管內(nèi)有大量的侵潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞)；F.惡性肌上皮瘤(惡性三級(jí))(無腺管結(jié)構(gòu)，大量卵圓形或梭形肌上皮細(xì)胞增殖，細(xì)胞間有黏液樣基質(zhì)散在分布)

2.2 乳腺組織中NLRP3及下游炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄差異分析

目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的凝膠電泳圖結(jié)果顯示，在預(yù)期大小位置獲得清晰的單一擴(kuò)增條帶(圖2)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證均為目標(biāo)基因序列。各目標(biāo)基因擴(kuò)增曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.989，標(biāo)準(zhǔn)曲線可信度高，擴(kuò)增效率相近。所有基因擴(kuò)增的熔解曲線均為單峰，產(chǎn)物特異性高。

A.NLRP3；B.Caspase-1；C.IL-1β；D.IL-18；E.β-actin；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；—.陰性對(duì)照

與對(duì)照組(腫瘤旁正常乳腺，ANMGs)相比，良性乳腺腫瘤和惡性乳腺腫瘤組織中的NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量均存在不同程度的差異(圖3)。其中，惡性腫瘤的NLRP3轉(zhuǎn)錄量要顯著高于對(duì)照組和良性腫瘤組[ANMGs(1.719±1.398)vsCBMTs(2.448±1.737)vsCMMTs(7.747±6.881)](P值分別為0.001和0.006)，而Caspase-1[ANMGs(2.353±2.005)vsCBMTs(4.467±4.646)vsCMMTs(10.150±9.931)](P值分別為0.001和0.048)在組間的表達(dá)結(jié)果與NLRP3的一致。惡性腫瘤和良性腫瘤的IL-1β表達(dá)量要顯著高于對(duì)照組[ANMGs(4.415±9.086)vsCBMTs(36.91±36.67)vsCMMTs(51.65±61.32)](P值分別為0.004和0.002)，而IL-18的轉(zhuǎn)錄量?jī)H在惡性腫瘤和對(duì)照組中存在顯著差異[ANMGs(3.734±4.444)vsCBMTs(9.529 ±14.420)vsCMMTs(14.950±16.850)](P值為0.013)。在30例惡性腫瘤組織中，僅Ⅲ級(jí)的NLRP3的轉(zhuǎn)錄量顯著高于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的表達(dá)量[Grade I(3.079±2.100)vsGrade Ⅱ(5.705±6.313)vsGrade Ⅲ(11.930 ± 6.852)](P值分別為0.008和0.030)，其他因子在各組間均無差異(圖4)。

A.NLRP3; B.Caspase-1; C.IL-1β; D.IL-18.*.P<0.05；**.P<0.01

*.P<0.05

2.3 NLRP3的表達(dá)與犬惡性乳腺腫瘤的臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

以CMMTs 中NLRP3相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)作為分界點(diǎn)將其分為高表達(dá)和低表達(dá)組，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，NLRP3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與腫瘤類型(P=0.029)和惡性等級(jí)(P=0.049)關(guān)系緊密，而與腫瘤大小和手術(shù)預(yù)后指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系，見表1。

表1 NLRP3的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量與犬惡性乳腺腫瘤的臨床病理學(xué)特征關(guān)系

3 討 論

NLRP3炎癥小體作為腫瘤組織微環(huán)境穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，其在腫瘤發(fā)展過程中的異常激活可促成炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大，并進(jìn)一步引起腫瘤細(xì)胞的失控性增殖和轉(zhuǎn)移[3]。本研究首次對(duì)犬乳腺腫瘤中的NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子的表達(dá)模式與腫瘤的臨床病理學(xué)特征關(guān)系進(jìn)行了分析，明確了上述因子在組織腫瘤化和腫瘤惡變時(shí)表達(dá)出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，與部分人類腫瘤的相關(guān)研究結(jié)果一致[6-7]，表明NLRP3炎癥小體及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)失調(diào)是犬乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素。NLRP3和Caspase-1在腫瘤旁正常乳腺組織、良性腫瘤和惡性腫瘤中呈現(xiàn)遞增式表達(dá)上調(diào)，說明這些炎癥因子可能參與促進(jìn)了乳腺組織腫瘤化和惡變過程。此外，下游的IL-1β和IL-18的表達(dá)并未出現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)，這可能與腫瘤中的炎癥反應(yīng)存在多重調(diào)控通路有關(guān)[4]。He等[8]在人宮頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TLR4-NF-κB和NLRP3炎癥小體信號(hào)通路均可介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的IL-1β激活，而Ranson等[9]也證實(shí)NLRP3依賴性和非依賴性激活的IL-1β均可促進(jìn)活動(dòng)性結(jié)腸炎的發(fā)病進(jìn)程。此外，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體也可誘導(dǎo)IL-1β和IL-18可通過旁分泌或自分泌的方式促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[10-12]，綜合這些結(jié)果反映出NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子可通過腫瘤微環(huán)境中的多信號(hào)軸交聯(lián)來介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

根據(jù)Wang 等[7]報(bào)道，NLRP3炎癥小體可促進(jìn)人口腔鱗狀上皮癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而另一份對(duì)人肝癌的臨床調(diào)查結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)肝癌組織中的NLRP3炎癥小體表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，且與臨床分期和病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)[13]，這些不一致的結(jié)果提示，NLRP3炎癥小體在不同腫瘤疾病中可能發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生的作用[14-15]。本研究中，混合性癌和實(shí)體癌的NLRP3炎癥小體顯著高表達(dá)，而其他類型的腫瘤中則多呈現(xiàn)低表達(dá)，提示NLRP3在不同類型的乳腺腫瘤發(fā)展進(jìn)程中的生物學(xué)作用也并不一致。因此，有必要進(jìn)一步研究NLRP3炎癥小體表達(dá)與腫瘤疾病背景的關(guān)系。此外，NLRP3炎癥小體在高惡性等級(jí)乳腺腫瘤中的表達(dá)顯著上調(diào)，說明了NLRP3炎癥小體的高表達(dá)可促成腫瘤的進(jìn)一步惡變。綜上可知，NLRP3炎癥小體與犬乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系緊密，可作為該類疾病臨床評(píng)估和預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

4 結(jié) 論

NLRP3炎癥小體的表達(dá)上調(diào)可能導(dǎo)致犬乳腺組織發(fā)生腫瘤化和腫瘤惡變，是疾病診斷和惡性特征評(píng)估的重要指標(biāo)之一。